Die Autoren möchten die Studienteilnehmer und ihre Eltern zu danken. Wir möchten auch Dr. Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Kanada) für den Zugang zu seiner ELISpot-Leser, Dr. Lubo Alexandrov für die statistische Analyse danken und Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois und Martine Caty für technische Experten Unterstützung. Unterstützt durch Zuschüsse aus le Fonds d&#39;Opération pour les Projets de recherche et d&#39;Clinique EVAlution des Technologien (CHU Sainte-Justine) an HS und PO, von la Fondation Centre de Cancérologie Charles-Bruneau, und von der Leukemia &amp; Lymphoma Society of Kanada. ISF wurde von Stipendien von la Fondation CHU Sainte-Justine und le Fonds de la recherche du Québec-santé (FRQS) unterstützt. AJG war der Empfänger der Stipendien von der Abteilung für Mikrobiologie, Infektiologie und Immunologie, Université de Montréal (Gabriel Marquis-Stipendium), FRQS und die Canadian Institutes of Health Rorschung (CIHR). NM wurde von la Fondation CHU Sainte-Justine, der Cole-Stiftung und FRQS unterstützt.

Das Forschungsprotokoll wurde von der Ethik Institutional Review Board von CHU Sainte-Justine in Montreal, Quebec, Kanada, wo die Studie durchgeführt wurde genehmigt. Informierte Zustimmung wurde gesucht und von allen Studienteilnehmern, deren Eltern oder Erziehungsberechtigten erhalten. Alle Verfahren durchgeführt an den Tagen 1 und 2 müssen unter sterilen Bedingungen (dh unter einem Abzug mit laminarer Strömung) durchgeführt werden. Standard-Sicherheitsvorkehrungen im Umgang mit menschlichem Blut sollte unbedingt beachtet werden. 1. Beschichtung der Platten <ol><li> Permeabilisieren Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen an der Unterseite 96 sowie IP-Multiscreen-Platten weiße ELISpot, indem zu jedem Well 20 &amp;mgr; l 35% Ethanol für 1 min. Membranen sollten leicht durchscheinend geworden. </li><li> Sofort die Wells 3-mal mit 200 ul 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) mit einem mulChannel-Pipette oder einer ähnlichen Einrichtung. Dieser Schritt ist wichtig, dass Ethanol gegeben Rückstände können die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen und Bindung von Capture-Antikörper. ELISpot Platten sind empfindlich und sollte sorgfältig behandelt werden: die Verwendung eines automatisierten Plattenwasch wird nicht empfohlen. </li><li> Beschichtung der Vertiefungen mit 10 &amp;mgr; l gereinigtem Maus-Anti-Human-IFN-γ-Capture-Antikörper in 1 × PBS auf eine Endkonzentration von 10 ug / ml verdünnt. Decken Sie die Platten mit regelmäßigen Plastikfolie und Inkubation über Nacht bei 4 ° C </li></ol> 2. Sperrplatten <ol><li> Leeren Sie den Brunnen, tippen sie trocken, und waschen Platten 5 mal mit 200 ul 1x PBS. </li><li> Füllen der Vertiefungen mit 200 ul vollständigem RPMI-1640-Medium und Inkubation Platten für 2 Stunden bei 37 ° C (Blockbildungsschritt). </li><li> Waschen Sie die Platten 5x mit 200 ul 1x PBS und halten die Brunnen voller 1x PBS, bis die Zellen bereit sind, beschichtet werden. </li></ol> 3. Überzug und Zellstimulation <ol><li> Bereiten peripheral mononukleare Blutzellen (PBMC) aus menschlichen Blutproben durch Zentrifugation auf Ficoll-Paque-Gradienten unter Verwendung von Standardverfahren. Alternativ kann unter Verwendung von Standardverfahren, auftauen Aliquots von PBMC unter flüssigem Stickstoff eingefroren. Nach der letzten Zentrifugation Die Zellen in einer Endkonzentration von 2 x 10 6 Zellen / ml beimpft und über Nacht bei 37 ° C unter einer 5% CO 2-Atmosphäre in einem Wassermantel-Inkubator. </li><li> Entfernen PBMC aus dem Inkubator und resuspendieren sie in einem Endvolumen von 5 ml vollständigem RPMI-1640-Medium. </li><li> Inkubieren PBMC in Gegenwart von 10 ul gentechnisch Endonuklease aus Serratia marcescens für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie ein 50 ul Aliquot PBMC und mit 50 ul Trypanblau mischen. Zählen von Zellen und schätzen% Lebensfähigkeit mit einem Hämocytometers und mikroskopische Untersuchung (Farbausschlussmethode). Verschiedene automatisierte Verfahren zur Zellzählung und Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen kann also verwendet werden. PBMC sollte&gt; 95% lebensfähig. Entsorgen Probe, wenn die Lebensfähigkeit unter 95% liegt. </li><li> PBMC Zentrifuge bei 700 × g für 5 Minuten, Verwerfen Standes und Resuspension Zellen in AIM-V-Medium mit 2% (v / v) inaktiviertes Humanserum (HIS) ergänzt war, bei einer Endkonzentration von 2 x 10 6 Zellen / ml. Halten bei 37 ° C bis zur Stimulation Mischungen werden auf die Platte gegeben. </li><li> In den Vertiefungen, ein Tropfen auf einmal 100 ul der geeigneten Stimulations Mischung. Drei Stimulations Mischungen verwendet, wie unten beschrieben: <ol><li> Verwendung AIM-V-Medium mit 2% (v / v) inaktiviertes Humanserum (IHS) als Negativkontrolle ergänzt. </li><li> Verwenden monoklonalen Anti-CD3-Antikörper (Klon OKT3) in AIM-V-Medium verdünnt, mit 2% (v / v) ergänzt IHS zu einer Endkonzentration von 0,5 ug / ml als positive Kontrolle). </li><li> VZV-Antigen zu verwenden, in der Form von entweder γ-bestrahlten (10.000 Gy, 30 min Belichtungszeit) attenuierte VZV-Impfstoff (1.350 Plaque-bildende Einheiten [pfu] / ml) Verdünnungsted 1:200 in AIM-V-Medium mit 2% (v / v) IHS) oder 1 &amp;mgr; g einer äquimolaren Mischung von 67 Peptiden (15 Aminosäurereste), synthetisiert auf Basis der Sequenz des VZV unmittelbar frühen (IE63) ergänzt Phosphoprotein . Steuerung Bestrahlung durch Überwachen der Wirksamkeit ohne sichtbare Anzeichen von zytopathischen Wirkungen nach 4 Tagen in PBMC-Kulturen. </li><li> Bereiten Sie alle Brunnen in zweifacher Ausfertigung. </li></ol></li><li> In den Vertiefungen, ein Tropfen auf einmal 100 ul Zellen in Schritt 5.4 in die entsprechenden Vertiefungen hergestellt. Zwei Brunnen sollte ohne Zellen (Negativkontrolle) überlassen werden. Inkubation für 20 Stunden bei 37 º C unter einer 5% CO 2-Atmosphäre in einem Wassermantel-Inkubator. Nicht schütteln, verschieben oder stapeln Sie die Platten auf einander während der Inkubation. </li></ol> 4. Spot-Entwicklung und-Erkennung <ol><li> Entsorgen Sie die Zellen und waschen die Platten 10x mit 1x PBS, ergänzt mit 0,05% (v / v) Tween 20 (PBST). Tween 20 hilft lösen Zellen, die PVDF mir anhaftenmbrane folgenden Inkubation über Nacht. </li><li> Verwendung einer Mehrkanalpipette, mit 100 ul 0,5 mg / ml Biotin-konjugiertem Anti-IFN-γ monoklonalen Antikörper (Klon 4S.B3) in 1x PBS, enthaltend 0,5% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA). Inkubation erfolgt für 2 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen 6x mit PBST und fügen Sie jedem gut 100 ul Streptavidin conjugatd mit alkalischer Phosphatase 1:1000 verdünnt in 1x PBS mit 0,5% (w / v) BSA. Die Platten abdecken und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Platten 3x mit PBST und 3x mit 1x PBS. 100 l einer 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) / Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT)-Substrat-Lösung, Inkubation 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Unter fließendem destilliertem Wasser waschen die Teller. Entfernen Sie den unteren Teil des ELISpot Platte und waschen Sie beide Seiten der Membran mit destilliertem Wasser. Luft trocknen die Platten. </li><li> Untersuchen Sie die Brunnen und die Punkte aufzählen, mit einem stereoskopischen dissection Mikroskop oder scannen die Platten mit Hilfe eines automatisierten Punktzähler. Halten Sie die Platten weg vom Licht, wenn sie nicht am selben Tag untersucht werden. <ol><li> Der Mittelwert der Anzahl von Flecken in entsprechenden doppelten Vertiefungen gezählt und subtrahiert die Anzahl von Punkten in der negativen Kontrollvertiefungen gezählt (keine Zellen) von der Anzahl der Punkte in den Testvertiefungen gezählt. </li><li> IFN-γ Express Produktion wie die Anzahl der spot-bildenden Einheiten (SFU) pro 10 6 PBMC. </li><li> Bedenken Sie, dass Proben sind positiv, wenn die Anzahl der SFU&gt; 50 pro 10 6 PBMC und 2 Standardabweichungen (SD) über der Negativkontrolle (Zellen + AIM-V-Medium mit 2% (v / v) ergänzt IHS). </li><li> Verwenden Sie einen Wert von 400 pro SFU gut, wenn zu viele Punkte zu zählen sind. </li></ol></li><li> Testen Sie, ob ELISpot Daten normal verteilt sind oder nicht mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test. Wenn die Daten normal verteilt sind, führen statistische Vergleiche mit Student-t-test (2 Gruppen) oder ANOVA und der Bonferroni Post-Test (multiple Vergleiche). Wenn die Daten nicht normalverteilt sind, verwenden Sie den Mann-Whitney-U-Test (2 Gruppen) oder dem Kruskal-Wallis-Test und Dunn Post-Test (multiple Vergleiche). </li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Modifikationen und Fehlerbehebung: IFN-γ ELISPOT-Tests wurden verwendet, um die zellvermittelte Immunantwort gegen eine Vielzahl von mikrobiellen Krankheitserregern, einschließlich der menschlichen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1), 24,25, Hepatitis-C-Virus (HCV) 26 gerichtet zu untersuchen, 27, 28,29 und Mycobacterium tuberculosis, um nur einige zu nennen. Hier beschrieben wir die Entwicklung eines IFN-γ ELISPOT-Assay auf zelluläre Immunität gegen zu messen, mit der Hoffn...

Zuerst im Jahr 1989 durchgeführt wird, UCBT zunehmend als Teil der Behandlung von verschiedenen Tumor nichtneoplastische und Blutkrankheiten bei Kindern von 1 verwendet. VZV ist ein zytopathischen menschlichen Alphaherpesvirus, das zwei verschiedene Krankheiten, Varizellen (nach der Primärinfektion) und Herpes zoster (nach Reaktivierung) verursacht. Nach der Primärinfektion, bleibt VZV während der gesamten Lebensdauer des Host innerhalb sensorischen Nerven der Hinterwurzelganglien geschützt. Eine der bedrohlichsten Infektions Komplikationen nach UCBT mit VZV 4.2 verbunden. In unserem Klinikum, in Ermangelung von VZV-Prophylaxe, die kumulative Inzidenz von VZV-Erkrankung VZV Krankheit nach 3 Jahren postUCBT 46% 2. Bei diesen Patienten ist die de novo-Infektion oder Reaktivierung von VZV oft mit viszeralen Verbreitung des zentralen Nervensystems, der Lunge und der Leber 5-7 verbunden. Als ein Ergebnis, Aciclovir, Valaciclovir oder Famciclovir Prophylaxe wird allgemein UB verwaltetCT-Empfänger 8,9. Allerdings ist diese Behandlungsstrategie berücksichtigt nicht das Schutzpotential von VZV-spezifischen T-Lymphozyten oder die Kinetik der Wiederherstellung der VZV-spezifischen T-Zellreaktionen. Mögliche Probleme mit der expandierenden Verwendung von langfristigen Prophylaxe antiherpetischen verbunden sind, umfassen: a) Patientenübertherapie; b) die Entwicklung von antiviralen Medikamentenresistenz 10,11; und c) Wertminderung von VZV-spezifische Immun Rekonstitution 12,13. Weil Erkennung von Funktions VZV-spezifischen T-Lymphozyten korreliert mit der Anwesenheit von langfristigen Schutz von VZV-Infektion und verbesserte klinische Ergebnis 4,14,15, Monitoring-Zell-vermittelten Immunantwort gegen VZV gerichteten während der Posttransplantationsphase könnte in einer rationelleren Verwendung von antiviralen führen Behandlung, indem Ärzte, Patienten, die von VZV-Prophylaxe profitieren würden, unterscheiden sich von denen, deren Immunsystem ist in der Lage zu kontrollieren VZV-Replikation 4,13. Die IFN-γ ELISPOT-Assay wird häufig für die Überwachung zellvermittelte Immunreaktionen in einer Vielzahl von experimentellen Systemen und klinischen Bedingungen verwendet. Punkte werden durch die Spaltung eines chromogenen Substrat erzeugt, wodurch ein sichtbarer Niederschlag und stabil an der Stelle der Reaktion. Jeder Spot stellt damit den Platzbedarf eines einzelnen Zytokin-produzierenden Zelle. IFN-γ ELISPOT misst nicht nur die Fähigkeit der einzelnen Zellen ex vivo IFN-γ in Antwort auf in vitro-Stimulation mit verwandten Antigen produzieren, sondern es stellt auch eine Abschätzung der Frequenz des reagierenden Zellen in einer gegebenen Zellpopulation 16,17. Zusätzlich zu seiner hohen Empfindlichkeit, IFN-γ ist ELISpot unkompliziert durchzuführen, wodurch ihre Anwendung im Rahmen der personalisierten klinische Protokolle zu lenken Beginn oder nach Absetzen der antiviralen Behandlung richtet möglich. Das Verfahren unter describ detailliertes ein ELISpot Assay, der speziell entwickelt wurde, um durch periphere mononukleare Blutzellen erkennen und messen die Produktion von IFN-γ nach in vitro Stimulation mit VZV-Antigenen abgeleitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leucocep tube</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">89048-936/89048-932</td>
			<td style="width:397px;">12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:101px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:143px;">17-1440-02</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:101px;">Novagen</td>
			<td style="width:143px;">70746-3</td>
			<td>Keep at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MultiScreenHTS-IP Filter Plate</td>
			<td style="width:101px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">MSIPS4W10</td>
			<td>Sterile with pore size of 0.45 &#181;m.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti-human IFN-&#947; capture antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">551221</td>
			<td>NIB42 clone.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pepmix VZV IE63&#160;</td>
			<td style="width:101px;">JPT Peptide Technologies</td>
			<td style="width:143px;">PM-VZV-IE63</td>
			<td>Dissolve contents of one vial in 40 &#956;L of DMSO. Use within 6 months.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-conjugated anti-IFN-&#947; monoclonal antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">554550</td>
			<td>4SB3 clone.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-3554</td>
			<td>Dilute for use on the same day.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BCIP/NBT</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-6432</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an ifn-&#947; elispot assay to assess varicella-zoster virus-specific cell-mediated immunity following umbilical cord blood transplantation

Varizella-Zoster-Virus (VZV) ist eine bedeutende Ursache für Morbidität und Mortalität nach Nabelschnurblut-Transplantation (UCBT). Aus diesem Grund wird antiherpetischen Prophylaxe systematisch pädiatrischen UCBT Empfänger verwaltet zu Komplikationen mit VZV-Infektion zu verhindern, aber es gibt keine starken, evidenzbasierten Konsens darüber, dass die optimale Dauer definiert. Da T-Zell-vermittelte Immunität ist für die Kontrolle der VZV-Infektion, die Beurteilung der Rekonstitution von VZV-spezifischen T-Zellreaktionen nach UCBT könnten Hinweise, ob Prophylaxe sollte beibehalten werden oder abgebrochen werden können. Zu diesem Zweck wurde eine VZV-spezifischen Interferon-gamma (IFN-γ), Enzyme-linked immunospot (ELISPOT)-Assay entwickelt, um die IFN-γ-Produktion durch T-Lymphozyten als Antwort auf in vitro-Stimulation mit bestrahlten lebenden abgeschwächten VZV-Vakzine kennzeichnen. Dieser Test bietet eine schnelle, reproduzierbare und empfindliche Messung der VZV-spezifischen cell-vermittelte Immunität für die Überwachung der Wiederherstellung der VZV-spezifischen Immunität in einer klinischen Umgebung und die Bewertung der Immunantwort gegen VZV-Antigene.

Die IFN-γ ELISPOT-Protokoll oben beschrieben entwickelt wurde und in unserem Labor optimiert, um das Ausmaß und die Qualität der zellvermittelten Immunreaktionen gegen VZV 4 gerichtet messen. Verschiedenen Quellen der VZV-Antigen zur Stimulation Schritt verwendet werden. Dazu gehören: a) im Handel erhältlich Waschmittel inaktiviert Auszüge aus VZV-infizierten Vero-Zellen 18; b) Pools von überlappenden synthetischen Peptiden, die aus spezifischen VZV kodierten Proteine, einschließlich IE63 <...

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Development of an IFN-&amp;#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Neue Generationen von Funktionstests, wie Gamma-Interferon (IFN-γ) ELISpot, die Zytokin-Produktion zu erkennen an der Einzelzellebene und bieten sowohl quantitative und qualitative Charakterisierung der T-Zell-Reaktionen können zum Zell-vermittelten Immunantworten gegen Varicella-Zoster-gerichtet zu bewerten Virus (VZV).

Entwicklung eines IFN-γ ELISPOT-Assay zu beurteilen, Varicella-Zoster-Virus-spezifische Zellvermittelte Immunität nach Nabelschnurblut-Transplantation

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

development-an-ifn-elispot-assay-to-assess-varicella-zoster-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

15.5K Aufrufe.  Université de Montréal.  Neue Generationen von Funktionstests, wie Gamma-Interferon (IFN-γ) ELISpot, die Zytokin-Produktion zu erkennen an der Einzelzellebene und bieten sowohl quantitative und qualitative Charakterisierung der T-Zell-Reaktionen können zum Zell-vermittelten Immunantworten gegen Varicella-Zoster-gerichtet zu bewerten Virus (VZV). 

Serie: Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantifizierung von Th-1 zelluläre Immunantworten gegen mikrobielle Antigene

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

Ausbau zytotoxische T-Lymphozyten aus Nabelschnurblut, dass Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus und Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Klinische Anwendung der<em&gt; Dornröschen</em&gt; Und künstliche Antigen präsentierenden Zellen genetisch zu verändern T Zellen aus dem peripheren und Nabelschnurblut

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Einhaltung Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are used for host defense. For the quantitative determination of the functional status of the humoral immune response of an individual, both serum Abs and circulating ASCs are commonly measured as functional readouts. In humans, peripheral blood is the most convenient and readily accessible sample that can be used for the determination of the humoral immune response elicited by host B cells. Distinct B-cell subsets, including ASCs, can be isolated directly from peripheral blood via selection with lineage-specific Ab-conjugated microbeads or via cell sorting with flow cytometry. Moreover, purified na&#239;ve and memory B cells can be activated and differentiated into ASCs in culture. The functional activities of ASCs to contribute to Ab secretion can be quantified by ELISpot, which is an assay that converges enzyme-linked immunoabsorbance assay (ELISA) and western blotting technologies to enable the enumeration of individual ASCs at the single-cell level. In practice, the ELISpot assay has been increasingly used to evaluate vaccine efficacy because of the ease of handling of a large number of blood samples. The methods of isolating human B cells from peripheral blood, the differentiation of B cells into ASCs in vitro, and the employment of ELISpot for the quantification of total IgM- and IgG-ASCs will be described here.

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Die Verwendung eines Monozyten einschichtiges Assay Fcy rezeptorvermittelte Phagozytose zur Bewertung

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

Zika-Virus spezifische diagnostische Epitop Entdeckung

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...