3625-32000-104 und Landwirtschaft und Ernährung Research Initiative Competitive Grants no: Forschung wurde von USDA, ARS Cris unterstützt. 2011-67015-30736 vom USDA National Institute of Food and Agriculture. Wir danken Jessica Pollock, Emma Frimml-Morgan, Shelly Zimmerman, Kristin Bass, Bruce Pesch, Molly Stafne, Allen Jensen, und Tracy Porter für ihre ausgezeichnete technische Unterstützung sowie Rebecca Madison, Doug Ewing, Katie Pille, Jay Steffen, David Lubbers , Robin Zeisness und David Panthen für die hervorragende Betreuung und den Umgang mit Tieren.

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen <ol><li> Vorbereitung komplettem RPMI (cRMPI) durch Zusatz fötalem Rinderserum (FBS) in einer Konzentration von 10% (Volumen / Volumen), Glutamin (2 &amp; mgr; M), Natriumpyruvat (1 uM), nicht-essentiellen Aminosäuren (0,1 uM), Penicillin -streptomycin (100 Einheiten / ml Penicillin und 0,1 mg / ml Streptomycin) und 2-Mercaptoethanol (50 mM) in RPMI 1640. </li><li> Vorbereitung 2 X Säurecitratdextrose durch Mischen Natriumcitrat (77 uM), Zitronensäure (38 uM) und Dextrose (122 uM) in destilliertem Wasser. </li><li> Vorbereitung Ca 2+ Mg 2+ freies Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) pH 7.2: NaCl (137 mM), KCl (2,7 mM), Na 2 HPO 4 (dibasisches, 10 mM), KH 2 PO 4 (einbasischen, 2 mM) in destilliertem Wasser; den pH-Wert auf 7,2. </li><li> Vorbereitung PBS 1% (PBS 1% BSA) durch Zugabe von Rinderserumalbumin in PBS (Volumen / Gewicht, 1 g / 100 ml PBS). </li><li> Vorbereitung PBS + 0,05% Tween 20(PBST) durch Zugabe von 0,05% Tween 20 in PBS (v / v, 500 &amp; mgr; l Tween 20/1 l PBS). </li><li> Vorzubereiten 100 mM Tris HCL pH 8,2-Puffer durch Mischen Tris (100 mM), HCl (0,50 mM) in destilliertem Wasser. </li><li> Vorbereitung 35% Ethanol-Lösung, die durch Verdünnen Ethylalkohol (Reinheit ≥99.5%) in destilliertem Wasser (Volumen / Volumen, 35 ml Ethylalkohol / 100 ml destilliertes Wasser). </li><li> Filter sterilisieren cRPMI, 2 x Säurecitratdextrose, PBS, PBS 1% BSA mit 0,22 um Filter. </li></ol> 2. Langfristige kultivierten Zellen (14 Day Protocol) (Tag eins) <ol><li> Bereiten Antigenlösungen mit der doppelten Endkonzentration in cRPMI. Antigen Wahl ist kritisch und sollte für den Zweck der Untersuchung angepaßt werden. </li><li> Verdünnen rekombinanten M. Tuberkulose-Antigene und Antigen TB10.4 Ag85A bis 2 &amp; mgr; g / ml (jedes Antigens; Endkonzentration von 1 ug / ml). </li><li> Verdünnter M. bovis gereinigten Proteinderivat(PPD-B, Prionics AG) auf 10 ug / ml (Endkonzentration von 5 ug / ml). </li><li> Verdünne das rekombinante frühe sekretorische gene Target 6 (ESAT-6) und Kulturfiltrat Protein 10 (CFP-10) Fusionsprotein (Reşat-6: CFP10) bis 2 &amp; mgr; g / ml (Endkonzentration von 1 ug / ml). Hinweis: Diese Antigene sind immun IFN-γ induzieren Antigene von tuberkulösen Mykobakterien und eingeschlossen werden, um PBMC von M. stimulieren bovis infizierten Tieren. BCG oder M. bovis ΔRD1 geimpften Tieren nicht zu Reşat-6 reagieren: CFP10, wie die Region diese Antigene kodieren (dh RD1) wird in diesen Stämmen gelöscht. Reşat-6: CFP10 in dieser Studie verwendet wurde, war ein freundliches Geschenk von Dr. C. Minion, Iowa State University. TB10.4 und Antigen Ag85A sind immundominanten Antigene vorhanden in virulent und Impfstoff M. bovis-Stämme 37. PPDB, als ein gereinigtes Protein-Derivat, ein Komplex aus mehreren Antigene, einschließlich Antigenen mit nicht-tuberkulösen Mycobakterien geteilt. Infec(: TB10.4, Ag 85A, Reşat-6: nämlich CFP10 und PPDB) ted Tiere potenziell auf alle Antigene reagieren, während geimpften Tieren sollte nicht auf Reşat-6 reagieren: CFP10 11. </li><li> Platte 500 ul / Vertiefung Antigenlösung vierfach für jedes Tier in einer 24 Well-Platte. Aus diesem Protokoll, verwenden Antigene als Pool; so nutzen alle Vertiefungen haben alle Antigene und keine Steuerelemente (wie, null oder Mitogen) dieser Schritt. Inkubieren Platte bei 39 ° C / 5% CO 2. Die normale Temperatur des Viehs ist 39 ° C; Daher haben einige Forscher verwenden 39ºC Kultur von Rinderzellen. Auch in bestimmten Fällen mit menschlichen Zellen, Zellkultur bei 39 ° C liefert zusätzlichen Vorteil 26,30. </li><li> Vorlast Spritzen mit 6 ml 2 X Säure-Citrat-Dextrose-Verbindung mit 16 oder 18 G Injektionsnadeln; und sammeln Sie 60 ml Rinderblut durch Jugularvenenpunktur. </li><li> Isolieren PBMC durch Standard Dichtegradientenzentrifugation der peripheren Blut Leukozytenmanschette FraktionenEinstellen der Zellkonzentration auf 4 x 10 6 Zellen / ml, wie durch Maue et al. 27 </li><li> In Zellen (500 ul / Vertiefung) in Antigen vorinstalliert Platte mit 24 Vertiefungen, in vierfacher Ausfertigung für jedes Tier (Schritt 2.5). Inkubieren Platte bei 39 ° C / 5% CO 2. </li></ol> (Drei bis sieben Tage) <ol start="9"><li> Unter Einhaltung steriler Techniken vorsichtig 500 ul des Überstands aus jeder Vertiefung, ohne die Zellschicht zu stören. </li><li> Aufzufüllen Vertiefungsvolumen durch Zugabe von 500 ul / Vertiefung cRPMI enthaltenden IL-2 (30 U / &amp; mgr; l, das heißt, 15 U / well rekombinantes humanes IL-2 Sigma I7908). Inkubieren Platte bei 39 ° C / 5% CO 2. </li></ol> (Tage 10 und 12) <ol start="11"><li> Unter Einhaltung steriler Techniken zu entfernen 750 &amp; mgr; l Überstand aus jeder Vertiefung. Tanken Sie die Lautstärke mit 750 ul / Vertiefung cRPMI (ohne IL-2). Inkubieren Platte bei 39 ° C / 5% CO 2. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. ELISPOT Assay (Three Day Protocol) (Tag eins (12 th Tag der Langzeitkultur-Protokoll)) <ol><li> Beschriften Sie die ELISPOT Platte richtig für jeden Probensatz, um Fehler zu vermeiden, wenn Plattierzellen: Langzeit-Zellen plus Antigen-präsentierenden Zellen (APCs), Langzeit-Zellen ohne APCs und ex vivo / kurzfristige Zellen (Abbildung 1). Wiederholungen für jede Behandlung (dh antigene Stimulation) sollte mindestens in zweifacher Ausführung durchgeführt werden. </li><li> Vorbereitung Einfangantikörper durch Verdünnen Maus-anti-Rinder-IFN-γ-Antikörper (MCA2112 Klon CC330) in PBS (8 &amp; mgr; g / ml). </li><li> Unter Verwendung einer Mehrkanalpipette vorbefeuchtende die Vertiefungen der ELISPOT-Platte mit 15 ul / Vertiefung von 35% Ethanol für 1 min. Membranschäden zu vermeiden, den Boden der Wells mit Pipettenspitzen berühren Sie nicht zu jedem Zeitpunkt während des Tests. </li><li> Waschplatte sechsmal mit 300 ul / Vertiefung PBS. Waschflüssigkeit sollte Platte Inversion verworfen werden. Wäschen sollte rasch erfolgen, ohne dass sich Plattenvertiefungen, um zu trocknen. </li><li> Je 100 &amp; mgr; l / Vertiefung von Erfassungs anti-IFN-γ-Antikörper (aus Schritt 1 oben). Inkubieren bei 4 ° CO / N (halten Sie die Platte in einer Aufbewahrungstasche mit Reißverschluss). </li></ol> (Zwei Day (13. Tag der Langzeitkultur-Protokoll)) <ol start="6"><li> Bereiten Antigenlösungen mit der doppelten Endkonzentration. Behandlungen sind: keine Stimulation (cRPMI), PPD-B (20 ug / ml, Endkonzentration: 10 ug / ml), Proteincocktail TB10.4 und Ag85A (2 ug / ml von jedem Protein, Endkonzentration: 1 ug / ml eines jeden Proteins) Reşat-6: CFP10 (von M. bovis-Infektion, 2 ug / ml, Endkonzentration: 1 ug / ml), und einer positiven Kontrolle, wie Pokeweed (20 ug / ml, Endkonzentration: 10 ug / ml). Andere Mitogen anstelle PWM (zB Concanavalin A) verwendet werden. HINWEIS: Für diesen Schritt Antigene komponieren vier verschiedenen Behandlungen und sind not verwendet als Pool (wie in Schritt 2.5). Die vier Behandlungen sind: NS, PPDB, Protein-Cocktail (TB10.4 und Ag85A bilden eine Behandlung) und PWM. </li></ol> 4. Kurzfristige Zellkultur und adhärenten Zell (APCs) Isolierung <ol><li> Sammeln Sie 60 ml Blut aus den gleichen Tieren an Tag 1 (unter: Langzeitkultur, 14 Tage-Protokoll) Blut entnommen und zu isolieren PBMCs wie zuvor. </li><li> Einzustellen Zellkonzentration auf 2 × 10 6 Zellen / ml. Label Rohre eindeutig Fehlallokationen zu vermeiden, wenn Plattierzellen. Diese Zellen werden für APCs Isolierung verwendet werden und auch als Kurzzeitzellkultur (Schritt 6.5). Etikett Rohre sowohl mit der Nummer des Tieres und der Art der Kultur (in diesem Fall: ex vivo, kurzfristige oder frische Zellen). </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Capture-Antikörper aus der ELISPOT durch Platte Inversion. 6 mal mit 300 ul PBST Waschplatten. </li><li> Entfernen Sie so viel wie möglich PBST. Je 50 ul der Zellsuspensionen in die Vertiefungen als langfristige Zellen plus APCs markiert. Block anderen wells mit 200 ul / Vertiefung cRPMI. Inkubieren Sie 90 Minuten bei 39 ° C oder Pre-warmen cRPMI oder 39 ° C (für die nachfolgenden Schritte erforderlich). Frische PBMCs nicht adhärenten Zell (APCs) Isolierung verwendet wird in nachfolgenden Schritten benötigt werden und gespeichert werden. </li></ol> 5. kultivierten Zellen <ol><li> Während der 90-minütigen Inkubation (Schritt 4.4, Kurzzeitkultur und adhärenten Zellisolierungsschritt), Ernte langfristig kultivierten Zellen. </li><li> Unter Verwendung von 5 oder 10 &amp; mgr; Pipetten, Pipetten Medien mit Zellen nach oben und unten, um Zellen zu lösen, verbinden die vierfacher Wiederholungen von jedem Tier zu einem einzigen 15-ml-Tube. Zentrifugieren der Röhrchen 5 Minuten bei 400 g. </li><li> Nach dem Zentrifugieren den Überstand verwerfen durch Rohr Inversion. Verdrängen Zellpellet. 5 ml PBS vorsichtig resuspendieren Pellet, falls erforderlich. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal. Überstand verwerfen mit der U-Inversion und sanft resuspendieren Zellen in 1 ml cRPMI. Passen Zellkonzentrationbis 2 × 10 5 Zellen / ml. </li></ol> 6. Plating Frisch und Cultured PBMCs <ol><li> Nach 90 min Inkubation, schütteln Platten auf Plattenschüttler für 30 Sekunden. Entfernen Sie nicht anhaftende Zellen durch Platte Inversion. Pipette 150 ul / Vertiefung warmen cRPMI (aus Schritt 4, unter: Kurzfristige Zellen und adhärenten Zell (APCs) Isolationsschritt). </li><li> Schütteln Sie Platten und entsorgen Waschflüssigkeit. Wiederholen Sie 3x waschen. Geben Sie 100 ul / Vertiefung jedes Antigen in die entsprechenden Wells (pre-markierten). </li><li> Um Zellen Platte Pipette 100 ul / Vertiefung der langfristigen kultivierten Zellsuspension (2 x 10 5 Zellen / ml) in die Vertiefungen als langfristige Zellen plus APCs markiert. Sicherzustellen, dass die Langzeit-Zellen in diesem Schritt hinzugefügt werden, aus dem gleichen Tier wie der APC ist schon in dem Bohrloch. Mischen Sie nicht von APC und langfristige kultivierten Zellen von verschiedenen Tieren. </li><li> Je 100 &amp; mgr; l / Vertiefung des Langzeit kultivierten Zellsuspension (2 x 10 5 Zellen / ml) in Vertiefungen ohne APCs für die Beurteilung der APC Anforderung an die Langzeitkultur Antwort. </li><li> Fügen Sie 100 ul / Vertiefung von kurzfristigen Zellen (frisch isolierte und auf 2 × 10 6 Zellen / ml eingestellt) für Ex-vivo-Reaktion Beurteilung. Platten O / N Inkubieren bei 39 ° C / 5% CO 2 -Inkubator. Stellen Sie sicher, dass die Platten flach und nicht Platten stapeln. HINWEIS: Wenn eine Analyse der Zell-Phänotyp gewünscht wird, Durchflusszytometrie als Neben Assay durchgeführt werden. Zellen werden in 96-Loch U-Boden-Platten (anstatt ELISPOT-Platten) wie für ELISPOT-Assay beschrieben plattiert. Einfangantikörper Adsorption (Schritte 3,4-3,5) übersprungen werden sollte. Zellen werden dann inkubiert, O / N bei 39 ° C / 5% CO 2 durchgeführt und eine Standardzelle Färbeprotokoll. Zellfärbung Reagenzien sind in den Reagenzien Tabelle enthalten. </li></ol> Drei Tage (14. Tag der Langzeitkultur-Protokoll) <ol start="6"><li> Verdünnen Nachweis-Antikörper (Maus-Anti-Rinder-IFN-γ, Klon CC302) zu 5 &amp; mgr; g / ml in PBS 1% BSA. Verwerfen Flüssigkeiten aus den Vertiefungen und Waschplatten: sechsmal mit PBST (300 ul / Vertiefung), indem auf einem Schüttler jedesmal für 10 Sekunden vor und zwischen wäscht einmal mit dH 2 O (300 ul / Vertiefung), weitere 6 Male mit PBST (300 ul / Vertiefung) und zweimal mit PBS (300 ul / Vertiefung). Nachdem die Zellen von den Platten entfernt, und wenn keine biologischen Sicherheit Bedenken gelten, Verfahren außerhalb biologische Sicherheitswerkbänke durchgeführt werden. </li><li> Discard Waschflüssigkeit. Entfernen Sie so viel Waschwasser wie möglich durch Tippen auf Platte auf Papierhandtücher. Hinzuzufügen Nachweisantikörper (100 ul / Vertiefung). </li><li> Inkubation erfolgt während 120 min bei 39 ° C oder Während dieser Inkubation Schritt vorzubereiten alkalische Phosphatase-Lösung nach Herstelleranweisungen. Dreißig Minuten vor der Anwendung (das heißt, 90 min nach Zugabe des Detektionsantikörpers an Wells) verdünnt das Reagenz in PBST. Kehren Sie die Röhre vorsichtig, um Reagenzien zu mischen und bei RT inkubiert. </li><li> Nachdem der 120 min Inkubation verwerfen überschüssige Detektions-Antikörper durch Platte Inversion. Waschplatte 6 mal mit PBST (300 ul / Vertiefung). Entfernen Sie so viel Waschwasser wie möglich durch Tippen auf Platte auf Papierhandtücher. </li><li> Füge 100 ul / Vertiefung von mit alkalischer Phosphatase-Lösung (Schritt 3 oben). Inkubation erfolgt für 45 Minuten bei RT. Entsorgen Flüssigkeit und waschen jeder Platte 6 mal mit PBST (300 ul / Vertiefung). </li><li> Bereiten Sie die Substratlösung nach den Anweisungen des Herstellers (Vector Blau AP Substrat III): Verdünnen Reagenzien in 100 mM Tris-HCl pH 8,2 Puffer. Je 50 &amp; mgr; l / Well der Substratlösung. </li><li> Inkubation bei RT bis blaue Farbe beginnt (ca. 30 min) zu entwickeln. Entsorgen Flüssigkeit und Waschplatten mit reichlich dH 2 O. Bodenplatte entfernen, um Membran freizulegen, zurück von Brunnen waschen und lassen Sie die Platte an der Luft trocknen. </li><li> Lesen Platten auf immunospot Bildanalysator oder ELISPOT-Lesegerät (Tabelle 1), oder manuell mit Hilfe eines Stereomikroskops. Alternativ halten Plattenin Dunkelheit bei RT bis zum Lesen. Aufgrund der hohen Stabilität des Reaktionssubstrats ist Qualität für mehrere Jahre haltbar. Hinweis: Zellen und Antigen-Konzentrationen wurden optimiert, um Vertiefungen mit unzähligen Flecken 23,24,27,37 vermeiden. Es ist möglich, dass unzählige Flecken-Bildung in verschiedenen Einstellungen oder durch biologische Variabilität auftritt. Wenn das der Fall ist, sollte die Zellkonzentration optimiert, eine lesbare Antwort Punktzählung erhalten werden. </li></ol> 7. Platten Lesen und Datenanalyse <ol><li> Führen Analyse nach der Cellular Technology Limited (CTL) ELISPOT-Plattenleseführung (Tabelle 1). Nachdem die Flecken Zählungen werden für jede der Vertiefungen erhalten, die Berechnung der Mittelwert zwischen Duplikate. Die spezifische Immunantwort auf jedes antigene Stimulus wird durch Subtrahieren der durchschnittlichen Anzahl von Punkten in nicht-stimulierten Vertiefungen von der Antigen-stimulierten Vertiefungen berechnet. </li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

IFN-γ-Produktion in Langzeit kultiviert ELISPOT Assays ist im Allgemeinen auf Tcm beim Menschen, aber wie dieser Reaktion entwickelt sich in Kultur ist schlecht verstanden. Ob Tcm im Umlauf sind vorhanden und in vitro zu erweitern, oder wenn das TCM Reaktionen entstehen durch Differenzierung von Effektorzellen und Tem Zellen in Tcm während der Kultur, ist nicht bekannt. Jedoch Untersuchungen mit Proben, die von Menschen haben gezeigt, dass CD4 + -T-Zellen aus ex vivo und langfristig kultiviert IFN-γ-ELISPOT-Assays nicht verwandten Epitop-Spezifitäten, was impliziert, dass Tcm Reaktionen nicht von Effektorzellen 28 zu entwickeln. Offensichtlich kann die Dauer der Reaktion variieren, aber wenn Pathogen Clearance erreicht wird, was schließlich sowohl ex vivo als auch Tcm Reaktionen sinken. Auch Reaktionen der Langzeitkulturen frühe und lange nach Antigen Grundierung gemessen (wenn die Effektorantwort niedriger ist) gezeigt, um zu korrelieren, was anzeigt, dass zirkulierende Tcm Populationen frühe und lange nach Antigenen Priming bezogen bleibt in vivo. Andererseits ist der Betrag der ex vivo Ansprechen anscheinend nicht auf die Grße des Speichers als Reaktion 29 bezogen werden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Langzeit kultiviert IFN-γ ELISPOT Reaktionen resultieren aus in vitro-Expansion der TCM und einer zugehörigen Schwinden Effektor Reaktionen in der Probe anstelle der Differenzierung von Effektorzellen in Tcm Phänotyp. Bei Rindern wird der relative Beitrag von Effektorzellen und Gedächtnisteilmengen, um Antworten von den Langzeit-IFN-γ-ELISPOT-Assays nachgewiesen nicht bekannt. Aktuelle Studien zeigen einen Zusammenhang zwischen Impfstoff rief langfristig kultiviert IFN-γ ELISPOT Antworten und Schutz gegen anschließende experimentelle Infektion mit M. bovis 23-24. Es wurde berichtet, dass schwache langfristig IFN-γ-ELISPOT-Reaktionen auf die Impfung mit dem Fehlen von Schutz 30 zugeordnet. Beide leben und zu töten,ed-Impfstoffe induzieren ähnliche ex vivo IFN-γ ELISPOT Antworten, aber die Impfung mit lebenden BCG entlockt stärker langfristige kultiviert IFN-γ ELISPOT Antworten als nicht getötet Impfstoffzubereitungen. Interessanterweise sind Lebendimpfstoffe Schutz während getötet Formulierungen scheitern, um Schutz gegen Herausforderung mit virulenten tuberkulösen Mykobakterien 31-32, 33 bereitzustellen. Bewertung der Tcm Reaktionen ist auch denkbar, ordnen diese Zellen aus PBMC. Direkt Anreicherung Tcm aus PBMC erfordert jedoch teure Geräte, hoch ausgebildetes Personal, und es ist schwierig, da diese Zellen nicht zahlreich in den Blutstrom. Langfristige Kultur von PBMC bietet Anreicherung Tcm über Tem und Effektorzellen ohne teure Vorrichtungen; Da diese T-Zellpopulationen in vitro expandiert sie weniger repräsentativ für in vivo Speicherantworten sein. Es ist möglich, IFN-γ Speicherantworten zuzugreifen (unter Verwendung der Langzeitkultur oder Tcm Sortiering Strategien) mit Ausnahme des ELISPOT Assays wie: Zytokin-ELISAs 34, Cytokin Perlenanordnungen (CBA), die intrazelluläre Färbung (ICS) oder Zytokin Proteinarrays (CPA). Diese Methoden; sind jedoch im allgemeinen weniger empfindlich als ELISPOT-Tests 35. Ein Vorteil der ELISPOT ist seine Fähigkeit, die sofortige Erfassung des Zytokins kurz nach seiner Freigabeverhinderungs Verdünnung im Überstand und den Abbau durch enzymatische Spaltung oder Zytokin Aufnahme von anderen Zellen erkennen. ELISPOT-Tests erkennen einzelne Zellen produzieren Zytokine eine präzise Ergebnisse auch bei schlechten Signal-Rausch-Szenarien (dh niedrige spezifische Antworten) 35. Auch mit ICS, Erkennung von vor der Freigabe Cytokine können in falscher Identifizierung von Zellen, Zytokinen führen (z. B. aufgrund von posttranslationalen Modulation vor oder während des sekretorischen Prozesses) 34. Die mit ICS-Assays zu Zytokinsekretion zu minimieren beschäftigt Transportinhibitorenwährend der Antigen-Stimulation (wie Golgi Anschlag Proteine ​​bekannt) begrenzen die Dauer der Zellstimulation durch die Zelltoxizität dieser Proteine ​​letztlich Auswirkungen auf die Cytokin-Produktion 35. Mit gesagtem - CBA, CPA und ICS und nützliche Techniken zum Messen mehrerer Cytokine gleichzeitig und / oder zur Bestimmung von Zelloberflächenmarker-Expression (dh mit ICS.). Deshalb können diese Verfahren in Kombination mit dem IFN-γ-ELISPOT-Assay 36 verwendet werden. Während frühere bovine TB-Impfstoffwirksamkeitsstudien gemessen Tcm Antworten via ELISPOT-Assay wird die Detektion von Tcm Reaktionen durch andere Techniken wahrscheinlich ergeben vergleichbare Ergebnisse. Wichtiger ist, der ELISPOT-Assay billiger und einfacher durchzuführen als CBA, CPA und ICS Analyseverfahren 34. Manuelles Zählen der SFC ist eine Alternative zur automatischen Zählung und ELISPOT Platten können bei RT langen Zeitraum ohne Qualitätsverlust gelagert werden, vor oder nach der Stelle contage 37. Die langfristige kultiviert IFN-γ ELISPOT Reaktion wurde angelegt, um Speicherantworten von Mensch, Rind und bei der Auswertung zu bewerten Impfstoff gegen Tuberkulose Antworten 14-16,31-32,33. Tcm Antworten werden auch angenommen, um eine bedeutende Rolle in Wirtsreaktionen auf mehrere andere Infektionserreger von Rindern, wie zu spielen:. Mycoplasma mycoides subsp mycoides 42, Anaplasma marginale 38 und Rinder Respiratory Syncytial Virus 39. Potentiell könnte die Langzeit ELISPOT-Assay für andere Spezies, Zytokine und Infektionen angepasst werden. Diese breitere Anwendungen wird besonders nützlich für die veterinärmedizinischer Immunologie Anwendungen wegen der gegenwärtigen begrenzten Verfügbarkeit von spezifischen Reagenzien können. Tcm Antworten sind von entscheidender Bedeutung für den Schutz gegen mehrere Infektionen, aber frühe Mess sie nach der Infektion / Impfung (zum Krankheitsverlauf Vorhersage oder die Wirksamkeit des Impfstoffes) may umständlich. Analyse der Immunantwort unter ex vivo und kurze antigene Stimulation Bedingungen häufiger vertreten Effektor Antworten aufgrund der Überlappung der Speicher und Effektor-Antworten, insbesondere zu Beginn der immunologischen Gedächtnisbildung. Im Rahmen der chronischen Krankheiten, bei denen die Antigenbelastung kontinuierliche wird ex vivo-Antworten Effektor-Zell-Antworten oder eine Kombination von Speicher und Effektor-Zell-Antworten zu bewerten. Die langfristige kultiviert IFN-γ-ELISPOT-Assays hier beschrieben, wahrscheinlicher wird die Messung des Tcm Reaktionen statt Effektorzellen T-Zelle oder kombiniert CD4 + T-Zell-Antworten. Zusammenfassend stellt die Langzeit kultiviert IFN-γ-ELISPOT-Assay ein wertvoller Ansatz zur Schätzung der Zellenspeicherantworten T und wurde erfolgreich eingesetzt, um Speicherantworten mehrerer Arten in eine Vielzahl von Infektionen Mittel auszuwerten 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.

Effektor-und Gedächtnis-T-Zellen werden durch Entwicklungs Programmierung von naiven CD4 + T-Zellen nach Antigenerkennung erzeugt. Die Differenzierung von naiven CD4 + T-Zellen in Cytokin-produzierenden Zellen erfordert Pathogenerkennung von Zellen des angeborenen Immunsystems, Antigenpräsentation gegenüber T-Zellen, co-Stimulation und transkriptionale Veränderungen zur polarisierten Cytokinproduktion. Zum Beispiel: Antigen-präsentierende Zellen produzieren Interleukin (IL) -12 in Reaktion auf intrazelluläre Pathogene, die zusammen mit der Antigenerkennung, fördert die Differenzierung von T-Zellen in T-Helfer 1 (Th1) -Zellen 1,2 durch Signalisierung über Signalwandler und Aktivator Transkriptions 4 (STAT4) und T-Box exprimiert in T-Zellen (T-bet), was zu Zell-Aktivierung, IL-2-Produktion, die klonale Expansion und Interferon (IFN) -γ Herstellung 3,4. Wenn die Infektion kontrolliert werden bis zu 95% der T-Zellen während der Expansionsphase erzeugt wird beseitigt (dh KontraktionPhase) und Gedächtnis-T-Zellen bleiben, manchmal ein Leben lang 5. Sallusto et al. 6 ergab zwei funktionell unterschiedliche Teilmengen von Gedächtniszellen bei Menschen basierend auf der Expression von Lymphknoten Homing-Rezeptoren. Zentralen Gedächtnis-T-Zellen (TCM) exprimieren CC-Chemokin-Rezeptor (CCR) -7 und CD45RO und werden hauptsächlich in T-Zellbereichen von sekundären lymphatischen Organen entfernt. Tcm haben Effektor-Funktion, eine niedrige Aktivierungsschwelle und behalten hohe IL-2-Produktion und proliferative Kapazität begrenzt. Effektor-Memory-T-Zellen (TEM) auszudrücken CD45RO fehlt CCR7 und Display-Rezeptoren für die Referenzfahrt auf periphere oder entzündeten Geweben. Effektorzellen weder CCR7 oder CD45RO exprimieren aber umgehend produzieren Effektor-Zytokine wie IFN-γ, bei der Antigen-Erkennung. IFN-γ Release Assays (IGRA) für die Diagnose der bovinen und humanen Tuberkulose 7 verwendet. Mycobacterium bovis ist das Hauptmittel der Rindertuberkulose (bTB), während menschliche cases der Tuberkulose werden hauptsächlich durch Mycobacterium tuberculosis verursacht wird. Mit diesen Tests wurde Vollblut oder peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) mit mycobakteriellen Antigene für 16 bis 24 h und IFN-γ Produktion innerhalb der Überstand wird durch ELISA oder durch die Detektion von Zellen, die IFN-γ-ELISPOT-Verwendung Techniken gemessen stimuliert. Als Ergebnis der kurzen Stimulationsperiode (dh., Von 16 bis 24 h) und eine schnelle Produktion von Zytokinen, ex vivo Assays weisen hauptsächlich Effektor- und Tem Antworten. Dies wurde durch durchflusszytometrische Analyse von Zellpopulationen in diesen Kulturen 8-10 bestätigt. Ex vivo IFN-γ-Antworten werden routinemäßig im Rahmen der Immunantwort Platte Bewertung der Tuberkulose-Impfstoffe, auch verwendet werden, um Antworten, die von Rindern zu bewerten inbegriffen. Effektivste Rindertuberkulose Impfstoffe entlocken spezifischen IFN-γ-Antworten, aber nicht alle Impfstoffe, die IFN-γ-Antworten induzieren protective. Auch Niveaus von IFN-γ ausgelöst durch Impfung, wie vor der Infektion gemessen wird, müssen nicht korrelieren mit Schutz. Zum Beispiel können verschiedene BCG-Stämme unterschiedliche Kapazitäten aufweisen, um ex vivo IFN-γ-Antwort zu induzieren, trotz ähnlicher Schutzstufen 11. So sind ex vivo IGRAs wertvoll für Tuberkulose Diagnose und für den Zugriff auf Impfstoff Immunogenität; jedoch ist die Verwendung als Prädiktoren der Impfstoffwirksamkeit begrenzt. Tcm Reaktionen auf die Impfung, andererseits verwendet werden, um die Wirksamkeit des Impfstoffes vorherzusagen, da mit Affen-Immunschwächevirus (SIV) Infektion in nicht-menschlichen Primaten 12,13, Tuberkulose bei Mäusen 14 und Malaria bei Menschen 15,16 demonstriert. Nach einer effektiven Immunantwort, die Pathogen-Clearance, Tcm beibehalten werden und bieten Schutz für eine eventuelle zweite Infektion mit dem gleichen Mittel. Eine bemerkenswerte Ausnahme zu diesem Szenario ist M. Tuberkulose infeRésol des Menschen, in denen Patienten, die kurative antimykobakteriellen Therapie sind anfällig für Reinfektion 17,18. Darüber hinaus werden Ereignisse über immunologische Gedächtnis bei chronischen Infektionen, wobei das antigene Stimulation weiterhin besteht, sind nicht gut verstanden 19. Während chronische Infektionen, wie zum Beispiel mit dem humanen Immundefizienz-Virus (HIV) und Tuberkulose wird eine signifikante Tcm Antwort mit einem positiven Ergebnis (zB Latenz mit Tuberkulose und subklinische Erkrankung mit HIV) 20,21 verbunden. Mehrere Studien an Mäusen und Menschen haben gezeigt, dass die Langzeit kultiviert IFN-γ-ELISPOT-Assays messen Tcm Antworten 16,20-22. Mit diesem Test werden PBMCs in abnehmender Konzentration des Antigens für 10 bis 14 Tage, so dass Reaktionen Effektor-zu-Spitze und abnehmen kultiviert; Erleichterung Tcm zu differenzieren und in der Kultur zu erweitern. Langzeit-kultivierten IFN-γ-ELISPOT-Assays sind auch in der Veterinärmedizin verwendetForschung, noch der Phänotyp der reagierenden Zellen wurde aufgrund des Fehlens von kritischen Reagenzien, insbesondere eines Antikörpers gegen CCR7 schwer zu beurteilen. Effektive Rindertuberkulose Impfstoffe [eg. Verwendung einer Einzeldosis von M. bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG), gefolgt von BCG-Impfstoff-Virus-Antigen vectored 85A Untereinheit oder abgeschwächt M. bovis ΔRD1] entlocken langfristig kultiviert IFN-γ ELISPOT Reaktionen nach der Impfung, die mit dem Schutz korrelieren (dh niedrigere Mykobakterien Belastung und verminderte TB-assoziierten Pathologie) gegen eine nachfolgende Herausforderung mit virulenten M. bovis 23,24. Weiterhin sind die Anzahlen von Antigen-spezifischen IFN-γ sezernierenden Zellen in der Langzeit PBMC Kulturen höher bei 12 Monaten, jedoch verringern sich mit 24 Monate nach BCG-Impfung von Neugeborenen Kälber, korreliert mit dem Grad der Schutz nachweisbaren Beitrag M. bovis Herausforderung 25. In diesem Szenario ist das gezüchtete IFN-γ ELISPOT an wichtiges Instrument für die Vorhersage Wirksamkeit des Impfstoffs, ein Mittel, um Impfstoff-Kandidaten für hohe Kostenwirksamkeitsstudien zu priorisieren. Zusätzlich können kultivierte ELISPOT Techniken für verschiedene Wirte, Pathogene und Zytokinen durch Verändern Antigene oder Antikörper für eine Vielzahl von Zwecken in verschiedenen Forschungsbereichen angepasst werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Sodium citrate (dihydrate)</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Citric acid (monohydrate)</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dextrose</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISPOT PVDF plate</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectastain ABC &#8211; AP KIT Standard</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>AK-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag85A</td>
			<td>Lionex</td>
			<td>LRP-0004.3</td>
			<td>23, 24, 25, 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB 10.4</td>
			<td>Lionex</td>
			<td>LRP-0061.6</td>
			<td>23, 24, 25, 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPDb</td>
			<td>Prionics AG</td>
			<td>7600055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rESAT-6:CFP10</td>
			<td>Kind gift Dr. Minion, Iastate</td>
			<td></td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947; Clone CC302</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1783B</td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947; Biotinylated Clone CC330</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA2112</td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1653GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA2434GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-human CCR7 Clone 3D12</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab95665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947;-Pe Clone CC302</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1783PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7</td>
			<td>SouthernBiotechnology</td>
			<td>1080-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG-APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm&#8482;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrefeldinA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pokeweed Mitogen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinat human Interleukin 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7908</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay for assessing effector and memory t cell responses in cattle

Effektor-und Gedächtnis-T-Zellen werden durch Entwicklungs Programmierung von naiven Zellen nach Antigenerkennung erzeugt. Wenn die Infektion bis zu 95% der T-Zellen während der Expansionsphase erzeugt gesteuert werden eliminiert (dh., Kontraktionsphase) und Gedächtnis-T-Zellen bleiben, manchmal ein Leben lang. Beim Menschen wurden zwei funktionell unterschiedliche Teilmengen von Gedächtniszellen basierend auf der Expression von Lymphknoten Homing-Rezeptoren beschrieben. Zentralen Gedächtnis-T-Zellen exprimieren CC-Chemokinrezeptor 7 und CD45RO und werden hauptsächlich in T-Zellbereichen von sekundären lymphatischen Organen entfernt. Effektor-Memory-T-Zellen exprimieren CD45RO fehlt CCR7 und Display-Rezeptoren mit Lymphozyten-Homing, um periphere oder entzündeten Geweben verbunden. Effektor-T-Zellen nicht exprimieren entweder CCR7 oder CD45RO aber bei Zusammentreffen mit Antigen produzieren Effektor Zytokine wie Interferon-γ. Interferon-γ Release Assays für die Diagnose der bovinen und humanen Tuberkulose underfassen in erster Linie Effektor und Effektor-Memory-T-Zellantworten. Zentralen Gedächtnis-T-Zell-Antworten von CD4 + T-Zellen auf die Impfung, andererseits verwendet werden, um die Wirksamkeit des Impfstoffes vorherzusagen, da mit Affen-Immunschwächevirus-Infektion von nicht-menschlichen Primaten, der Tuberkulose bei Mäusen und Malaria in Menschen nachgewiesen. Mehrere Studien an Mäusen und Menschen als auch unveröffentlichte Daten am Rind, haben gezeigt, dass Interferon-γ-ELISPOT-Assays messen zentralen Gedächtnis-T-Zell-Reaktionen. Mit diesem Test werden periphere mononukleäre Blutzellen in abnehmender Konzentration des Antigens für 10 bis 14 Tage (Langzeitkultur), so dass Reaktionen Effektor-zu-Spitze und abnehmen kultiviert; zentralen Speicher T-Zellen zu erleichtern, zu differenzieren und in der Kultur zu erweitern.

Etwa ein Monat nach der Aerosol-Infektion mit M. bovis (10 4 koloniebildende Einheiten), die von infizierten PBMCs (n = 8) und Kontrolltiere (n = 8) wurden in Gegenwart von Antigenen und IL-2 für 13 Tage kultiviert. Entwicklung der TCM Reaktionen nach der Infektion wurde mit IFN-γ ELISPOT-Assay bestimmt. Vertreter TCM (in der Gegenwart oder Abwesenheit von APCs) und ex vivo IFN-γ ELISPOT Antworten von infizierten Tieren (drei Tiere) und einem nicht infizierten Tier (ein Tier) sind in Abbildung 1 dargestellt. Eine langfristig erfolgreiche IFN-γ ELISPOT-Assay führt zu Zellen, die IFN-γ (Spot-bildenden Zellen, SFC) unter stimulierten Bedingungen und das fast vollständige Fehlen einer Antwort von nicht-infizierten Tiere und unter nicht-stimulierten Bedingungen. Ferner sollte eine starke T-Zell-Antwort in Reaktion auf PWM auftreten. Spezifische Reaktionen auf M. CFP10 Antigenstimulation: bovis wurden von PPD-B oder Reşat-6 bewertet. Wie in Abbildung gezeigt1, robust Tcm und Ex-vivo-Reaktionen auf PPD-B und Reşat-6: CFP10 wurden von allen drei M. erkannt bovis infizierten Tieren. Minimale bis keine Tcm und ex vivo-Antworten wurden aus dem Kontrolltier nachgewiesen. Außerdem wurde die Anwesenheit von APCs für eine optimale Tcm Antworten durch infizierte Tiere erforderlich ist, wie durch eine stark eingeschränkte Antworten nachgewiesen durch lange Zellen in Abwesenheit von autologen APCs kultiviert. IFN-γ Antwort durch PBMCs von M. bovis infizierten und nicht-infizierten Tiere sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Anzahl der SFCs von jedem Tier wurde als die durchschnittliche Anzahl der SFCs in doppelten Proben in Reaktion auf PPD-B minus der jeweiligen Reaktion auf Medium allein berechnet. Die Antworten wurden für 10 6 Zellen geschätzt. Reaktionen unterschieden (P &lt;0,05), basierend auf den Infektionsstatus, der Anwesenheit oder Abwesenheit von APCs und Kulturdauer (dh., Die Langzeitkultur gegen ex vivo-Kultur). <table border="0" cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <colgroup><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> Erfassen von Bildplatten </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Stellen Sie das Gerät </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Open &quot;Immuno-Capture&quot; Version 6.3 Software. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Schritt 1: Wählen Plattentyp. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Schritt 2: Lastplatte. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Schritt 3: Wählen Sie die Scanoptionen. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> Schritt 4: Starten des Prüfvorgangs. </td></tr><tr><td> 7. </td><td> Erhalten Sie Übersichtsbild der Platte. </td></tr><tr><td> 8. </td><td> Auswurfplatte. </td></tr><tr><td> 9. </td><td> Beenden Sie Software &quot;Immuno-Capture&quot;. </td></tr><tr><td colspan="2"> Zählen der Spot-bildenden Einheiten </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Öffnen Sie &quot;Immuno Spot-Aufnahme&quot; 5.0 Software Version. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Wählen objec<html> t-Art: Normales. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Wählen Zählmodul: smart Zahl. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Schritt 1: Lastplatte. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Schritt 2: Definieren Zählen Parameter: Testgenauigkeit von Spot-Erkennung auf Wells mit verschiedenen Spots. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> Starten Sie Autozahl. </td></tr><tr><td colspan="2"> Qualitätskontrolle </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Open &quot;Immunospot Aufnahme&quot; Version 5.0 Software. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Wählen Zählmodul: Qualitätskontrolle. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Schritt 1: Lastplatte. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Schritt 2: Analysieren markierten Wells einzeln. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Beenden Sie die Qualitätskontrolle. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 - Autoimmun Diagnostika ELISPOT Bildleser Erwerb und Zellzählung Verfahren. ove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52833/52833fig1.jpg" /> Abbildung 1. Bild von Brunnen aus einer langfristigen kultiviert IFN-γ ELISPOT-Assay. Cultured IFN-γ ELISPOT-Assay wurde approximatelyone Monat nach der Herausforderung mit virulenten M. durchgeführt bovis (drei Tiere). Nicht-infizierten Tiere wurden als Kontrollen (ein Tier) enthalten Langzeitzelllinien wurden durch Stimulation PBMC mit einem Cocktail von rekombinanten Ag85A (1 ug / ml), TB10.4 (1 ug / ml) generiert, Reşat-6.: CFP10 (1 ug / ml) und PPD-B (5 &amp; mgr; g / ml) für 13 Tage, gefolgt von Transfer auf ELISPOT-Platten in Gegenwart oder Abwesenheit von autologen APC. Kurzfristige Zellen bestand aus PBMC isoliert am Tag 13 und direkt in ELISPOT Platten plattiert. Langfristige und kurzfristige Zellen wurden mit PPD-B (10 ug / ml), Reşat-6 stimuliert: CFP10 (1 ug / ml), Medium allein oder Kermesbeerenmitogen (5 &amp;# 956; g / ml) für 24 h. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52833/52833fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus einer langfristigen kultiviert IFN-γ ELISPOT Reaktion auf M. bovis gereinigtes Proteinderivat (PPD-B). Cultured IFN-γELISPOT Assay wurde approximatelyone Monat nach der Herausforderung mit virulenten M. durchgeführt bovis (acht Tiere). Nicht-infizierte Tiere wurden als Kontrollen eingeschlossen (acht Tiere Langzeit Zellen wurden durch Stimulation PBMC mit einem Cocktail von rekombinanten Ag85A (1 ug / ml), TB10.4 (1 ug / ml), erzeugt Reşat-6: CFP10 (1 ug / ml) und PPD-B (5 &amp; mgr; g / ml) für 13 Tage, gefolgt von Transfer auf ELISPOT-Platten in Gegenwart oder Abwesenheit von autologen APCs. Kurzfristige Zellen bestand aus PBMC isoliert am Tag 13 und direkt in den ELISPOT-Platte plattiert . Die langfristigen und short Zeit Zellen wurden mit PPD-B (10 ug / ml) oder nur Medium für 24 h stimuliert. Spezifische Reaktionen von jedem Tier (SFC / 10 6 Zellen) als Reaktion auf PPD-B (Durchschnitt von Doppelproben) minus der Reaktion auf die Medien einzeln aufgemacht.

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Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Langzeit-kultivierten Interferon-γ enzymgebundenen immunospot Assay wird als Maß der zentralen Speicher-Antworten verwendet, und korreliert mit Schutz antimykobakteriellen Impfstoff Antworten. Mit diesem Test werden die peripheren mononukleären Blutzellen mit mycobakteriellen Antigene und IL-2 für 14 Tage, so dass die Differenzierung und Expansion des zentralen Gedächtnis-T-Zellen stimuliert.

Anwendung von Langzeit kultiviert Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay zur Beurteilung Effektor und Gedächtnis-T-Zell-Antworten in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

application-long-term-cultured-interferon-enzyme-linked-immunospot

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

12.1K Aufrufe.  United States Department of Agriculture.  Langzeit-kultivierten Interferon-γ enzymgebundenen immunospot Assay wird als Maß der zentralen Speicher-Antworten verwendet, und korreliert mit Schutz antimykobakteriellen Impfstoff Antworten. Mit diesem Test werden die peripheren mononukleären Blutzellen mit mycobakteriellen Antigene und IL-2 für 14 Tage, so dass die Differenzierung und Expansion des zentralen Gedächtnis-T-Zellen stimuliert. 

Serie: Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantifizierung von Th-1 zelluläre Immunantworten gegen mikrobielle Antigene

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

Verwendung von Interferon-γ enzyme-linked immunospot Assay zur Novel T-Zell-Epitope des humanen Papillomvirus Charakterisieren

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

In vitro-Test, um die Auswirkungen von immun Pathways auf die HIV-spezifischen CD4 T-Zell-Effektor-Funktion auswerten

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

Die Verwendung von fluoreszierenden Ziel Arrays zur Beurteilung der T-Zell-Antworten<em&gt; In-vivo-</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Ein IL-8 transientes transgenisiertes Mausmodell für die<em&gt; In vivo</em&gt; Langzeitüberwachung von entzündlichen Reaktionen

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable dry eye animal model to test novel therapeutics to treat autoimmune dry eye conditions. This protocol describes a chronic autoimmune dry eye rat model. Lewis rats were immunized with an emulsion containing lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund&#39;s adjuvant. A second immunization with the same antigens in incomplete Freund&#39;s adjuvant was administered two weeks later. These immunizations were administered subcutaneously at the base of the tail. To boost the immune response at the ocular surface and lacrimal glands, lacrimal gland extract and ovalbumin were injected into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands 6 weeks after the first immunization. The rats developed dry eye features, including reduced tear production, decreased tear stability, and increased corneal damage. Immune profiling by flow cytometry showed a preponderance of CD3+ effector memory T cells in the eyeball.

This report describes a method to induce chronic experimental autoimmune dry eye in Lewis rats through immunization with an emulsion of rat lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund's adjuvant, followed by the injection of lacrimal gland extract and ovalbumin into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands six weeks later.

Ein chronisches Autoimmun-Trockenaugen-Rattenmodell mit Zunahme im Effekt-Speicher T-Zellen in Augapfel-Gewebe

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

Ein Saug Blister-Protokoll, menschliche T-Zelle Recall Antworten In Vivo zu studieren

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...