Unterstützte teilweise durch Vanderbilt CTSA Grant 1 UL1 RR024975 vom National Center for Research Resources, National Institutes of Health. Diese Arbeit wurde vom NIH R01 HL 83839 finanziert werden; R01 AI 65744.

Für das folgende Protokoll verwenden wir peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC), wie die Zellen von Interesse. Allerdings kann dieses Protokoll mit anderen Zelltypen verwendet werden. Führen Sie den Test in einer Gewebekultur Kapuze mit steriler Technik. Tag 1: Herstellung von Platten und Zellen <ol><li> Nehmen Sie eines ELISPOT Platte und öffnen Sie sie in der Motorhaube. </li><li> Waschen Sie die Platte 3 mal mit 150 ul 1X PBS mit einem Mehrkanal-Pipette, falls vorhanden, sonst einzelne gut Pipettieren akzeptabel ist. </li><li> Nehmen Sie ein Paket von Stauseen und öffnen Sie sie in der Motorhaube. </li><li> Add 2 pg / mL der Fänger-Antikörper, Anti-Human-Interferon-γ, bis 11 ml 1X PBS. Vortex gut. Transfer-Antikörper-Mix mit einem Reservoir. </li><li> Platz 100 ul der Beschichtungslösung in jedes Well mit dem Multichannel. </li><li> Wickeln Sie die Platte in Parafilm. </li><li> Legen Sie die Platte über Nacht im Kühlschrank. Die Platten sind gut für Wochen. Die Faustregel ist, dass, wenn es noch flüssig ist links in die Brunnen, die Platte verwendet werden kann. </li></ol> Cell Preparation Wenn die PBMCs frisch sind dann zählen die Zellen beimpft und über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO 2. Für PBMC in flüssigem Stickstoff gelagert, Auftauen der Zellen notwendig ist. Das Protokoll ist wie folgt: <ol><li> Auftauen Kryoröhrchen von Zellen in 37 ° C Wasserbad bis fast vollständig aufgetaut. </li><li> Unmittelbar in 5 ml R10 Medien resuspendieren. </li><li> Spin für 5 Minuten bei 225 x g. </li><li> Resuspendieren wieder in 5 ml R10 Medien und zählen die lebensfähigen Zellen unter Verwendung von Trypanblau. </li><li> Bringt Konzentration auf 2 x 10 6 Zellen / ml in R10 Medien. </li><li> Rest über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol> Tag 2: Aufbau der Plate <ol><li> Kennzeichenschild Deckel mit Probe-Identifikationsnummer, auch Bedingungen und Datum. </li><li> Waschen Sie die Platte 6 mal mit 150 ul sterilem 1x PBS mit dem dump und Blot-Methode. Achten Sie darauf, nicht auf den Teller spritzen, während Dumping. Dies könnte die Vertiefungen der Platte zu drehen violett. </li><li> Geben Sie 100 ul der R20 in jede Vertiefung. </li><li> Die Platte bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Während die Platte inkubiert, zählen Sie die Zellen, die über Nacht waren ausgeruht. </li><li> Spin der Zellsuspension bei 1500 rpm für 5 Minuten. Den Überstand und das Pellet, so dass Sie zu einer Endkonzentration von 1x10 6 Zellen pro 1 ml in R10 Medien haben. </li><li> Nach dem 1 Stunde Inkubation, entfernen Sie den R20 mit dem dump und Blot-Methode. Achten Sie darauf, nicht auf den Teller spritzen, während Dumping. </li><li> Geben Sie 100 ul der Zell-Lösung (10 5 Zellen) in jede Vertiefung. Add entsprechenden Peptide und / oder Antigene an die entsprechenden Vertiefungen in zweifacher Ausfertigung. Verwenden Sie eine neue Pipettenspitze jedes Mal, wenn Sie in das Peptid funktionierende Lösung. Normale Peptidkonzentration beträgt 10-40 pg / mL. Da Peptide variieren, sollte jeder Prüfer titrieren Peptide, um optimale Ergebnisse zu erzielen. </li><li> In der negativen Kontrolle Brunnen, nur add-Zellen (keine Peptide) </li><li> In der positiven Kontrolle Brunnen, fügen Phytohämagglutinin (PHA; 10 ug / ml, Sigma). </li><li> Inkubieren über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO 2 (~ 18 Stunden). </li></ol> Tag 3: Entwicklung der Platte <ol><li> Waschen Sie die Platte 6 mal mit 150 ul 1xPBS mit dem dump und Blot-Methode. </li><li> Geben Sie 100 ul PBS in jede Vertiefung der Platte mit der Mehrkanalpipette. </li><li> Legen Sie die Platte in den Kühlschrank für 15 Minuten. </li><li> Nehmen Sie die Platte aus dem Kühlschrank und legen Sie sie in der Gewebekultur Kapuze. </li><li> Bereiten Sie die Biotin-Antikörper-Lösung <ul><li> Add 0,5 ug / ml Biotin-Antikörper (mAK 7-B6-1) zu 11ml PBS. </li><li> Vortex die Lösung gut mischen. </li><li> Wenn der Planung bis zur Lösung hinzu mit einem Mehrkanal-, gießen Sie es in ein Reservoir. </li></ul></li><li> Entsorgen Sie die PBS durch flicking es in den Papierkorb. Achten Sie darauf, nicht auf den Teller spritzen, während Dumping. </li><li> Platz 100 ul der Lösung in jedes Well. </li><li> Die Platte in der Gewebekultur Haube bei Raumtemperatur für eine Stunde. </li><li> Platte 6 mal mit 150 &amp;mgr; l 1xPBS mit dem dump und Blot-Methode. Am 6. waschen, lassen Sie den PBS auf die Platte, bis Sie das Streptavidin Antikörper vorbereitet haben. </li><li> Bereiten Sie die Streptavidin-Antikörper. <ul><li> Add 5,5 μ l Streptavidin-Antikörper (Streptavidin-ALP) zu 11ml PBS (1:2000 Verdünnung). </li><li> Vortex die Lösung gut mischen. </li><li> Wenn der Planung bis zur Lösung hinzu mit einem Mehrkanal-, gießen Sie es in ein Reservoir. </li></ul></li><li> Entsorgen Sie die PBS übrigen in den Brunnen und trocknen Sie die Platte. </li><li> Add 100 ul Streptavidin-Lösung in jede Vertiefung. </li><li> Die Platte in der Gewebekultur Haube bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Wash Platten 6 mal mit PBS mit dem dump und Blot-Methode. Am 6. waschen, lassen Sie den PBS auf die Platte, bis Sie die Farbe Lösung gemacht haben. </li><li> Die Arbeit in der Dunkelheit. Bereiten Sie die alkalische Phosphatase-Substrat-Lösung (Alkaline Phosphatase Substrate Kit IV BCIP / NBT): <ul><li> 4 Tropfen Substrat Reagenz 1 bis 11 ml Tris-Puffer, vortexen gut. 4 Tropfen Substrat Reagenz 2 bis Tris-Puffer, vortexen gut. 4 Tropfen Substrat Reagenz 3 bis Tris-Puffer, vortexen gut. </li></ul></li><li> Entsorgen Sie die verbleibenden PBS und trocknen Sie die Platte. </li><li> Geben Sie 100 ul der Farbe Lösung in jede Vertiefung der Platte mit dem Multichannel. </li><li> Schalten Sie das Licht nach 5 bis 10 Minuten Farbe zu entwickeln. </li><li> Lassen Sie die Farbe Reagenzien auf der Platte bleiben, bis die Flecken zu drehen beginnen und lila sind recht dunkel. Dies sollte überall von 5 bis 20 Minuten. Achten Sie darauf, nicht auf die Substrat-Lösung zu lange verlassen, weil damit hohen Hintergrund verursachen könnten. </li><li> Waschen Sie die ELISPOT Platte 3 mal mit Leitungswasser. </li><li> Lassen Sie etwa eine Stunde oder über Nacht trocknen lassen. </li><li> Lesen Platte entweder manuell oder mit ELISPOT-Reader. </li><li> Bewahren Sie die Platte in eine Box vom Lichteinfall. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: ELISPOT wurde entwickelt, um Immunantworten gegen mikrobielle Antigene zu quantifizieren. Jeder Spot zeigt eine einzelne Zelle reagiert und drückt das Zytokin von Interesse. Die Spots können manuell oder mit Hilfe eines ELISPOT Plattenlesegerät gezählt werden. Einschätzung, dass der ELISPOT korrekt durchgeführt wurde sollte mit der Untersuchung der negativen Kontrolle für den Hintergrund der Produktion des Zytokins von Interesse zu beginnen. In der negativen Kontrolle Brunnen würde man erwarten, dass keine Flecken zu sehen, obwohl ein wenig Hintergrund (violett) vorhanden sein. Normalerweise sollte es weniger als durchschnittlich fünf Punkte pro Vertiefung. Die positive Kontrolle Brunnen bestätigen, dass die Reaktion korrekt durchgeführt wurde, und dass die Zellen reagieren auf antigene Stimulation. In der positiven Kontrolle Brunnen Sie erwarten würden, um eine tiefe lila Hintergrund aufgrund eines Zusammenflusses von Flecken (Abb. 1) zu sehen. Es sollte wenig bis gar keine weißen Hintergrund. Wenn die positive und negative Kontrollproben angemessen sind, kann man dann zählen die Vertiefungen mit dem Antigen von Interesse. Ein &quot;suboptimal&quot; führen würde durch eine hohe Hintergrund (die Brunnen sind violett), keine Flecken oder sehr wenigen Stellen, leere Zentrum, schlecht definierte Punkte oder konfluierende Flecken reflektiert werden. Eine Liste von Tipps zur Fehlerbehebung vorgesehen ist (Tabelle 1). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2221/2221fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ein Vertreter der ELISPOT Platte. Jede Platte sollte eine positive Kontrolle, Negativ-Kontrolle und Peptid von Interesse am Minimum in zwei Brunnen durchgeführt. C9, C10, D9 und D10 sind die positive Kontrolle Brunnen, wie Sie sehen können gibt es eine tiefe purpurrote Farbe, konfluenten Zellen und kaum weißem Hintergrund. Die negative Kontrolle Brunnen sind G11, G12, H11 und H12. Diese Brunnen haben keine lila Hintergrund und keine Flecken, wie erwartet. Die Spots G7, G8 zeigen, H7 und H8, zellulären Reaktionen auf mikrobielle Peptide, die lila Flecken bilden einen einheitlichen reagieren Zelle, die das Zytokin von Interesse. Tabelle 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Beobachtung </td><td> Mögliche Ursache </td><td> Mögliche Lösung </td></tr><tr><td> Hoher Hintergrund </td><td> 1. Beide Seiten der Membran nicht richtig gewaschen 2. Zu viele sezernieren Zytokine 3. Platte nicht richtig getrocknet 4. Über entwickelte Platte </td><td> 1. Waschen Sie beide Seiten der Membran mit destilliertem Wasser vor und nach der Farbentwicklung. Reagenzien können durch die Membran in die Basis der Platte austreten, und diese können hohe Hintergrund verursachen, wenn nicht weggespült werden. 2. Reduzieren Sie die Anzahl der Zellen pro Vertiefung, wird dies erfordern Optimierung 3. Trocknen Sie die Platte länger vor dem Lesen 4. Reduzieren Sie Entwicklungszeit </td></tr><tr><td> Keine Flecken / Sehr wenige Spots </td><td> 1. Nicht genug sezernieren Zytokine / Protein von Interesse 2. Sicherstellen, dass die Zellen richtig stimuliert werden 3. Cells nicht l inkubiertong genug oder kann einige Zeit dauern, um Stimulans reagieren 4. Unzureichende Farbentwicklung 5. Nicht genug primären oder sekundären Antikörper </td><td> 1. Erhöhen Sie die Anzahl der Zellen. Dies erfordert eine Optimierung 2. Auch eine positive Stimulation Kontrolle - ein Stimulans, dass Sie wissen, Ausdruck Ihrer Zytokin / Protein von Interesse hervorrufen 3. Erhöhen Sie die Zelle Inkubationszeit oder indirekten Methode (pre-treat-Zellen mit Stimulans) 4. Monitor Farbentwicklung mit einem Overhead-Mikroskop und sicherzustellen, dass die Entwicklung von Reagenzien wurden ordnungsgemäß gelagert und nicht Aktivität verloren 5. Die Konzentration des primären und / oder sekundären Antikörper müssen erhöht werden. Dies erfordert eine Optimierung. </td></tr><tr><td> Blank Areas </td><td> 1. Membrane nicht vorbehandelt 2. Membrane hat irgendwann getrocknet 3. Cells ungleich verteilt </td><td> 1. Stellen Sie sicher, Membran ist ausreichend mit 70% Ethanol (alle Membranen brauchen das nicht so mit Ihrem Lieferanten überprüfen) vorbehandelt. Sorgfältig mit PBS 3X danach 2. Stellen Sie sicher, Membran nicht austrocknet 3. Stellen Sie sicher, mischen Sie die Zellen vorsichtig, um eine gute homologen Zellsuspension wurden vor dem Pipettieren in die Brunnen </td></tr><tr><td> Blank Center </td><td> 1. Schäden aus der Wäsche </td><td> 1. Durchfluss auf automatisierten U-Scheibe (oder Pipettieren) zu hoch sein kann. Brauchen Sie eine schonendere Waschverfahren </td></tr><tr><td> False Positives </td><td> 1. Sekundäre Antikörper Aggregate 2. Cells noch auf der Membran 3. Zellkultur Kontamination </td><td> 1. Filter des sekundären Antikörpers 2. Sicher, dass alle Zellen von der Membran mit PBS Tween 20 vor sekundären Antikörper-Inkubation gewaschen werden. Die Zellen auf der Membran links geben unregelmäßig geformte Flecken 3. Keep Reagenzien als steril und sauber wie möglich. Stellen Sie sicher, Zellkultur-Technik ist aseptisch. Überprüfen Sie für Fehlalarme, indem Sie einen Medien negative Kontrolle. Für Platte Bewegung, <a href="http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&amp;rid=11457#7">sehen schlecht definierten Stellen</a> </td></tr><tr><td> Confluent Spots </td><td> 1. Schlechte Beschichtung, zu viel Antikörper 2. Längerer Zellkultur 3. Zellen über-stimulierten </td><td> 1. Reduzieren primärer Antikörper-Konzentration 2. Je länger die Zellen bebrütet werden, desto mehr Zytokin / Protein sie absondern. Dies wird in größeren Flecken, die beginnen zu verschmelzen und werden ununterscheidbar führen wird. 3. Reduzieren Zellkultur Schritt Inkubationszeit. Over-Stimulation wird in eine Menge von Zytokin / Protein von der Zelle ausgeschieden führen. Dies erzeugt Flecken, die beginnen zu verschmelzen und werden ununterscheidbar wird. Reduzieren Sie die Anzahl von Stimulanzien in den Kulturmedien und Kultur für eine kürzere Zeitspanne </td></tr><tr><td> Schlecht definierten Spots </td><td> 1. Membrane nicht vorbehandelt (wenn Ihr Membran dies erfordert, mit Lieferanten zu überprüfen) 2. Platte Bewegung während Zellinkubation </td><td> 1. Die Membran muss mit Ethanol oder kann dies in fuzzy, schlecht definierten Stellen durch vorbehandelt werden. Es wird schwierig für den Leser diese zu unterscheiden 2. Lassen Sie die Platte während Zellinkubation bewegen, wie Zellen, die bewegt haben mehr als einen Ort schaffen. Verwenden Sie möglichst ein eigenes Gründerzentrum, die nicht während der Inkubation wird geöffnet. Tippen Sie nicht auf die Platte nach der Zugabe Zellen </td></tr><tr><td> Positive Control Brunnen ist gering </td><td> 1. Unterentwicklung - kann durch die Verwendung Streptavidin-ALP und / oder BCIP / NBT-Lösungen, die nicht auf Raumtemperatur gebracht worden sein </td><td> 1. Die Reagenzien auf Raumtemperatur, bevor Sie in die Vertiefungen </td></tr><tr><td> Dichte der Flecken macht es schwierig zu quantifizieren </td><td> 1. Zu viele Zellen wurden in die Vertiefungen gegeben </td><td> 1. Machen Verdünnungen von Zellen (dh 1 x 10 6, 5 x 10 5, 1 x 10 5, 5 x 10 4, 1 x 10 4 Zellen pro Vertiefung), um die optimale Anzahl von Zellen, die bei der Bildung von verschiedenen Stellen durch bestimmen </td></tr></tbody></table>

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Der ELISPOT-Assay wurde als einer der wichtigsten und am häufigsten verwendeten Tests entstanden, um Immunantworten im Menschen zu überwachen und eine Vielzahl anderer Arten. Mit dem ELISPOT-Assay kann Immunzellen Frequenzen bei der einzelnen Zelle Ebene ohne Ausbau oder Manipulation von Zellpopulationen gemessen werden. ELISPOT-Assay wurde in großem Umfang angewendet, um Antigen-spezifische Immunantwort in verschiedenen Krankheiten, darunter Infektionen, Krebs, Allergien und Autoimmunerkrankungen untersuchen. Die An...

A. Herstellung der Medien <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsA.jpg" alt="Material A" /> B. Herstellung von Tris-Puffer <ol><li> Add 800 ml ddH 2 O auf 1 L Becherglas. </li><li> Maßnahme 12 Gramm Tris und fügen in das Becherglas. </li><li> Add 0,12 Gramm Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl 2: 6 H 2 O) in das Becherglas. </li><li> Rühren Sie mit Magnetrührstab auf automatischen Rühren Platte. </li><li> Nach der Auflösung, pH der Lösung auf 9,5. </li><li> Add 200 ml ddH 2 O in das Becherglas, bringt es bis 1000ml. </li><li> Die Lösung wird mit einem 0,22 um Filter. </li></ol> C. Materialien, die für ELISPOT-Analyse: <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsb.jpg" alt="Material B" />

enzyme-linked immunospot assay (elispot):  quantification of th-1 cellular immune responses against microbial antigens

Adaptive Immunität ist ein wichtiger Bestandteil der Freigabe von intrazellulären Erregern. Die Fähigkeit zur Detektion und Quantifizierung dieser Reaktionen beim Menschen ist ein wichtiges diagnostisches Werkzeug. Die enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT) ist an Popularität gewinnt für seine Fähigkeit, zelluläre Immunantworten gegen mikrobielle Antigene, einschließlich immunsupprimierten Bevölkerungsgruppen wie Menschen mit einer HIV-Infektion, Transplantation und Verwendung von Steroiden zu identifizieren. Dieser Test hat die Fähigkeit, die Immunantwort gegen spezifische mikrobielle Antigene, sowie zu unterscheiden, ob diese Antworten Th1-oder Th2-Charakter sind zu quantifizieren. ELISPOT ist nicht auf den Ort der Entzündung begrenzt. Es ist in seiner Fähigkeit, für Immunreaktionen im peripheren Blut, sowie Stellen der aktiven Beteiligung wie BAL, Liquor, Aszites und bewerten vielseitig. Erkennung von Immunantworten gegen ein einzelnes oder mehrere Antigene möglich ist, sowie spezifische Epitope innerhalb mikrobieller Proteine. Dieser Test ermöglicht Nachweis von Immunreaktionen im Laufe der Zeit, als auch Unterschiede in Antigenen von Host-T-Zellen erkannt. Zweifarbige ELISPOT-Assays zur Verfügung für den Nachweis der gleichzeitigen Expression von zwei Zytokinen. Aktuelle Anwendungen für diese Technik sind Diagnose der extrapulmonalen Tuberkulose, sowie Untersuchung des Beitrags von infektiösen Antigenen zu Autoimmunerkrankungen.

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Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identifizierung von mikrobiellen Ziele der adaptiven Immunität bei idiopathischer Krankheiten können durch die Verwendung des enzyme-linked immunospot Test durchgeführt werden.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantifizierung von Th-1 zelluläre Immunantworten gegen mikrobielle Antigene

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

34.6K Aufrufe.  Vanderbilt University School of Medicine. Identifizierung von mikrobiellen Ziele der adaptiven Immunität bei idiopathischer Krankheiten können durch die Verwendung des enzyme-linked immunospot Test durchgeführt werden.

Serie: Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

Verwendung von Interferon-γ enzyme-linked immunospot Assay zur Novel T-Zell-Epitope des humanen Papillomvirus Charakterisieren

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Anwendung von Langzeit kultiviert Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay zur Beurteilung Effektor und Gedächtnis-T-Zell-Antworten in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Charakterisierung der Thymus-abhängig und Thymus-unabhängige Immunglobulin Isotype Antworten bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

Optimierte Interferon-Gamma ELISpot Assay zur Maßnahme T-Zell-Antworten im Meerschweinchen-Modell nach der Impfung

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to assess the respiratory immune/inflammatory response to this bacterium. Flow cytometry and confocal microscopy are fluorescence-based technologies that allow detailed characterization of biological responses.&#160;Different forms of Hi antigen can be used, including cell wall components, killed/inactivated preparations, and live bacteria. Hi is a fastidious bacterium that requires enriched media but is generally easy to grow in standard laboratory settings. Tissue samples for stimulation with Hi may be obtained from peripheral blood, bronchoscopy, or resected lung (e.g., in patients undergoing surgery for the treatment of lung cancer). Macrophage and neutrophil function may be comprehensively assessed using flow cytometry with a variety of parameters measured, including phagocytosis, reactive oxygen species, and intracellular cytokine production. Lymphocyte function (e.g., T cell and NK cell function) may be specifically assessed using flow cytometry, principally for intracellular cytokine production. Hi infection is a potent inducer of extracellular trap production, both by neutrophils (NETs) and macrophages (METs). Confocal microscopy is arguably the most optimal way to assess NET and MET expression, which may also be used to assess protease activity. Lung immunity to Haemophilus influenzae can be assessed using flow cytometry and confocal microscopy.

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae induces inflammation in the respiratory tract. This article will focus on the use of flow cytometry and confocal microscopy to define immune responses by phagocytes and lymphocytes in response to this bacterium.

Beurteilung der respiratorischen Immunantwort auf Haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...