Wir danken für ihre technische Unterstützung und Vorbereitung dieser Handschrift Penelope Garcia. Diese Arbeit wurde durch eine Forschung Innovation Grant (RIG) von der Abteilung für Medizin an der Loma Linda University (681205-2967) und ein pilot Stipendium der National Multiple Sclerosis Society (PP1685), XT unterstützt.

Alle Experimente wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit einer institutionellen Animal Care und Einsatz-Protokoll durch Animal Care and Use Committee an der University of Texas at El Paso und der Loma Linda Universität genehmigt.
1. Generation einer OLP-Bibliothek, die über die gesamte Länge eines Proteins
<ol>
	<li>Entwerfen Sie eine OLP-Bibliothek, in der alle Peptide sind 15-Mer in der Länge, und angrenzenden Peptide eine Überlappung von 11 Aminosäuren. Hinweis: In der MOG OLP-Studie Abfolge von MOG Vorläufer [Mus Musculus] wurde abgerufen von NCBI Proteindatenbank unter folgendem Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. Der MOG-Vorläufer (247 Aminosäuren), der Signal- und Reifen Peptide enthielt, wurde verwendet, weil die meisten der gemeldeten Qa-1 (HLA-E) Epitope in Signal-Peptide (z.B. Qdm1) befanden. Beginnend bei der N-Terminus, wurden die Sequenzen von 15-Mer Peptide identifiziert, so dass zwei benachbarte Peptide von 11 Aminosäuren (Abbildung 1) überlappt. In 247 Aminosäure MOG Vorläufer wurden daher genau 59 OLPs ermittelt. Allerdings reichen die letzten OLP von 12 bis 15-Mer abhängig von der Länge des Proteins. Darüber hinaus wählen wir 15-Mer Bibliothek, weil wir und andere gezeigt haben, dass 15-Mer Peptide, wenn in dendritischen Zellen (DCs) oder Makrophagen, hinzugefügt effizient weiterverarbeitet Epitope für die Anerkennung von CD8 Zellen+ T14,15 .</li>
	<li>Erwerben Sie jede einzelne Peptid im Handel. 5 mg pro Peptid sollten reichen für das Screening. OLPs und abgeschnittene Peptide (Schritt 6.1) kann entsalzten Peptide (Reinheit ist ca. 50-70 %). Die Reinheit der optimale Peptid (Schritt 6.2), die für die Erzeugung von Tetramer und für zukünftige Analysen verwendet werden soll &#62; 90 %. Wiederherzustellen Sie die Peptide unter sterilen Zustand.</li>
	<li>Machen Sie 50 mg/mL in 100 % DMSO individuelle Peptid-Aktien. Fügen Sie 5 mg jedes Peptid 100 μL von DMSO in jedem Röhrchen mischen und speichern die Peptide bei-20 ° C. Diese Bestände werden verwendet, um ein OLP_pool-Lager für die Generation der CD8 machen+ T-Zell-Linien auf den OLP_pool reagiert. Darüber hinaus werden diese Bestände auch verwendet werden, um 10 mg/mL machen individuelle Peptid Bestände zur Bestimmung der Fähigkeit jedes einzelnen Peptid, eine QS-1-eingeschränkt Antwort in ein OLP_pool-reaktive CD8 stimulieren+ T-Zell-Linie.</li>
	<li>Machen OLP_pool Lager durch Hinzufügen zum gleichen Volumen jedes Peptid in ein frisches Gefäß. Diese OLP_pool enthält 100 % DMSO. In der MOG OLP-Studie gab es 59 OLPs12. Daher war die Konzentration der jedes Peptid in der OLP_pool 847.46 μg/mL (50 mg/mL ÷ 59).</li>
	<li>10 mg/mL individuelle Peptid Bestände durch verdünnen (5 X) machen die Aktie 50 mg/mL in sterilen H2O in einem V-Boden-96-Well-Platte (diese Lager enthält 20 % DMSO). Machen Sie diese Bestände in einer 96-Well-Platte, da die Bestimmung der QS-1-eingeschränkt Antwort von jedem einzelnen Peptid in eine 96-Well-Platte mit einem 8- oder 12-Kanal Mehrkanal-Pipette ausgeführt wird. Hinweis: Alle Peptide, einschließlich OLPs und abgeschnittene Peptide, sollte entweder eine V-Boden-96-Well-Platte verdünnt werden oder eine 96-Well-Probenrack mit 1 mL Röhrchen gefüllt, da das Peptid-Bibliothek-Screening in 96-Well-Platten mit einer Mehrkanal-Pipette durchgeführt wird. Wenn es schwierig, eine Peptid zu verdünnen, Tropfen Sie 1 N NaOH weisen zu helfen, das Peptid auflösen.</li>
</ol>
2. Priming von Kb-/- Db-/- CD8+ T-Zellen mit dem OLP_pool-gepulste Kb-/- Db-/- dendritische Zellen (DCs).
Hinweis: Es gibt zwei große QS-1-Allel: einer ist QS-1ein, und der andere ist QS-1b. Da die Tiere häufig verwendet für die akademische Forschung, z.B. C57BL/6 und Balb/c Mäuse, Qa-1b, dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Zuordnung Qa-1b Epitope in ein Protein. CD8+ T Zellen, die in diesem Protokoll verwendeten werden gereinigt, von Kb-/-Db-/- Mäuse C57BL/6 (im Hintergrund) in welche CD8+ T Zellen sind meist durch nicht-klassischen MHC-Ib-Moleküle, einschließlich QS-1 eingeschränkt.
<ol>
	<li>Knochenmark stammenden DCs als zuvor beschriebenen12produzieren.
	<ol>
		<li>Kurz, Kultur des Knochenmarks Einzelzelle Suspensionen (1 x 106 Zellen/mL) in RPMI-10 Medium (RPMI 1640 ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum, 5.5 x 10-5 M 2-Mercaptoethanol, 1 mM Natrium Pyruvat und unwesentliche Aminosäure 0,1 mM) enthält 10 U/mL IL-4 und 100 U/mL GM-CSF in einem 6-Well-Platte (4 mL/Na) bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
		<li>Zwei Tage später, entfernen Sie nicht anhaftende Zellen vorsichtig und fügen Sie hinzu, neue Medien und Zytokine.</li>
		<li>Nach der Kultivierung der Zellen für weitere zwei Tage, nicht anhaftende Zellen mit frischen Medien und Zytokine in eine neue 6-Well-Platte zu übertragen.</li>
		<li>Die Zellen für weitere zwei Tage Kultur und aufgefüllt mit frischen Medien und Zytokine mit LPS (0,1 µg/mL), die DCs zu aktivieren.</li>
		<li>24 h später, sammeln die DCs für Experimente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Die DCs mit 3000 Rads zu bestrahlen.
	<ol>
		<li>Alternativ behandeln die DCs (5 x 107 Zellen/mL) mit Mitomycin C (50 μg/mL) mit PBS-Puffer bei 37 ° C für 20 min. RPMI-0 (RPMI 1640 ohne Serum) hinzufügen, um das Rohr (12 mL) füllen und drehen Sie die Zellen für 10 min in einer Tischplatte Zentrifuge bei 300 x g. verwerfen Überstände und Nummer t des Waschvorgangs noch zweimal. Diese drei Wäschen kritisieren weil jede Spur Menge Mitomycin C die Reaktion der CD8 hemmen kann+ T Zellen während der DC-T Co Zellkultur.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Passen Sie die DC-Konzentration bis 5 x 106 Zellen/mL in einem serumfreien Medium (AIM-V serumfreien Medium ergänzt mit 5.5 x 10-5 M 2-Mercaptoethanol, 1 mM Natrium Pyruvat und unwesentliche Aminosäure 0,1 mM).</li>
	<li>Fügen Sie die OLP_pool-Stammlösung, die 100 % DMSO auf die DCs enthält, so dass DMSO Endkonzentration 0,5 % (200 X). In der MOG OLP-Studie wurde die Konzentration von jedem OLP in der OLP_pool 847.46 μg/mL; Daher war die Endkonzentration von jedem OLP in der DC-Kultur 4.2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200).</li></ol>Jedoch kann diese Konzentration bis zu 100 μg/mL skaliert werden, solange die DMSO-Konzentration in der Zellkultur weniger als 1 ist %.
	<li>Brüten Sie die DCs bei Raumtemperatur für 3 h und schütteln Sie die Zellen leicht alle 15 min.</li>
	<li>Während dieser Inkubationszeit reinigen CD8+ T-Zellen aus dem geernteten Milz oder Lymphknoten von Kb-/-Db-/- Mäuse mit einem kommerziellen CD8+ T Zelle Reinigung Kit, passen Sie die Zellkonzentration bis 10 x 106 Zellen/mL in die serumfreien Medium mit 50 U/mL Interleukin 2 (IL-2) und 100 U/mL IL-7.</li>
	<li>Fügen Sie nun die CD8+ T-Zellen in einem 48-Well-Platte als 0,5 mL/gut (nach der Zugabe von 0,5 mL/gut von der OLP_pool-gepulste DCs in Schritt 2,8, die Endkonzentration der CD8+ T Zellen werden 5 x 106 Zellen/mL). Hinweis: CD8+ T Zellen aus Maus Milz und Lymphknoten können gereinigt werden, indem, dass CD8 positiven Isolierungskit entsprechend den Anweisungen des Herstellers. CD8+ T-Zellen sind frei von Perlen.</li>
	<li>Spin-down der OLP_pool-gepulste DCs (300 X g, 10 min) bei RT rekonstruieren die DCs OLP_pool gepulst bis 2 x 106 Zellen/mL in serumfreien Medium und fügen 0,5 mL/Brunnen in der 48-Well-Platte, die die CD8 enthält+ T-Zellen (Endkonzentration von der OLP _pool-gepulste DCs ist 1 x 106 Zellen/mL, Endkonzentration von CD8+ T Zellen ist 5 x 106 Zellen/mL und Endkonzentration von IL-2 ist 25 U/mL Endkonzentration von IL-7 ist 50 U/mL). Kultur der Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
	<li>Am 4. Tag entfernen Sie und entsorgen Sie etwa 400 μl des Kulturmediums und 500 μL der frischen serumfreien Medium mit 100 U/mL IL-2 und 100U/mL IL-7 in jede Vertiefung. Inkubation der Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
	<li>Am Tag 7 oder 8, neu stimulieren die OLP_pool grundiert CD8+ T-Zellen mit den OLP_pool.</li>

(3) Restimulation grundiert CD8+ T Zellen mit Makrophagen gepulst mit der OLP_pool
<ol>
	<li>Vier Tage vor der erneuten Stimulation des OLP_pool grundiert CD8+ T-Zellen, 2 % (V/V) Polyacrylamid Wulst Lösung vorbereiten: waschen 2 g Polyacrylamid Perlen zweimal in 20 mL Endotoxin-freie H2O oder PBS. Pellet-Polyacrylamid-Perlen durch Zentrifugieren (400 X g) für 5 min und in 100 mL PBS aufzuwirbeln. Autoklaven bei 15 lb/m für 20 min. Store bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Injizieren Sie Mäusen intraperitoneal mit 1 mL/Maus der sterilen 2 % Polyacrylamid Wulst Lösung für die Migration von Monozyten/Makrophagen in die Bauchhöhle16zu gewinnen.</li>
	<li>Vier Tage später, die Tiere durch CO2 Überdosierung zu opfern.
	<ol>
		<li>Unter sterilen Bedingungen, schneiden Sie eine kleine Öffnung in der Mitte des Bauches, so dass die Öffnung gerade genug ist für das Bestehen einer 5 mL-Transfer-Pipette. Füllen Sie die Transferpipette mit RPMI-0 und legen Sie die Pipette in den Bauch Hohlraum durch die Öffnung.</li>
		<li>Spülen Sie den Bauch Hohlraum durch pipettieren. Pipette, soviel Flüssigkeit wie möglich aus dem Bauch Hohlraum in ein steriles Röhrchen (diese sind peritonealen Makrophagen). Wiederholen Sie spülen-Schritt 4 - 5 Mal.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Die peritonealen Makrophagen mit 3000 Rads zu bestrahlen.
	<ol>
		<li>Alternativ behandeln Sie die peritonealen Makrophagen mit Mitomycin C (folgen Sie den beschriebenen Schritt 2.2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Passen Sie die Konzentration der peritonealen Makrophagen, 5 x 106 Zellen/mL in serumfreien Medium. Fügen Sie OLP_pool Lager (die Endkonzentration von DMSO ist weniger als 1 %) und M-CSF (Endkonzentration = 100 U/mL). Hinweis: In dieser Studie MOG OLP verwendet wir 0,5 % DMSO. Somit bestand MOG OLP_pool verdünnte 200 x (z.B. 1 μL des MOG OLP_Pool Lager in 199 μL der peritonealen Makrophagen hinzugefügt wurde). Daher wurde die Endkonzentration von jedem OLP 4.2 μg/mL).</li>
	<li>Fügen Sie 200 μl/Well (1 x 106 Zellen/Na) in einer Gewebekultur 48-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 4 h.</li>
	<li>Entfernen Sie die nicht-anhaftende Zellen und Polyacrylamid-Perlen durch sanftes waschen mit 200 μl/Well des vorgewärmten RPMI-0.</li>
	<li>Sammeln und Pool die OLP_pool grundiert CD8+ T-Zellen aus Schritt 2.10. Passen Sie die OLP_pool grundiert CD8+ T-Zell-Konzentration bis 1 x 106 Zellen/mL in serumfreien Medium mit 25 U/mL IL-2 und 50 U/mL IL-7. Fügen Sie 1 mL/gut, die 48-Well-Platte, die die OLP_pool-gepulste peritonealen Makrophagen enthält.</li>
	<li>Ergänzen Sie vier Tage später das Medium in der 48-Well-Platte. Entfernen Sie und entsorgen Sie ca. 400 μl des Kulturmediums in die Kultur 48-Well-Platten. Fügen Sie 500 μL der frischen serumfreien Medium mit 100 U/mL IL-2 und 100 U/mL IL-7 in jede Vertiefung. Kultur der Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
	<li>Drei oder vier Tage später, untersuchen Sie die OLP_pool-restimuliert CD8+ T-Zellen für OLP_pool-spezifische, QS-1-eingeschränkte Reaktion durch Enzym-linked Immunospot Assay (ELISPOT). Nach diesem Zeitpunkt neu stimulieren die CD8+ T Zellen alle 7-10 Tage. Hinweis: Makrophagen werden bevorzugt für die erneute Stimulation der OLP_pool grundiert CD8+ T Zellen. Wir haben festgestellt, dass CD8+ T Zellen wieder angeregt durch Makrophagen wuchs besser als DCs in Vitro.</li>
</ol>
(4) Bestimmung der OLP_pool-spezifische, QS-1-eingeschränkte Reaktion in eine OLP_pool restimuliert CD8+ T-Zell-Linie
Hinweis: OLP_pool-spezifische, QS-1-eingeschränkt Antwort in ein OLP_pool restimuliert CD8+ T-Zell-Linie richtet sich nach IFNγ Sekretion nach Stimulation durch die OLP_pool in Anwesenheit von C1R oder C1R. QS-1b -Zellen mit einem IFNγ ELISPOT Assay. C1R Zellen sind kommerziell erhältlich. C1R. QS-1b -Zellen können durch transducing die C1R Zellen mit der QS-1 Lentivirale Vektor erzeugt werden.
<ol>
	<li>Fügen Sie 100 μl/Well eines Capture Anti-IFN-γ-Antikörpers in Beschichtung Puffer (PBS) in die Vertiefungen eines ELISPOT-Platte verdünnt.</li></ol>Verschließen und über Nacht die Platte bei 4 ° C inkubieren.
	<li>Am zweiten Tag verwerfen Sie die Beschichtung-Puffer mit der Capture-Anti-IFN-γ-Antikörper und fügen Sie 200 μl/well-Blocker-Lösung (serumfreien Medium) und inkubieren Sie die Platte für 2 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Die C1R und C1R zu bestrahlen. QS-1b -Zellen mit 9.600 Rads.
	<ol>
		<li>Alternativ behandeln Sie die C1R und C1R. QS-1b -Zellen mit Mitomycin C, wie in Schritt 2.2 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Behandlungszeit 30 min werden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Passen Sie die C1R und C1R. QS-1b -Zellen in serumfreien Medium 4 x 106 Zellen/mL.</li>
	<li>Entsorgen Sie die blockierende Lösung in der Platte und fügen Sie die C1R und C1R. QS-1b -Zellen bei 50 μl/Well (200.000 Zellen/Na) und Mix.</li>
	<li>Fügen Sie 50 μL/gut 100 x OLP_pool Lager (in serumfreien Medium) verdünnt und mischen Sie richtig. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für ca. 2-3 h.</li>
	<li>Passen Sie die OLP_pool-restimuliert CD8+ T auf 1 bis 2 x 106 Zellen/mL in serumfreien Medium mit 150 U/mL IL-7 Zellen und die Platte 50 μl/Well (50.000-100.000 Zellen/Na) hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Platte (58 X g) für 5 min.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 über Nacht.</li>
	<li>Aspirieren Sie Zellsuspension. Waschen Sie Brunnen 2 Mal mit entionisiertem Wasser (DI) (250 μl/Well). Lassen Sie Brunnen für 5 min bei jedem Waschschritt einweichen.</li>
	<li>Waschen Brunnen 3 Mal ich mit waschen Puffer (PBS mit 0,05 % Tween20). Lassen Sie Brunnen für 1 min bei jedem Waschschritt einweichen. Waschpuffer zu verwerfen.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μL der Detektionsantikörper verdünnt in einen Verdünnungspuffer (PBS mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS)).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten in 2 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Antikörperlösung Erkennung zu verwerfen. Waschen Sie Brunnen 3 Mal mit 250 µL/Well waschen Puffer I. ermöglichen Brunnen für 1 min bei jedem Waschschritt einweichen.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μl/Well des Enzym-Konjugat (Streptavidin-HRP) in Verdünnungspuffer bei 1: 100 Verdünnung verdünnt.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Enzym-Konjugat-Lösung zu verwerfen. Waschen Sie Brunnen 4 Mal mit 250 µL/Well waschen Puffer I. ermöglichen Brunnen für 1 min bei jedem Waschschritt einweichen.</li>
	<li>Waschen Sie Brunnen 2 Mal mit 250 µL/Well waschen Puffer II (PBS).</li>
	<li>Jedes gut 100 µL Substratlösung (Mischung 1 Tropfen = 20 µL des AEC-Chromogen mit 1 mL der AEC-Substrat) hinzufügen. Vor Ort Entwicklung für 5 bis 60 min zu verfolgen.</li>
	<li>Wenn die gewünschten Ergebnisse beginnen zu erscheinen, vorbeischauen Sie der Substratreaktion Brunnen mit destilliertem Wasser waschen.</li>
	<li>An der Luft trocknen der Platten bei Raumtemperatur für 2 Stunden oder über Nacht bis es völlig trocken ist. Entfernung von der Plastikschale unter den Platten erleichtert trocknen. Speichern Sie Platten in einem verschlossenen Plastikbeutel im Dunkeln, bis es analysiert wird.</li>
	<li>Auflisten von Flecken manuell durch Inspektion unter dem sezierenden Mikroskop oder mit einem ELISPOT-Platte-Reader. Das repräsentative Ergebnis in Abbildung 2zu sehen.</li>

5. Ermittlung der einzelnen Peptide in der OLP_pool die die eingeschränkte Qa-1 IFN-γ Sekretion in ein OLP_pool-spezifische CD8 stimulieren+ T-Zell-Linie
<ol>
	<li>Bestimmen die einzelnen Peptide, die die OLP_pool-spezifisch, QS-1-Restrictred IFN-γ Sekretion in ein OLP_pool-spezifische CD8 stimulieren+ T-Zell-Linie mit den oben beschriebenen IFN-γ ELISPOT Assay (Endkonzentration von jedem einzelnen Peptid verwendet für die ELISOPT ist Assay 10 μg/mL). Repräsentative Ergebnisse in Abbildung 3zu sehen. Hinweis: Ein OLP-spezifisch, QS-1-Restircted Antwort eine Antwort bezeichnet, die mindestens drei Mal die Reaktion in Anwesenheit von C1R. QS-1b -Zellen, aber ohne die OLP. In der MOG OLP Studie, OLP68, OLP96 und OLP105 erfüllt dieses Kriterium. Deshalb enthalten alle drei OLPs potenziell Qa-1 Epitope12 (Abbildung 3). Jedoch gaben die OLP105 konsequent die stärkste Reaktion; Daher führten wir eine detaillierte Analyse der OLP105 (Abbildung 4 und Abbildung 5)12.</li>
</ol>
6. Identifikation der optimale QS-1-Epitop in einem 15-Mer OLP die stimuliert die Epitop-spezifische, QS-1-eingeschränkt Reaktion in einer OLP_pool-spezifische CD8+ T-Zell-Linie
<ol>
	<li>C - und N-Terminal abgeschnitten Peptide von einem 15-Mer OLP wie in Abbildung 4gezeigt zu synthetisieren.</li>
	<li>IFN-γ Sekretion in einer OLP-spezifischen CD8 untersuchen+ T-Zell-Linie durch die Stimulierung der CD8+ T-Zellen mit jeweils die abgeschnittenen Peptide als auch die elterliche 15-Mer OLP in Anwesenheit von C1R oder C1R. QS-1b -Zellen mit den oben beschriebenen IFN-γ ELISPOT Assay. Die Endkonzentration von jedem einzelnen Peptid für ELISPOT Assay verwendet ist 10 μg/mL. Eine Peptid ist definiert als die optimale QS-1-Epitop, wenn das Peptid: 1) konsequent gibt ähnliche oder stärkere IFN-γ Antwort, im Vergleich zu den ursprünglichen 15-Mer Peptid in Anwesenheit von C1R. QS-1b -Zellen; (2) ist zwischen 8 - 10-Mer (9-Mer Peptid bevorzugt) welches sind die Peptid-Längen, gebunden an MHC-ich Moleküle15,17. Vertreter Ergebnisse in Abbildung 5zu sehen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aldrich, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Tap-dependent+leader+peptide+recognized+by+alloreactive+T+cells+specific+for+a+class+Ib+antigen.">Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen.</a> Cell. 79 (4), 649-658 (1994).</li><li>Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD94/NKG2A+is+a+natural+killer+cell+receptor+for+the+nonclassical+major+histocompatibility+complex+(MHC)+class+I+molecule+Qa-1(b).">Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b).</a> J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).</li><li>Oliveira, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nonpolymorphic+MHC+Qa-1+mediates+CD8++T+cell+surveillance+of+antigen-processing+defects.">The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects.</a> J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).</li><li>Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+MHC+class+Ib-restricted+cytotoxic+T+cells+monitor+antigen+processing+in+the+endoplasmic+reticulum.">Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum.</a> Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).</li><li>Hu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+regulatory+CD8+T+cells+in+Qa-1-deficient+mice.">Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice.</a> Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).</li><li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+immunity+by+a+novel+population+of+Qa-1-restricted+CD8alphaalpha+TCRalphabeta++T+cells.">Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells.</a> J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).</li><li>Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+arthritis+through+mobilization+of+peptide-specific+CD8++regulatory+T+cells.">Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells.</a> J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).</li><li>Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specificity+of+T+cell+regulation+that+enables+self-nonself+discrimination+in+the+periphery.">The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).</li><li>Panoutsakopoulou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+autoimmune+disease+after+vaccination+with+autoreactive+T+cells+that+express+Qa-1+peptide+complexes.">Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes.</a> J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).</li><li>Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-TCR+antibody+treatment+activates+a+novel+population+of+nonintestinal+CD8+alpha+alpha++TCR+alpha+beta++regulatory+T+cells+and+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).</li><li>Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disruption+of+CD8++Treg+activity+enhances+the+immune+response+to+viral+infection.">Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Non-classical+Myelin+Epitopes+to+Treat+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Sci Rep. 6, 36064 (2016).</li><li>Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+and+host+factors+involved+in+the+major+histocompatibility+complex+class+Ib-restricted+presentation+of+Salmonella+Hsp+60:+novel+pathway.">Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway.</a> Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleocapsid+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+is+a+potent+human+CD8++T+cell+antigen+and+elicits+memory+responses.">The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses.</a> PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).</li><li>Schumacher, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+selection+by+MHC+class+I+molecules.">Peptide selection by MHC class I molecules.</a> Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).</li><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages.">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Guo, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+length+peptides+bind+to+HLA-Aw68+similarly+at+their+ends+but+bulge+out+in+the+middle.">Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle.</a> Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).</li><li>Soloski, M. J., Metcalf, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+class+Ib+molecules+in+the+host+response+to+infection+with+Salmonella+and+its+relevance+to+autoimmunity.">The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity.</a> Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).</li><li>Smith, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+use+endocytic+pathway+for+cross-priming+class+Ib+MHC-restricted+CD8alphaalpha+TCRalphabeta++T+cells+with+regulatory+properties.">Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties.</a> J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).</li><li>Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+fine+specificity+of+the+immune+response+to+a+Plasmodium+falciparum+rhoptry+neck+protein,+PfAARP.">Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP.</a> Malar J. 15, 457 (2016).</li><li>Kambayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nonclassical+MHC+class+I+molecule+Qa-1+forms+unstable+peptide+complexes.">The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes.</a> J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).</li></ol>

Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Hier haben wir ein Protokoll für die Analyse von Qa-1 Epitope in einem Protein beschrieben. In Bezug auf dieses Protokoll wurden mehrere andere Strategien auch zuvor gemeldet. Erstens die allogene CD8+ T-Zell-Linien und Klone wurden für die Identifizierung des Qdm1verwendet. Zweitens wurde ein vermeintlicher QS-1-Bindung-Motiv aus der Analyse der Qdm für die Identifizierung von HSP60p216-224 und eine TCRBV8.1 Epitop9,18verwen...

QS-1 gehört zu einer Gruppe von nicht-klassischen großen Histocompatibility complex 1 b (MHC-Ib) Moleküle in den Mäusen. Seine menschliche Homolog ist HLA-E. Vorherigen Nachweis hat gezeigt, dass QS-1-Moleküle wichtige biologische Funktionen haben. Erstens, QS-1-Moleküle spielen eine wichtige Rolle in der Vermessung Zellen für strukturelle und funktionelle Integrität. QS-1-Moleküle haben in diesem Zusammenhang mehrere Strategien, um die normale Funktion einer Zelle überwachen entwickelt. Eine solche Strategie ermöglicht QS-1-Moleküle zu Form-komplexe mit einer verarbeiteten Führer Peptid (Epitop), d.h. der QS-1 Determinante Modifikator (Qdm), die von klassischen MHC-Ia-Moleküle in das endoplasmatische Retikulum1verarbeitet wird. Diese QS-1/Qdm komplexe später auf der Oberfläche einer Zelle anzeigen und binden an hemmenden NKG2A Rezeptoren auf NK-Zellen, NK Aktivität2töten zu hemmen. Wenn die Expression von MHC-Ia Moleküle verloren geht, wird eine Zelle (z. B. eine maligne Zelle) empfindlich auf NK2töten. Die andere Strategie ermöglicht QS-1-Moleküle zu bilden neue QS-1/Epitop komplexe auf der Oberfläche einer Zelle, die einen Mangel an TAP (Transporter mit Antigen Verarbeitung verbunden) ist3 und/oder ERAAP (endoplasmatische Retikulum Aminopeptidase zugeordnet Antigen Processing)4 (beide Mängel treten oft in bösartiger Zellen). Die Zelle, die diese neuen QS-1/Epitop komplexe drückt dann erkannt und eliminiert durch die Epitop-spezifischen CD8 QS-1-eingeschränkt werden kann+ T Zellen. Zweitens, induzieren QS-1-Moleküle Immunregulation5. In diesem Zusammenhang Qa-1/Epitop-komplexe haben gezeigt, dass CD8 stimulieren+ regulatorische (Treg) T-Zellen, die wichtig für die Vermeidung von immunvermittelte Schäden selbst-Gewebe6,7,8 ,9,10. Drittens, QS-1-eingeschränkt CD8+ Treg Zellen gezeigt worden, haben um Immunantworten gegen virale Infektion11zu begrenzen.
Daher bestimmte Vermehrung der Epitop-spezifische QS-1-Restrictred CD8+ T Zellen ist eine potenziell vielversprechende Strategie für die Beseitigung von abnormen Zellen, für die Verbesserung der Immunregulation und für die Kontrolle des Ausmaßes der Virus-induzierte Immunantwort. Während es steht nicht fest ob Brustvergrößerung Epitop-spezifischer CD8 QS-1-eingeschränkt+ T Zellen erweitern Immunüberwachung und Virus-induzierte Immunantwort zu begrenzen können, unsere Labore und andere haben eindeutig gezeigt, dass Immunisierung mit QS-1 Epitope kann die Funktion des QS-1-eingeschränkt CD8 ergänzen+ Treg Zellen spezifische für pathogene autoimmune CD4+ T Zellen, führt zu effizienten Kontrolle von CD4+ T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen in eine Vielzahl von Tier-Modelle wie experimentelle allergische Enzephalomyelitis (Tiermodell der menschlichen multiplen Sklerose)6,10, Kollagen-induzierte Arthritis (einem Tiermodell der menschlichen rheumatoide Arthritis)7, und nicht adipösen Diabetes (Tiermodell für menschliche Typ 1 Diabetes)8. Darüber hinaus haben wir entdeckt, dass die Immunisierung mit einem gewebespezifischen Qa-1 Epitop führt zu spezifischen Kontrolle der immun-vermittelte Entzündung in diesem Gewebe durch Vermehrung der CD8+ Treg Zellen12. Die oben genannten Erfolge von präklinischen Studien zeigen eine Notwendigkeit für eine umfassende Bewertung der QS-1 Epitop Immunisierung für die Behandlung von gewebespezifischen immunvermittelte Erkrankungen und möglicherweise für die Behandlung von anderen Erkrankungen im Zusammenhang mit Mängeln in Hahn und ERAAP.
Dementsprechend gibt es ein Bedarf für eine Technologie, die zuverlässig und schnell Qa-1 Epitope in einem Protein analysieren kann. In diesem Zusammenhang wurde eine begrenzte Anzahl von biologisch wichtigen Epitope Qa-1 beschrieben. Die meisten dieser QS-1-Epitope wurden während des Studiums der CD8 serendipitously identifiziert+ T Zelle Antworten auf Bakterien13, einen Mangel an TAP3Zellen und Zellen einen Mangel an ERAAP4Zellen, die dazu führen, EAE6dass, 9. Daher ist eine hoher Durchsatz-Technik für die Identifizierung von biologisch wichtigen QS-1-Epitopen in einem definierten Protein wünschenswert. Im folgenden beschreiben wir eine überlappende Peptid (OLP) Bibliothek-Strategie, die funktionale Qa-1 Epitope in einem Protein mit QS-1-Resrticted CD8 Karten+ T-Zell-Linien bestimmten für den OLP-Pool (OLP_pool) eines Proteins.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>The protein to be analyzed</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequence of the protein can be obtained from NCBI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: D2650 SIGMA</td>
			<td>DMSO should be sterile and cell culture tested.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kb-/-Db-/- mice</td>
			<td>The Lackson Laboratory</td>
			<td>Stock#: 019995</td>
			<td>We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIM V Serum Free Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 12055091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential Amino Acids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11140076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11333D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Gel P-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat#: 150-4171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoshate Balanced Solution (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trasfer pipette</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>Mfg#: 137238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat#: 315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well tissue culture plates</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>Cat#: CC7682-7548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: Z372129 Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml deep 06-well PP plate, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>Item#: 1896-1110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat#: 212-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-7</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat#L: 217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capture anti-IFN-&#947; antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat#: 551881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISPOT plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: S2EM004M99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1R</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>Cat#: ATCC CRL-1993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1R.Qa-1b</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qa-1 lentiviral vector</td>
			<td>GeneCopoeia</td>
			<td>Product#: Mm02955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection anti-IFN-&#947; antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat#: 551881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat#: BD557630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC substrate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat#: 551951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoSpot Analyzer</td>
			<td>ImmunoSpot</td>
			<td></td>
			<td>Any immunoSpot analyer should work for this purpose.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overlapping peptide library to map qa-1 epitopes in a protein

QS-1 (beim Menschen HLA-E) gehört zu einer Gruppe von nicht-klassischen großen Histocompatibility complex 1 b (MHC-Ib) Moleküle. Aktuellen Daten geht hervor, dass QS-1-Molekülen in Zellen für strukturelle und funktionelle Integrität Vermessung, induzierende Immunregulation und Begrenzung der Immunantwort auf virale Infektionen eine wichtige Rolle spielen. Darüber hinaus funktionale Augmentation des QS-1-eingeschränkt CD8+ T-Zellen durch Epitop Immunisierung hat therapeutische Effekte in mehreren Autoimmunerkrankung Tiermodellen, z.B. experimentelle allergische Enzephalomyelitis gezeigt Kollagen-induzierte Arthritis und nicht adipösen Diabetes. Daher gibt es eine dringende Notwendigkeit für eine Methode, die schnell und effizient funktionelle QS-1-Epitope in einem Protein identifizieren kann. Hier beschreiben wir eine Protokoll, das QS-1-eingeschränkt CD8 nutzt+ T-Zell-Linien für eine überlappende Peptid (OLP)-Bibliothek für die Bestimmung der QS-1 Epitope in einem Protein spezifisch. Diese OLP-Bibliothek enthält 15-Mer überlappende Peptide, die die gesamte Länge eines Proteins zu decken, und angrenzenden Peptide eine Überlappung von 11 Aminosäuren. Unter Verwendung dieses Protokolls, haben wir vor kurzem eine 9-Mer Qa-1 Epitop in Myelin Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG) identifiziert. Diese neu zugeordnete MOG QS-1-Epitop zeigte sich Epitop-spezifische, QS-1-eingeschränkt CD8 induzieren+ T-Zellen, dass verbesserte Myelin-spezifische Immunregulation. Daher eignet sich dieses Protokoll für zukünftige Untersuchung neuartiger Ziele und Funktionen des QS-1-eingeschränkt CD8+ T Zellen.

Entwurf einer OLP-Bibliothek, die über die gesamte Länge eines Proteins
Beginnend am N-Terminus eines Proteins, ist jedes Peptid 15 Aminosäuren (15-Mer). Daher umfasst das erste Peptid Position 1 auf Position 15. Der N-Terminus des zweiten Peptids überschneidet sich mit dem C-Terminus des ersten Peptids durch 11 Aminosäure. Daher umfasst das zweite Peptid die Position 5 auf Position 19. Entwerfen Sie den Rest der Peptide bis z...

Watch this Scientific Journal Video about Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein at JoVE.com

Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

Überlappende Peptid-Bibliothek zuordnen Qa-1 Epitope in einem Protein

QS-1 (beim Menschen HLA-E) gehört zu einer Gruppe von nicht-klassischen großen Histocompatibility complex 1 b Moleküle. Immunisierung mit QS-1-Bindung Epitope nachweislich erweitern gewebespezifischen Immunregulation und mehrere Autoimmunerkrankungen zu verbessern. Hier beschreiben wir eine überlappende Peptid Bibliothek Strategie zur Identifikation des Qa-1 Epitope in ein Protein.

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules ...

overlapping-peptide-library-to-map-qa-1-epitopes-in-a-protein

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.8K Aufrufe.  Loma Linda University. QS-1 (beim Menschen HLA-E) gehört zu einer Gruppe von nicht-klassischen großen Histocompatibility complex 1 b Moleküle. Immunisierung mit QS-1-Bindung Epitope nachweislich erweitern gewebespezifischen Immunregulation und mehrere Autoimmunerkrankungen zu verbessern. Hier beschreiben wir eine überlappende Peptid Bibliothek Strategie zur Identifikation des Qa-1 Epitope in ein Protein.

Serie: Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

Verwendung von Interferon-γ enzyme-linked immunospot Assay zur Novel T-Zell-Epitope des humanen Papillomvirus Charakterisieren

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; AGB in einen engeren Bezug zu den Mukoviszidose-Lunge

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

Gesamtproteinextraktion und 2-D Gelelektrophorese-Methoden für<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arten

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

Eine schnelle Methode zur Blutverarbeitung die Ausbeute an Plasma-Peptidkonzentrationen im menschlichen Blut zu erhöhen

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-spezifischen CD8<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen in Rhesusaffen von Peptid-MHC-I Tetramerfärbung

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

Schaffung einer dichten Transposon Insertion Bibliothek verwenden bakterielle Konjugation in Enterobacterial Stämme wie Escherichia Coli oder Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Überexpression und Reinigung des Menschen<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

Sezieren Signalisierung Multi-Protein-komplexe durch eine Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...