Wir möchten an das Labor von A. Hadjantonakis (Sloan-Kettering-Institut) und dem Labor von L. Niswander (U of Colorado-Denver) für hilfreiche Ratschläge mit Dissektion und Kultur Techniken danken. Diese Arbeit wurde von NRSA NS059562 worden, um JDG und RO1NS05897 MER in Zusammenarbeit mit L. Niswander und J. Nadeau (Institute for Systems Biology) unterstützt.

1. Herstellung von Nährmedien - alle Reagenzien sind in Tabelle 1 aufgelisteten <ol><li> Thaw männlichen Rattenserum bei 37 ° C. </li><li> Heat-Inactivate Rattenserum für 30 min bei 55 ° C </li><li> Centrifuge Rattenserum bei 10K für 5 Minuten bei Raumtemperatur </li><li> Überstand entfernen und mischen 50:50 mit Phenol-rot DMEM w / High Glucose </li><li> Sterilisation der Medien mit einem 0,45 um Spritzenfilter </li><li> Mindestens 1 ml media / Embryos vorbereitet sein sollte </li></ol> 2. Die Isolierung des Uterus von der schwangeren Mutter <ol><li> Unter Verwendung der Verfahren durch die Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigt wurde, wird die schwangere Mutter erste betäubt und dann durch Genickbruch getötet </li><li> Sterilisieren des Bauches mit 70% EtOH </li><li> Pinch einem kleinen Pfad der Haut entlang der Mittellinie, knapp oberhalb der Brustwarzen, mit großen Zangen und den Bauch unter Ihrer Pinzette mit großen Scheren. Achten Sie darauf, keine innere Struktur Schädens </li><li> Verwenden Sie Ihre Schere seitlich abgeschnitten von der ersten Öffnung gegenüber jeder Seite der Maus, so dass das gesamte Abdomen ist offen </li><li> Darm und überschüssige Fettpolster oft obskure der Gebärmutter und diese sollten beiseite verschoben werden, so dass der obere Teil der Gebärmutter und der Eierstöcke auf jeder Seite beobachtet werden können </li><li> Pinch der Spitze der Gebärmutter unter der Eierstöcke und nutzen Sie Ihre Schere in die Gebärmutter aus dem Fett zu trennen, schneiden von einem Ende der Gebärmutter zu den anderen Eierstock </li><li> Heben Sie die Gebärmutter mit einer Pinzette und in eine Petrischale mit Kochsalzlösung </li></ol> 3. Beseitigung von Embryonen aus der Gebärmutter <ol><li> Spülen Sie den Uterus mit Kochsalzlösung, um überschüssiges Blut zu entfernen und schneiden Sie die überschüssige Fett von außen </li><li> Transfer in ein sauberes Geschirrtuch mit Raumtemp. Tyrodes Kochsalzlösung zur Visualisierung verbessern </li><li> Mit einem Stereomikroskop, trennen Sie die einzelnen Embryo entweder mit einer kleinen Schere oder ggf. feinen (# 5) Pinzette vorsichtig schälen die Gebärmutter auseinander. </li> &lt;li&gt; Einfügen feinen Pinzette in den Raum zwischen der Gebärmutterwand und der Dezidua und abziehen der Gebärmutterwand, man aufpassen, nicht zu durchbohren den Embryo </li></ol> 4. Entfernung von decidua aus Embryonen <ol><li> Orient der Decidua, so dass die dunkleren Teil (Plazenta) von Ihnen weg vor </li><li> Machen Sie einen Schnitt mit einer Pinzette an der Trennlinie zwischen den dunklen Teil der Decidua aus dem leichteren Teil, wobei darauf geachtet, nicht zu tief geschnitten </li><li> Vollständige Trennung der Plazenta von der Spitze der Dottersack, darauf achtend, nicht die ectoplacental Kegel (EPC) zu reißen. An diesem Punkt sollten Sie in der Lage sein, die Reicherts Membran auf der Dottersack sichtbar </li><li> Fahren Sie mit dem gesamten decidua (heller Bereich) zu achten, nicht zu durchbohren den Dottersack entfernen </li><li> Gently Prise und entfernen Sie den Reicherts durch Schälen Sie es aus dem EPC. Wenn die EPC ist beschädigt oder getrennt von den Dottersack, wird Embryos nicht normal wiederum von E8.5-E9.5 </li><li&gt; Mit der Reicherts entfernt den Embryo sollte gut sichtbar durch den Dottersack und kann durch Zählen somities inszeniert werden. </li></ol> 5. Einrichten des Kultur-System <ol><li> Schneiden Sie das Ende einer Kunststoff Transferpipette mit einer Schere auf die Durchmesser der Öffnung zu erhöhen, so dass sich ein Embryo ohne Beschädigung der Dottersack pipettiert werden können </li><li> Füllen Sie sauberes Rollerflaschen mit 1 ml Medium pro Embryo. Je nach Art der Rollerflaschen verwendet ein Maximum von 3-6 Embryonen können in jeder Flasche geladen werden. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen mit Ihren Schnitt Pipette an die Medien gefüllt Rollflasche, mit über so wenig wie möglich Tyrodes, um nicht an die Medien zu verdünnen </li><li> Bringen Sie die Gummi-Stecker (Spund) an die Spitze des Glases Rollflasche </li><li> Legen Sie die Rollerflaschen in die Walze Kultur Trommel, so dass eine Abdichtung zwischen dem Stecker und der Trommel bildet </li><li> Wenn alle Flaschen angebracht wurden, und jede leere Slots in der Trommel wurden w versiegeltith Gummistopfen, aktivieren Sie die Walze </li><li> Öffnen CO 2 und O 2-Panzer und stellen Sie sie auf ca. 2 psi, so dass das Auslassventil ist die Freigabe einer Blase pro Sekunde. Für E8.5-E10 Embryonen, sollten 20% O 2 und 5% CO 2 verwendet werden. </li><li> Stellen Sie sicher, dass der Inkubator auf 37 ° C eingestellt und decken oder in der Nähe des Inkubators, so dass die Embryonen von Licht abgeschirmt sind. </li><li> Embryonen sollten regelmäßig überprüft werden, um ihre Entwicklung durch die Zugabe von somities, das Fortschreiten der Drehung, und das Ausmaß der Neuralrohrschlusses bewerten </li><li> Nach 2-3 Stunden in Kultur, kann pharmakologische Inhibitoren oder andere Behandlungen, die Medien hinzugefügt werden </li><li> Das Design der Studie sollte auch kontrolliert, wie Fahrzeug-oder inaktiven Analoga Studie Reagenz. </li></ol> 6. Auswertung der Entwicklung nach ganzen Embryo Kultur <ol><li> Schalten Sie Gas, Anschlagrolle und Entnahme der Flaschen aus Inkubator </li><li> Transfer-Embryonen zurück zur Tyrodes oder PBS in einer Petrischale zur Auswertung unter Stereomikroskop </li><li> Der Dottersack sollte Ballon-like erscheinen, einen Herzschlag sichtbar sein soll und die Herzfrequenz sollte&gt; 120 Schläge pro Minute, und Kreislauf sollte klar sein, </li><li> Foto Embryonen vor der Dottersack Entfernung ggf. </li><li> Entfernen Dottersack von Embryos durch ein Loch in der Nähe des EPC und Spiegeln der Dottersack und Amnion über den Kopf und Rumpf des Embryos. </li><li> Die Nabelschnur kann passgenau auf den Dottersack aus dem Embryo zu trennen, und der Dottersack kann für die Genotypisierung der Embryo gegebenenfalls verwendet werden. </li><li> Untersuchen Sie den Embryo für Somiten Anzahl und Neuralrohrdefekten, wie offene Schädel-Falten, unvollständigen Verschluss des Gesichts und / oder eine offene kaudale Neuroporus. Embryonen können nach dem Theiler Klassifizierung von mehreren morphogenetischen Veränderungen (inszeniert werden <a href="http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Databases/Anatomy/MAstaging.html">http://www.emouseatlas.org/ emap / home.html</a> ) Wieder eine fotografische Aufnahme desEntwicklung des Embryos ist nützlich. </li></ol> 7. Hinweise <ol><li> Eine hohe Qualität Dissektion ist wichtig, weil jede nick oder Tränen in den Dottersack erfolgreichen Drehen verhindern und hemmen die normale Entwicklung. Der EPC kann auch bei der Entfernung der Reichert-Membran (RM) beschädigt werden, und wenn der EPC ist auch nur teilweise aus dem Dottersack getrennt, Embryonen nicht normal entwickeln. Allerdings kann eine unvollständige Entfernung der RM führen Embryonen zu verkleben und / oder RM-Zellen können in Kultur überwuchern und einengen Dottersack Expansion, die beide eine normale Entwicklung behindern würde. </li><li> Saubere und scharfe Zange sind das Geheimnis für ein gutes Dissektion, weil stumpf oder verbogen Pinzette das Verfahren erheblich erschweren. Eiweiß-Ablagerungen auf den Instrumenten wird zu Gewebeschäden führen. </li><li> Saubere, sterile Glasflaschen sind auch wichtig, um Embryonen aus Festhalten an der Seitenwand und nicht beschädigt werden. Vor Beginn des Experiments, sollten Flaschen scr werdenubbed mit Wasser und Seife, spülen in dH 2 O, und der Mikrowelle mit einer kleinen Menge von Wasser in jeder Flasche, bis das Wasser kocht. Die Flaschen werden dann mit 70% EtOH gespült und an der Luft trocknen lassen. </li><li> Arbeiten so schnell wie möglich, denn je früher der Embryo in die Kulturmedien übertragen werden können und wärmte wieder auf 37 ° C die bessere Überlebenschancen. </li><li> Komplette Zerlegung der gesamte Wurf vor der Übertragung keine Embryonen Rollerflaschen, so dass jeder Embryo ist bei Raumtemperatur für die gleiche Menge an Zeit, damit Sie keine Unstimmigkeiten in der embryonalen Entwicklung </li><li> Pflegen Sie eine sterile Umgebung, um Kontaminationen der Kulturen zu verhindern. Unsere Kultur Experimente haben ohne Antibiotika durchgeführt worden, aber viele Labors add Antibiotika, um ihre Medien ein Bakterienwachstum zu verhindern. Das Medium erscheinen soll so klar am Ende des Experiments, wie es zu Beginn des Experiments war. Wenn Medien geworden bewölkt oder es ist ein sichtbares Präzipitat, gibt es wahrscheinlich eine conKontamination, die Ihre Kultur infiziert hat. </li><li> Unwirksame Gasaustausch kann auch verzögert Embryonen Entwicklung, so sicher sein, eine zuverlässige Regelung, dass eine kontinuierliche Lieferung zu gewährleisten haben. </li><li> Embryonen entwickeln ca. 50% langsamer in ex vivo Kultur, daher ist es wichtig, Somiten zählen, um sicherzustellen, dass Sie über die entsprechenden Stufe der Entwicklung für den Abschluss des Experiments erreicht. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse: Das Aussehen des Embryos vor und nach-roller Kultur ist in Abbildung 1 dargestellt. Zum Zeitpunkt der Dissektion, sollte Embryonen in einem unversucht Konfiguration (Abb. 1A, D), wo der Schwanz ist hinter dem Kopf faltet werden. Nach 36 Stunden in Kultur, sollten Embryonen abgeschlossen haben, so drehen, dass sie in der C-gebogen, fötalen Position, wo der Schwanz ist vor dem Kopf (Abb. 1B, C, E, F) sind. Pharmakologische Manipulation mit RhoA-Kinase-Inhibitor (Y-27632), ein bekannter Inhibitor der konvergenten Extension währendNeurulation (Ybot-Gonzalez, 2007), führt zu einer Verkürzung der Embryonen über ihre rostral-kaudale Achse (Abb. 1E, F) und hemmt die kraniale neuronalen fach Verschluss. Unsere Daten zeigen, dass steigende Dosen von Y-27632 schrittweise beeinträchtigt kranialen fach Verschluss (Abbildung 2A) und verkürzt die Körperachse (Abb. 2B), im Einklang mit der Rolle des nachgeschalteten RhoA Signalisierung in kranialer Neurulation und konvergente Extension. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig1.jpg" /> Abbildung 1. Aussehen der Kulturen Embryonen und die Manipulation mit den pharmakologischen Inhibitor Y-27632. (A, D) Dissected Embryonen E8.5 vor ganzen Embryo Kultur (B, E) Embryos bei E10 mit dem Dottersack noch intakt, im Anschluss an 36 Stunden von Wälz-Kultur. (C, F) Der Dottersack wurde entfernt, um erfolgreiche Dreh-und Neuralrohrschlusses illustrieren. Embryonen, die mit dem Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 (E, F) behandelt wurden, nicht um eine ordnungsgemäße konvergenten Erweiterung zu unterziehen und verdeutlicheneine verkürzte Körperachse. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig2.jpg" /> Abbildung 2. Wirkung von RhoA-Kinase-Inhibitor auf kraniale Neuralrohrschlusses und Achsen Dehnung. (A) Der Anteil der Embryonen, die in der Lage, erfolgreich in der Nähe ihrer kranialen Falten (% NTC = Prozentsatz Neuralrohrschlusses) waren, ist die Dosis von Y-27632 im Vergleich hinzugefügt Kulturmedien. (B) Der Abstand zwischen den otic Vesikel und Vorderbein deutlich bei steigenden Dosen von Y-27632 (p &lt;.05) reduziert.

<ol>
	<li>Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos.">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , (1990).</li><li>Gray, J. D., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+folate+supplementation+from+Crooked+tail+and+other+NTD-prone+mutant+mice.">Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+extension,+planar-cell-polarity+signalling+and+initiation+of+mouse+neural+tube+closure.">Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure.</a> Development. 134, 789-799 (2007).</li><li>Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-environment+interactions,+folate+metabolism+and+the+embryonic+nervous+system.">Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Fähigkeit, mütterlichen, intrauterine Faktoren von denen, die untrennbar mit der Embryo während seiner Entwicklung separaten ist ein wichtiges Instrument für das Studium in allen Phasen der Embryogenese. Hier haben wir die Auswirkungen eines kleinen Moleküls Inhibitor der RhoA-Kinase am kranialen Neurulation ex utero, wodurch die Variable des mütterlichen Stoffwechsel des Medikaments analysiert. Diese pharmakologischen Manipulation hat eine tiefgreifende Wirkung auf kraniale Neurulation und konvergente Extension. Die Empfindlichkeit dieser Verbindung kann zwischen verschiedenen genetischen Mausmutanten verglichen werden. Die hier vorgestellte Methode kann auch zu Studien anderer molekularer Signalwege in der Entwicklung eingesetzt werden, so dass die direkte Manipulation der zellulären Funktion in Embryonen mit einer Vielzahl von Reagenzien.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Stereomikroskop für Dissection </td><td> Leica </td><td> M165 </td><td></td></tr><tr><td> Precision Incubator </td><td> BTC Engineering (UK) </td><td> BTC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Rotating Bottle Kultur Referat </td><td> BTC </td><td> BTC 003 </td><td></td></tr><tr><td> Glasflaschen für rotierende Einheit </td><td> BTC </td><td> BTC 005 </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Rubber Bung </td><td> BTC </td><td> BTC 007 </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Rubber Cork </td><td> BTC </td><td> BTC 008 </td><td></td></tr><tr><td> Gas Bubbler Inlet </td><td> BTC </td><td> BTC 012 </td><td></td></tr><tr><td> Gas Bubbler Inlet Trap- </td><td> BTC </td><td> BTC 013 </td><td></td></tr><tr><td> Gas Bubbler Outlet </td><td> BTC </td><td> BTC 014 </td><td></td></tr><tr><td> Gas Cylinder </td><td> Techair </td><td></td><td> 20% O 2, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> Gas Regulator </td><td> Techair </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Männlich Rattenserum </td><td> Harlan Labs </td><td> 4520 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM w / o Phenolrot </td><td> Invitrogen </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ml-Spritze </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> Spritzenvorsatzfilter </td><td> Nalgene </td><td> 190-2545 </td><td></td></tr><tr><td> Große Präparierscheren (stumpfe Spitze) </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td><td></td></tr><tr><td> Extra Fine Bonn Scissors </td><td> Feine Scientific Tools (FST) </td><td> 14084-08 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Dumot Nr. 5 Zange </td><td> FST </td><td> 11252-50 </td><td></td></tr><tr><td> Tyrode-Saline </td><td></td><td></td><td> Wie in Cockroft 1990 beschrieben </td></tr><tr><td> 10 cm Einweg-Petrischalen </td><td> BD </td><td> 351029 </td><td></td></tr></tbody></table>

neural tube closure in mouse whole embryo culture

Genetische Mausmodelle sind ein wichtiges Werkzeug bei der Untersuchung von Säugetieren Neuralrohrschlusses (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). Allerdings ist die Untersuchung von Maus-Embryonen in utero durch unsere Unfähigkeit, direkt pharmakologisch zu manipulieren die Embryonen isoliert von den Auswirkungen der mütterlichen Stoffwechsel auf das Reagenz von Interesse begrenzt. Ob mit einem kleinen Molekül, rekombinantes Protein oder siRNA, daß diese Substanzen, um die Mutter, über die Nahrung oder durch Injektion werden diese instabile Verbindungen zu einer Vielzahl von körperlichen Abwehrkräfte, die verhindern, dass sie hätte vom Erreichen der Embryo Thema. Untersuchungen in den Kulturen der ganzen Embryonen können zur Trennung von der Mutter aus intrinsischen fetalen Auswirkungen auf die Entwicklung. Hier stellen wir ein Verfahren zur Kultivierung Maus-Embryonen mit hoch angereichertem Medien in einer Rolle Inkubator Apparat, der für den normalen Neuralrohrschlusses nach der Sektion (Crockett, 1990) ermöglicht. Einmal in der Kultur, können Embryonenmanipuliert mit in-vitro-Techniken, die sonst nicht möglich wäre, wenn die Embryonen noch in utero konventionellen werden. Embryo Geschwister können zu verschiedenen Zeitpunkten erhoben werden, um verschiedene Aspekte der Neurulation, auftretende von E7-7.5 (Neuralplatte Bildung, kurz vor dem Beginn der Neurulation) bis E9.5-10-Studie (am Ende der Schädelbasis falten und Neuroporus caudalis Schließung, Kaufman, 1992). In diesem Protokoll, demonstrieren wir unsere Methode zum Präparieren Embryonen Zeitpunkten, die optimal für das Studium der Schädelbasis Neurulation sind. Embryonen werden bei E8.5 (ca. 10-12 somities) zerlegt werden, nach der Einleitung der Neuralrohrschlusses aber vor Embryo Dreh-und Schädelknochen neuronalen fach Verschluss, und in Kultur gehalten, bis E10 (26-28 somities), wenn kranialen Neurulation abgeschlossen sein.

Watch this Scientific Journal Video about Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture at JoVE.com

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Eine Methode zur direkten pharmakologischen Manipulation von Maus-Embryonen während der Neurulation, dass mütterliche Stoffwechsel umgeht beschrieben. Die Technik lässt sich an verschiedenen Aspekten der Neurulation durch Variation der Zeitpunkt und pharmakologischen Wirkstoffs zu untersuchen.

Neuralrohrschlusses in Maus Whole Embryo Culture

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010).  However, the study of mouse ...

neural-tube-closure-in-mouse-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.4K Aufrufe.  Weill Cornell Medical College. Eine Methode zur direkten pharmakologischen Manipulation von Maus-Embryonen während der Neurulation, dass mütterliche Stoffwechsel umgeht beschrieben. Die Technik lässt sich an verschiedenen Aspekten der Neurulation durch Variation der Zeitpunkt und pharmakologischen Wirkstoffs zu untersuchen.

Serie: Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in rodents have shown a direct link between testosterone and aggressive behavior1 and folk wisdom adapts these findings to humans, suggesting that testosterone induces antisocial, egoistic or even aggressive behavior2. However, many researchers doubt a direct testosterone-aggression link in humans, arguing instead that testosterone is primarily involved in status-related behavior3,4. As a high status can also be achieved by aggressive and antisocial means it can be difficult to distinguish between anti-social and status seeking behavior.
We therefore set up an experimental environment, in which status can only be achieved by prosocial means. In a double-blind and placebo-controlled experiment, we administered a single sublingual dose of 0.5 mg of testosterone (with a hydroxypropyl-&beta;-cyclodextrin carrier) to 121 women and investigated their social interaction behavior in an economic bargaining paradigm. Real monetary incentives are at stake in this paradigm; every player A receives a certain amount of money and has to make an offer to another player B on how to share the money. If B accepts, she gets what was offered and player A keeps the rest. If B refuses the offer, nobody gets anything. A status seeking player A is expected to avoid being rejected by behaving in a prosocial way, i.e. by making higher offers.
The results show that if expectations about the hormone are controlled for, testosterone administration leads to a significant increase in fair bargaining offers compared to placebo. The role of expectations is reflected in the fact that subjects who report that they believe to have received testosterone make lower offers than those who say they believe that they were treated with a placebo. These findings suggest that the experimental economics approach is sensitive for detecting neurobiological effects as subtle as those achieved by administration of hormones. Moreover, the findings point towards the importance of both psychosocial as well as neuroendocrine factors in determining the influence of testosterone on human social behavior.

The procedure described in this protocol shows that testosterone administration and folk beliefs about testosterone may be associated with directly opposed social behaviors.

Die Kombination Behavioral Endokrinologie und Experimentelle Wirtschaftsforschung: Testosteron und Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

Herstellung von Hühnerembryo-Extrakt für die Kultivierung von Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to study. When dissociated from embryonic or post-natal brain, single NPCs will proliferate in suspension to form neurospheres. Daughter cells within these cultures spontaneously adopt distinct developmental lineages (neurons, oligodendrocytes, and astrocytes) over the course of expansion despite being exposed to the same extracellular milieu. This progression recapitulates many of the stages observed over the course of neurogenesis and gliogenesis in post-natal brain and is often used to study basic NPC biology within a controlled environment. Assessing the full impact of 3D topography and cellular positioning within these cultures on NPC fate is, however, difficult. To localize target proteins and identify NPC lineages by immunocytochemistry, free-floating neurospheres must be plated on a substrate or serially sectioned. This processing is required to ensure equivalent cell permeabilization and antibody access throughout the sphere. As a result, 2D epifluorescent images of cryosections or confocal reconstructions of 3D Z-stacks can only provide spatial information about cell position within discrete physical or digital 3D slices and do not visualize cellular position in the intact sphere. Here, to reiterate the topography of the neurosphere culture and permit spatial analysis of protein expression throughout the entire culture, we present a protocol for isolation, expansion, and serial sectioning of post-natal hippocampal neurospheres suitable for epifluorescent or confocal immunodetection of target proteins. Connexin29 (Cx29) is analyzed as an example. Next, using a hybrid of graphic editing and 3D modelling softwares rigorously applied to maintain biological detail, we describe how to re-assemble the 3D structural positioning of these images and digitally map labelled cells within the complete neurosphere. This methodology enables visualization and analysis of the cellular position of target proteins and cells throughout the entire 3D culture topography and will facilitate a more detailed analysis of the spatial relationships between cells over the course of neurogenesis and gliogenesis in vitro.
Both Imbeault and Valenzuela contributed equally and should be considered joint first authors.

Here, we describe how to produce, expand, and immunolabel postnatal hippocampal neural progenitor cells (NPCs) in three-dimensional (3D) culture. Next, using hybrid visualization technologies, we demonstrate how digital images of immunolabelled cryosections can be used to reconstruct and map the spatial position of immunopositive cells throughout the entire 3D neurosphere.

Lokalisieren von Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: Ein Hybrid Visualisierung Methodology

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Hühnerembryo Spinal Cord Scheibe Kultur Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Whole-Mount-Imaging von Mouse Embryo Sinnes Axon Projektionen

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...