Diese Methode wird grundlegend für das Verständnis der Gastrulation entlang einer Formation bei Säugetieren sein. Indem das Experimentieren mit lebenden Embryonen in Embryonalstadien ermöglicht wird, die lange Zeit in der Gebärmutter der Mutter verborgen waren. Es ermöglicht, setzt effizientes und angemessenes Wachstum von Mausembryonen außerhalb der Gebärmutter für einen längeren Zeitraum von bis zu 6 Tagen fort.
Eine schnelle und adäquate Embryonendissektion und Vorgastrulation der Gaskonzentration und des Gasdrucks sind die kritischsten Schritte für ein erfolgreiches Embryonenwachstum. Um mit der Kultivierung von 7,5 Tage alten oder fortgeschritteneren Mausembryonen zu beginnen, schalten Sie den Rotator und die Heizeinheit des Rollkultur-Inkubatorsystems für mindestens 1 Stunde ein, bevor der Embryo seziert wird. Fügen Sie auch Autoklavwasser in die Gaseinlassflasche und das Auslassreagenzglas hinzu.
Als nächstes schalten Sie das Gasreglermodul ein, indem Sie den Hauptschalter drücken, und verwenden Sie dann die entsprechenden Regler, um die Sauerstoff- und Kohlendioxidwerte auf 5% einzustellen Öffnen Sie den Gasregler und bewegen Sie den Spannungsschalter im Druckmessumformer, um den Gasdruck auf etwa 6,5 bis 7 Pfund pro Quadratzoll einzustellen. Bestätigen Sie den Gasdruckwert mit einem digitalen Manometer. Überwachen Sie den Gasfluss, indem Sie die Geschwindigkeit der Blasen überprüfen, die im ausgelassenen, mit Wasser gefüllten Reagenzglas entstehen, das im Präzisionsinkubator zugewiesen ist.
Stellen Sie die richtige Blasenrate ein, indem Sie das Gasdurchflussventil am Deckel der Wasserflasche schließen oder öffnen. Stellen Sie sicher, dass der Gasstrom die Bildung von Blasen mit einer Geschwindigkeit von 2 bis 4 Blasen pro Sekunde ermöglicht, oder stellen Sie den Blasenfluss an der ersten Stelle ein, an der das Blubbern in das mit Wasser gefüllte Auslassrohr austritt. Als nächstes füllen Sie die Kulturflaschen mit 2 Millilitern Kulturmedium.
Verwenden Sie die ausgehöhlten Silikonspäne, um die Flaschen zu versiegeln und stecken Sie sie für 1 Stunde in die ausgehöhlte rotierende Trommel für die Vorwuchtigkeit. Halten Sie die leeren Räume in der rotierenden Trommel mit den massiven Spunden abgedichtet. Als nächstes sezieren Sie die Embryonen einer eingeschläferten schwangeren weiblichen Maus.
Reinigen Sie den Bauch mit 70% Ethanol und schneiden Sie die Haut und die Bauchdecke mit einer Schere ab. Lokalisieren Sie ein Ende der Gebärmutter und schneiden Sie an der Kreuzung zwischen dem Eierstock und der Gebärmutter. Schneiden Sie weiter entlang der Gebärmutter bis zum anderen Ende und übertragen Sie sie in eine 100 Millimeter Petrischale, die mit DPBS gefüllt ist.
Waschen Sie die Conceptuse schnell in DPBS und schneiden Sie sie paarweise, um die Handhabung des Embryos zu erleichtern. Bewegen Sie alle Paare von Konzepten auf ein vorgleiches Dissektionsmedium in einer 60-Millimeter-Petrischale und schneiden Sie sie dann in die einzelnen Begriffe. Als nächstes entfernen Sie mit einer groben Pinzette die Gebärmutterwand der Conceptusse, indem Sie das Gebärmuttergewebe zerreißen, und schneiden Sie dann mit einer feinen, mikrochirurgischen Pinzette die Spitze der birnenförmigen Dezidua ab.
Führen Sie die Pinzette parallel zu seiner langen Achse neben den Embryo ein und öffnen Sie die Pinzette, um die Dezidua in zwei Hälften zu teilen. Greifen Sie schließlich mit einer feinen Pinzette den Embryo aus der Decidua und schälen Sie den Parietal-Eigelbsack vom Embryo, wobei der intakte Ektoplazentakegel am Eizylinder befestigt bleibt. Wählen Sie die Embryonen in der Neuralplatte oder im frühen Kopffaltenstadium, die im Epiblasten keine Schäden zeigen.
5 bis 6 ausgewählte Embryonen pro Flasche in die vorgedrungenen Glaskulturflaschen überführen und die Flaschen bei 37 Grad Celsius in eine Atmosphäre von 5% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid in das rotierende Kultursystem stellen. Um Vorgastrulations- und Frühgastrulationsembryonen und statische Platten zu kultivieren, fügen Sie 250 Mikroliter frisch zubereitetes ex-utero Embryo-Kulturmedium zu jeder Vertiefung einer 8-Well-Platte hinzu. Stellen Sie die Platten bei 37 Grad Celsius in einen Kohlendioxid-Inkubator für die Vorgleichgewichtung.
Nachdem Sie die Embryonen wie zuvor gezeigt aus der Gebärmutter seziert haben, übertragen Sie die einzelnen Embryonen mit einer Mikropipette in jede Vertiefung der 8-Well-Platte und legen Sie die Platte mit 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius in den Inkubator. Stellen Sie sich die Embryonen unter einem Stereomikroskop vor und wählen Sie für die Kultur nur diejenigen mit einer wohlgeformten Fruchthöhle ohne offensichtliche Schäden und ohne reichertsche Membran aus. Die in diesem Protokoll beschriebenen Rollkulturbedingungen für 7,5 Tage alte Embryonen unterstützen ein konstantes und normales Embryowachstum mit einer durchschnittlichen Effizienz von fast 75% nach 4 Kulturtagen.
Die Effizienz der Embryonalentwicklung variiert je nach genetischem Hintergrund der Maus, ist aber durchweg robust. Die Supplementierung mit HBS anstelle von HCS ergibt nach 4 Tagen Kultur einen Wirkungsgrad von ca. 68%. Die Entwicklung von 6,5 Embryonen und statischen Platten wird korrekt mit einer Effizienz von mehr als 90% unter Verwendung von ex-utero Embryo-Kulturmedium mit HCS und HBS rekapituliert.
Kulturen, die von vorgastrulierenden Embryonen ausgehen, zeigen eine Effizienz von 46% der richtigen Entwicklung bis zum frühen Somite-Stadium und fast 17% der Embryonen vervollständigen die richtige Entwicklung nach 6 Tagen Kultur. Die Morphogenese und Gewebeentwicklung verläuft ordnungsgemäß bis zu 42 Somiten. Repräsentative Entwicklungsdefekte, die bei Embryonen für Kulturen beobachtet wurden, die ab dem embryonalen Tag 7.5, 6.5 und 5.5 begonnen wurden, sind hier dargestellt.
Embryonen mit geringer Schädigung des Epiblasten oder Embryonen, die die Reichert-Membran behalten, sollten verworfen werden. Frühe Embryonen wachsen nicht richtig oder zeigen schwere Entwicklungsverzögerungen, während die Anheftung des embryonalen Epiblasten an der Oberfläche der Platte das Versagen der weiteren Embryonalentwicklung verursacht. Die wichtigsten Anomalien, die bei defekten Embryonen beobachtet werden, sind die Entwicklung der hinteren Region außerhalb des Dottersacks oder Defekte im Wachstum der Nervenfalten.
In Kulturen, die aus 5,5 Tagen alten Embryonen entwickelt wurden, werden häufig Entwicklungsdefekte beobachtet, die das Vorhandensein eines kleinen, unterentwickelten Epiblasten sind. Mit dieser Methode sind Forscher in der Lage, eine Vielzahl von physikalischen oder chemischen Manipulationen bei der Entwicklung postimplantierter Embryonen durchzuführen. Zum Beispiel Manipulation, Zelltransplantation oder Abstammungsverfolgung.
Diese Methode ebnet nicht nur den Weg für die detaillierte Untersuchung der Sich entwickelnden Postimplantation von Mäusen, sondern auch für die Implementierung ähnlicher Kulturmethoden in Embryonen anderer Spezies, wie z.B. des Menschen.
