Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Busch Biomedical Grant, NSF gewähren IBN-0548543, NSF gewähren IBN-0919747, March of Dimes Foundation Grant 1-FY04-107, March of Dimes Foundation Grant 1-FY08-464 (zum BLF) unterstützt. MKK und CGL wurden von NIH Biotechnology Training Grant T32 GM008339-20 unterstützt, und CGL wurde auch durch eine NJ Kommission Rückenmarksforschung Promotionsstipendium 08-2941-SCR-E-0 unterstützt.

1. Bevor Sie beginnen: 1) E18 Ratte Dissektion: Standard-Dissektion Methoden der E18 Hippocampus-Neuronen wurden bisher 13 beschrieben. Um die Bonfire-Programm verwenden, um die morphologischen Merkmale der Neuriten zu analysieren, müssen 8 Bit. Tif Bilder von einzelnen Neuronen gewonnen werden. Dies kann in eine Reihe von Möglichkeiten in Abhängigkeit von der experimentellen Protokoll Sie folgende durchgeführt werden. Neuronen können auf einem ausreichend niedrigen Dichte ausplattiert werden, so dass einzelne Nervenzellen im Mikroskop Feld. Alternativ zum Bild einzelner Neuronen, die in einer dichten Kultur gezüchtet werden können Neuronen, transfiziert mit einer Vielzahl von Transfektionsmethoden mit einem Plasmid kodierend für ein fluoreszierendes Protein. 2) Software und Installation: <ol class="ualpha"><li> Die NeuronJ Plugin für den ImageJ Software von NIH und NeuronStudio müssen beide installiert, um die Bonfire-Programm ausgeführt werden. Die Software-Pakete können auf den folgenden Webseiten gefunden werden: ImageJ - <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> NeuronJ - <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> NeuronStudio - <a href="http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html">http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html</a> </li><li> Die Bonfire Programm finden Sie unter http://lifesci.rutgers.edu/ ~ Firestein gefunden werden. Die Bonfire Benutzerhandbuch ist auch auf dieser Website zur Verfügung. Darüber hinaus kann der Erstbeschreibung Bonfire in Langhammer et al, Cytometry 2010 gefunden werden. Alle unsere Daten wurden analysiert mit Hilfe eines Windows-Betriebssystems. </li></ol> 3) Bildauflösung Einstellung: Sie müssen die Bonfire-Programm auf das Bild Auflösung der Bilder, die Sie analysieren möchten Basis einstellen. In der bonfire_parameters Teil der Bonfire-Programm, ersetzen Sie den aktuellen Wert für die Variable pix_conv mit dem Wert der Bildauflösung (um / Pixel) der Bilder. 2. Dateistruktur: Damit Bonfire, um Ihre Daten zu analysieren, müssen die Dateien in diesem speziellen Struktur (Abbildung 2) organisiert werden. Sie haben: <ul><li> Ein Master-Ordner </li><li> Sub-Ordner (mit allen Ihren anderen Bedingungen) </li><li> Zell-Image-Dateien (filename.tif-Dateien) in den verschiedenen Zustand Ordnern </li><li> A Bonfire Ordner mit den Bonfire Matlab mfiles (auch in der Master-Ordner enthalten) </li></ul> 3. Tracing Neuronen in NeuronJ: <ol><li> Bereiten Sie das Bild für die Rückverfolgung <ol class="lalpha"><li> Öffnen Sie das Bild, indem Sie die Schaltfläche &quot;Öffnen&quot; auf der NeuronJ Symbolleiste und wählen Sie das Bild wie zu verfolgen würden. </li><li> Größe des Bildes, indem Sie den &#39;zu maximieren &quot;-Taste. </li><li> Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast des Bildes, so dass Sie alle der Neuriten, indem Sie &#39;Bild&#39; auf der NeuronJ Symbolleiste wählen Sie dann &quot;Anpassen von Helligkeit / Kontrast&quot; sichtbar machen kann. </li></ol></li><li> Verfolgen Sie die Zellkörper in NeuronJ und identifizieren die Spur als &quot;Typ 06&quot; <ol class="lalpha"><li> Wählen Sie den &quot;Add Traces&quot;-Taste auf der NeuronJ Symbolleiste. </li><li> Trace um den Umfang des Zellkörpers. </li><li> Wählen Sie das &#39;Label Durchzeichnungen &quot;-Taste auf der NeuronJ Symbolleiste. </li><li> Wählen Sie &#39;N1&#39; aus dem &#39;Tracing ID&#39; Dropdown-Menü. </li><li> Wählen Sie &quot;Typ 06&quot; in der NeuronJ: Attribute und wählen Sie &#39;OK&#39;. </li></ol></li><li> Verfolgen Sie die Neuriten in NeuronJ <ol class="lalpha"><li> Wählen Sie den &quot;Add Traces&quot;-Taste auf der NeuronJ Symbolleiste. </li><li> Fügen Sie eine Spur entlang jeder Neuriten Branche. Sie können nur die Dendriten oder das Axon, abhängig von Ihrem Experiment. </li><li> Wir schlagen vor, dass die Segmente Sie saugen an jeder Verzweigung zu stoppen, wobei jede Tochter Verzweigungspunkt ab diesem Zeitpunkt als eine neue Spur. </li><li> Wählen Sie den &#39;Save Durchzeichnungen &quot;-Taste auf der NeuronJ Symbolleiste. </li><li> Speichern Sie die Rückverfolgung Sie haben gerade in den gleichen Ordner wie die Original-Bilddatei erstellt. </li></ol></li><li> Exportieren Sie die Trace-Dateien und die Trace-Kennung Datei von NeuronJ Zwei Arten von Dateien müssen aus NeuronJ exportiert und gespeichert werden in den entsprechenden Zustand Ordner zusammen mit dem. Tif und. NDF-Dateien. <ol class="lalpha"><li> Wählen Sie den &quot;Export Trace&quot;-Taste auf der NeuronJ Symbolleiste. </li><li> Wählen Sie die &quot;Tab-deliminated Text-Dateien: separate Datei für jede Tracing&quot;-Option auf der &quot;NeuronJ: Export &#39;Dialog und wählen Sie&#39; OK &#39;. </li><li> Lassen NeuronJ, um die Namen der Dateien und den Speicherort wählen. </li><li> Wählen Sie die &quot;Measure Durchzeichnungen&quot;-Taste auf der NeuronJ Symbolleiste. </li><li> Wählen Sie das &#39;Display Tracing Messungen&#39; Option in der &#39;NeuronJ: Messungen &quot;und wählen Sie&quot; Ausführen &quot;. </li><li> Wählen Sie &#39;Datei&#39; in der &#39;NeuronJ: Durchzeichnungen &quot;-Fenster. </li><li> Wählen Sie &quot;Speichern unter&quot; und speichern Sie die Datei als Filename_info. &quot;Dateiname&quot; muss exakt mit dem Namen des Original-Bilddatei (einschließlich Groß-/Kleinschreibung) durch _info gefolgt und sollte nicht enthalten: 3-Letter-Datei-Erweiterung. Zum Beispiel für Originalbild Namen Cell20.tif, würde diese Datei mit dem Namen &#39;Cell20_info &quot;werden. Prüfen Sie, ob Ihr Computer nicht automatisch ein. Xls-Datei-Erweiterung. Ist dies der Fall, muss die Dateiendung manuell gelöscht werden. </li></ol></li></ol> 4. Verwenden Sie Bonfire vorläufigen SWC-Dateien aus NeuronJ Daten zu erstellen.: <ol><li> Reorganisieren Ordner mit &quot;bonfire_load&quot; <ol class="lalpha"><li> Öffnen Sie Matlab durch einen Doppelklick auf das Symbol. </li><li> Klicken Sie auf die &#39;&#39; Taste in der oberen rechten Ecke des Befehlsfenster. </li><li> Wählen Sie die &#39;Bonfire&#39; Ordner in Ihrem Master-Ordner in das Fenster &quot;Nach Ordner suchen&quot;. </li><li> Type &#39;bonfire_load&#39; in den Matlab-Befehl-Fenster und drücken Sie Enter. </li><li> Wählen Sie die Bedingung Ordner, den Sie in den &quot;Ordner suchen&quot;-Fenster zu analysieren, und wählen Sie &#39;OK&#39; wollen. </li><li> Dies wird die Ordner-Struktur durch die Schaffung von Zelle Unterordner mit allen Daten für jede einzelne Zelle neu zu organisieren. </li></ol></li><li> Erstellen filename_prelim.swc Dateien mit &#39;bonfire_ndf2swc &quot; <ol class="lalpha"><li> Type &#39;bonfire_ndf2swc &quot;in die Kommando-Fenster und drücken Sie Enter. </li><li> Wählen Sie den gleichen Zustand Ordner, den Sie gerade mit &#39;bonfire_load &quot;in der&quot; Ordner suchen &quot;-Fenster neu, und wählen Sie&#39; OK &#39;. </li><li> Dadurch entsteht ein. SWC-Datei in jede Zelle Ordner für die gewählte Zustand. Jede Zelle Ordner enthält nun 5 Dateien;. Ursprünglichen tif Bild, die NDF-Datei, die _info Schreibspuranzeiger-Datei, eine txt-Datei und eine SWC-Datei.... </li></ol></li></ol> 5. Verwenden Sie NeuronStudio zu Finalize SWC-Dateien.: <ol><li> Öffnen und kalibrieren Neuron Bilder in NeuronStudio <ol class="lalpha"><li> Öffnen Sie die NeuronStudio Programm. </li><li> Wählen Sie Datei → Öffnen der NeuronStudio Symbolleiste. </li><li> Finden Sie die. Tif Bild des Neurons Sie bearbeiten möchten, und öffnen Sie sie. </li><li> Wählen Sie Run → Einstellungen und geben Sie &#39;1 &#39;in jedem der 3 (X, Y, Z)-Boxen in den &quot;Voxel Size&quot;-Fenster. </li><li> Wählen Sie Datei → Import SWC. Wählen Sie die entsprechende. SWC-Datei. Die Image-Datei wird nun mit einer Spur Bild überlagert werden. Die Zelle soma sollte mit einem roten Kreis überlagert werden. </li></ol></li><li> Verwenden Sie NeuronStudio verlinken Neuriten <ol class="lalpha"><li> Nutzen Sie die Tools in NeuronStudio korrekt zu identifizieren Zweig-und Endpunkte (wir empfehlen, dass Sie mit NeuronStudio die Funktionen und Verknüpfungen werden vor der Analyse Ihrer Daten bekannt). </li><li> Insbesondere verwenden die &quot;Neuriten Werkzeug&quot;, um Knoten, so dass anzuschließen: <ul><li> Jeder Zweig Punkt (gelbe Knoten) können nur zwei Zweige </li><li> Alle Spuren sind kontinuierlich mit dem Soma (nur eine rote Knoten) </li></ul></li></ol></li><li> Exportieren von Daten aus NeuronStudio <ol class="lalpha"><li> Wählen Sie Datei → Speichern Neuriten (speichern als die Standard-name). </li></ol></li><li> Überprüfen Sie auf Fehler in. SWC-Dateien mit &#39;bonfire_trace_check &quot; <ol class="lalpha"><li> Type &#39;bonfire_trace_check&#39; in die Mathlab Befehlsfenster, und drücken Sie die Eingabetaste. </li><li> Wählen Sie die Bedingung Ordner mit den Daten, die Sie gerade in den &quot;Ordner suchen&quot;-Fenster bearbeitet haben, und wählen Sie &#39;OK&#39;. </li><li> Wenn es irgendwelche Fehler in einem der Bilder im Ordner werden das Programm ausgegebenen Bilder angezeigt werden, wo der Fehler liegt. </li><li> Beheben von Fehlern in NeuronStudio <ol class="lroman"><li> Öffnen Sie die Bilddatei, die Sie in den ausführenden Schritt gespeichert. </li><li> Suchen und Beheben des Problems (s). </li><li> Klicken Sie auf Datei → Speichern Neuriten. </li><li> Wiederholen Sie dies für andere Bilder, die behoben werden müssen. </li><li> Rerun &quot;bonfire_trace_check &#39;(5,4). </li></ol></li></ol></li></ol> 6. Verwenden Sie &#39;Freudenfeuer&#39;, um morphologische Daten von SWC-Dateien extrahieren.: <ol class="lalpha"><li> Type &#39;Bonfire&#39; in das Befehlsfenster, und drücken Sie die Eingabetaste. </li><li> Wählen Sie die Bedingung Ordner, der die gewünschten Daten in die &quot;Ordner suchen&quot;-Fenster zu analysieren, und wählen Sie &#39;OK&#39; enthält. </li><li> Die Bonfire Analyse erzeugt ein Fenster für jede der Neuronen, die analysiert werden, in denen es Diagramme der neuronalen Morphologie zusammen mit dem Sholl Ringe in der Analyse verwendet. Darüber hinaus wird das &quot;Lagerfeuer&quot;-Befehl generieren. Mat-Datei, die alle morphologischen Informationen, die aus der Analyse entnommen wurde enthält. </li></ol> 7. Verwenden Sie &#39;bonfire_results&#39;, um die Daten anzeigen: <ol class="lalpha"><li> Type &#39;bonfire_results&#39; in die Matlab-Befehlsfenster. </li><li> Wählen Sie die Bedingung Ordner für die Bedingung, die Sie gerne in den &quot;Ordner suchen&quot;-Fenster und wählen Sie &#39;OK&#39; würde. </li><li> Die &quot;Browse for Folder&quot; Fenster vorübergehend zu schließen und wieder öffnen, so dass Sie zusätzliche Bedingungen, die Sie anzeigen möchten wählen. </li><li> Wenn Sie fertig sind wählen Zustand Ordner, wählen Sie &#39;Abbrechen&#39;, um die Auswahl zu beenden. </li><li> &quot;Bonfire_results &#39;zurückkehren wird Zusammenfassungsdiagramme einschließlich the Daten aus dem Zustand Ordner, die Sie ausgewählt. </li></ol> 8. Verwenden Sie &#39;bonfire_export&#39; von Daten an Excel Export: <ol class="lalpha"><li> Type &#39;bonfire_export &quot;in das Befehlsfenster. </li><li> Wählen Sie die Bedingung Ordner mit den Daten, die Sie gerne in den &quot;Ordner suchen&quot; Fenster exportieren und wählen Sie &#39;OK&#39; würde. Bonfire_export erstellt Excel-Dateien der morphologischen Daten und wird sie in den Zustand Ordner ausgewählt wurde Platz. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel für die Daten von der Bonfire-Programm auf einem Daten-Set mit zwei Bedingungen erzeugt wird, in Abbildung 3 dargestellt. In diesem Beispiel enthalten Bedingung 1 Neuronen mehr Neuriten distal zum Zellkörper. Dieses Phänomen lässt sich am Beispiel Bilder (Abbildung 3B) sowie in der Sholl Kurve der gesamten dendritischen Dorn (Abbildung 3A) und in den Graphen der Anzahl der Klemmstellen (Abbildung 3C) beobachtet werden. Zusätzlich, weil der Bonfire-Programm führt auch Sholl Analyse auf Teilbereiche der Bilder, sind wir in der Lage, genauer zu identifizieren die Identität des Neuriten, die zugenommen haben. Sowohl die Gesamtzahl der Schnittpunkte der 3. Ordnung oder höher Neuriten (Abb. 3F) und die Gesamtzahl der beiden Vermittler und Terminal Neuriten (Abb. 3G) werden erhöht distal zum Zellkörper. Diese Trends können auch in den Abbildungen 3D und 3E beobachtet werden. <img src="/files/ftp_upload/2354/2354fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1:. Flussdiagramm der Bonfire-Programm Neuronen sind zurück mit ImageJ. Die Daten werden dann exportiert und umgewandelt von der Bonfire-Programm in vorläufig. SWC-Dateien. NeuronStudio wird verwendet, um die Konnektivität des Neuriten zu definieren. Bonfire nach Fehlern sucht und berechnet dann Sholl Kurven, die Anzahl der primären, sekundären und höherer Ordnung Neuriten, und die Zahl der Verzweigungsstellen und Neuriten Tipps. Schließlich werden die Daten nach Excel für statistische Auswertungen exportiert werden. <img src="/files/ftp_upload/2354/2354fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: File-Struktur für Bonfire Analyse erforderlich Die Dateistruktur muss mit diesem oder das Programm nicht korrekt ausgeführt werden.. Die Namen der Ordner und Dateien und die Menge der Ordner und Dateien können geändert werden. <img src="/files/ftp_upload/2354/2354fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3: Beispiel Ausgabe von Daten aus Bonfire Programm A) Total Sholl Kurven.. B) Beispiel Bilder der beiden Bedingungen invertiert. C) Durchschnittliche Anzahl der Verzweigungspunkte und Endpunkten / Zelle. D) Durchschnittliche Anzahl der Prozesse / Zelle für primäre, sekundäre und tertiäre oder größer Neuriten. E) Durchschnittliche Anzahl der Prozesse / Zelle für Root-, Zwischen-und Terminal-Neuriten. F) Segment-spezifische Identität Sholl Analyse Kurven. Die Segmente werden als primäre, sekundäre oder tertiäre oder höher gruppiert. G) Segment-spezifische Identität Sholl Analyse Kurven. Segmente sind als root-Segmente, Zwischen-Segmente oder terminalen Segmente gruppiert.

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Die Autoren erklären, keine konkurrierenden Interessen. Die finanzierenden Stellen hatte keine wissenschaftliche Rolle bei der Entwicklung von Bonfire.

Die Bonfire-Programm ist ein semi-automatisiertes Programm für die Analyse von Dendriten und Axonen Morphologie. Es erhöht die Effizienz und Genauigkeit der Sholl Analyse über die Durchführung der Analyse manuell. Darüber hinaus spart der Bonfire-Programm die Daten bei jedem Schritt des Prozesses, die es ermöglichen, die Daten zu prüfen und die Genauigkeit der Analyse zu überprüfen. Daher kann die Aufgabe der Datenanalyse an zahlreiche Einzelpersonen ohne Beeinträchtigung der Genauigkeit verteilt werden. Schli...

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		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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<td>NeuronJ plugin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a></td>
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<tr>
<td>ImageJ software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Bonfire program</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://lifesci.rutgers.edu/~firestein">http://lifesci.rutgers.edu/~firestein</a></td>
</tr>
<tr>
<td>NeuronStudio</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html">http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>MatLab Program</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MathWorks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated sholl analysis of digitized neuronal morphology at multiple scales

Neuronale Morphologie spielt eine bedeutende Rolle in der Festlegung, wie Neuronen und Funktion kommunizieren 1-3. Konkret betrifft es die Fähigkeit der Neuronen Signale von vorgeschalteten Zellen erhalten 2 und trägt zur Ausbreitung der Aktionspotentiale 4,5. Die Morphologie der Neuriten beeinflusst auch, wie Informationen verarbeitet werden. Die Vielfalt der Dendriten Morphologien erleichtern lokalen und Long Range Signalisierung und ermöglichen einzelner Neurone oder Gruppen von Neuronen durchzuführen spezialisierte Funktionen innerhalb des neuronalen Netzes 6,7. Änderungen in Dendriten Morphologie, auch die Fragmentierung von Dendriten und Veränderungen in der Verzweigung Muster, haben in einer Reihe von Erkrankungen, darunter Alzheimer 8, Schizophrenie 9,10 und geistige Behinderung 11 beobachtet worden. Die Fähigkeit, beide verstehen die Faktoren, die Dendriten Morphologien zu gestalten und Veränderungen in Dendriten Morphologien zu identifizieren ist wichtig für das Verständnis der Funktion des Nervensystems und Störungen. Neuriten Morphologie wird oft durch Sholl Analyse und durch Zählen der Anzahl der Neuriten und die Anzahl der Zweigspitzen analysiert. Diese Analyse ist in der Regel um Dendriten angewandt, aber es kann auch Axone angewendet werden. Die Durchführung dieser Analyse von Hand ist sehr zeitaufwändig und führt zwangsläufig zu Variabilität durch Experimentator Bias und Inkonsequenz. Die Bonfire-Programm ist ein semi-automatisches Verfahren zur Analyse von Dendriten und Axonen Morphologie, die auf verfügbare Open-Source-morphologische Analyse-Tools baut. Unser Programm ermöglicht die Erfassung von lokalen Veränderungen in Dendriten und Axonen Verzweigung Verhalten, indem Sholl Analyse auf Teilbereiche des neuritischen Laube. Zum Beispiel ist Sholl Analyse sowohl auf das Neuron als Ganzes als auch auf jeder Teilmenge von Prozessen (Primar-, Sekundar-, Terminal-Wurzel, etc.) Dendrite und Axone Strukturierung ist durch eine Reihe von intra-und extrazellulären Faktoren beeinflusst durchgeführt, viele lokal handeln. Somit ist die resultierende Welle Morphologie aufgrund der spezifischen Prozesse, die auf spezifische Neuriten, die es erforderlich machen morphologische Analyse in einem kleineren Maßstab durchzuführen, um diese lokalen Varianten 12 zu beobachten. Die Bonfire-Programm erfordert die Verwendung von zwei Open-Source-Analyse-Tools, die NeuronJ Plugin ImageJ und NeuronStudio. Neuronen sind in ImageJ zurückverfolgt und NeuronStudio wird verwendet, um die Konnektivität zwischen Neuriten zu definieren. Bonfire enthält eine Reihe von benutzerdefinierten Skripts in MATLAB (MathWorks) geschrieben, die verwendet werden, um die Daten in das entsprechende Format zu konvertieren für weitere Analysen sind für den Benutzer Fehler zu überprüfen und letztlich durchführen Sholl Analyse. Schließlich werden die Daten in Excel für statistische Auswertungen exportiert werden. Ein Ablaufplan der Bonfire-Programm ist in Abbildung 1 dargestellt.

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Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Wir haben ein Computer-Programm, um neuronale Morphologie Analyse entwickelt. In Kombination mit zwei bestehenden Open-Source-Analyse-Tools, führt unser Programm Sholl Analyse und bestimmt die Anzahl der Neuriten, Verzweigungspunkte, und Neuriten Tipps. Die Analysen werden, so dass lokale Änderungen in Neuriten Morphologie beobachtet werden durchgeführt.

Automatisierte Sholl Analyse digitalisierter neuronale Morphologie bei Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

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Neuroscience

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Serie: Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Forschung

Neurowissenschaften

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent and divergent anatomical connections including feed forward and feedback wiring. Furthermore, information of the same origin is partially sent via parallel pathways to different and sometimes into the same brain areas. To understand the evolutionary benefits as well as the computational advantages of these wiring strategies and especially their temporal dependencies on each other, it is necessary to have simultaneous access to single neurons of different tracts or neuropiles in the same preparation at high temporal resolution. Here we concentrate on honeybees by demonstrating a unique extracellular long term access to record multi unit activity at two subsequent neuropiles1, the antennal lobe (AL), the first olfactory processing stage and the mushroom body (MB), a higher order integration center involved in learning and memory formation, or two parallel neuronal tracts2 connecting the AL with the MB.&#160;The latter was chosen as an example and will be described in full. In the supporting video the construction and permanent insertion of flexible multi&#160;channel wire electrodes is demonstrated. Pairwise differential amplification of the micro&#160;wire electrode channels drastically reduces the noise and verifies that the source of the signal is closely related to the position of the electrode tip. The mechanical flexibility of the used wire electrodes allows stable invasive long&#160;term recordings over many hours up to days, which is a clear advantage compared to conventional extra&#160;and intracellular in vivo recording techniques.

Simultaneous extracellular long term recordings from two different brain neuropiles or two different anatomical tracts were established in honeybees. These recordings allow the investigation of temporal aspects of neuronal processing across different brain areas at the single neuron as well as at the ensemble level in a behaving animal.

Gleichzeitige Langzeit-Aufnahmen auf zwei neuronale Verarbeitungsstufen in Behaving Honigbienen

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, formed by ribosomes, mRNAs, several proteins and non-coding RNAs, represent integrated platforms where translational controls take place. However, while the ribosome has been widely studied, the organization of polysomes is still lacking comprehensive understanding. Thus much effort is required in order to elucidate polysome organization and any novel mechanism of translational control that may be embedded. Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that allows the acquisition of 3D images at nanoscale resolution. Compared to electron microscopy (EM) techniques, one of the main advantages of AFM is that it can acquire thousands of images both in air and in solution, enabling the sample to be maintained under near physiological conditions without any need for staining and fixing procedures. Here, a detailed protocol for the accurate purification of polysomes from mouse brain and their deposition on mica substrates is described. This protocol enables polysome imaging in air and liquid with AFM and their reconstruction as three-dimensional objects. Complementary to cryo-electron microscopy (cryo-EM), the proposed method can be conveniently used for systematically analyzing polysomes and studying their organization.

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Peering am Gehirn Polysomen mit Rasterkraftmikroskopie

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

Mess Progressive neurologische Behinderungen in einem Mausmodell der Multiplen Sklerose

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Analyse dendritischer Morphologie in Spalten und Schichten

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some disadvantages such as subjective data and the requirement of a skilled, experienced experimenter. To date, a variety of modifications have improved the von Frey method, but it still has a few limitations. Recent reports have suggested that gait analysis produces more accurate and objective data from the neuropathic animals. This protocol demonstrates how to perform the automated gait analysis to determine the degree of neuropathic pain in mice. After several days of acclimation, the mice were allowed to walk freely on the glass floor to illuminate footprints. Then, quantification of the footprints and gait were performed through video clips with automatic analysis of various walking parameters, such as area of paw print, swing time, angle of paw, etc.
The main purpose of this study is to describe the methodology of automated gait analysis and briefly compare it with data from the classical sensory test using von Frey filament.

The precise assessment of pain response in a neuropathic animal model is critical to investigate the pathophysiology of pain diseases and develop new analgesics. We present a sensitive and objective method to determine the sensory function of the rodent hind paw by an automated gait analysis system.

Automatisierte Ganganalyse bei Mäusen mit chronischen Verengung Verletzungen

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

Quantitative Analyse der neuronalen dendritischen Arborization Komplexität in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...