Die Abschätzung der dopaminergen Neuronenzahl in der Substantia nigra ist ein wichtiges Ergebnismaß in der Parkinson-Forschung. Dieses Protokoll verkürzt die Arbeitsbelastung, die zur Schätzung der Neuronenzahl erforderlich ist, erheblich. Diese Methode bietet einen zeiteffizienten und genauen Prozess zur Erkennung von Veränderungen der dopaminergen Neuronenzahl und eignet sich zur Bestimmung der Wirkung von Interventionen auf das Überleben der Zellen.
Diese Methode könnte leicht angepasst werden, um genaue Zählungen von Neuronen in verschiedenen Gehirnregionen zu liefern und gleichzeitig Kosten- und Zeitvorteile gegenüber herkömmlichen stereologischen Methoden zu erhalten. Um IHC-Bilder aufzunehmen, verwenden Sie die Software, die mit einem konfokalen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung gekoppelt ist. Öffnen Sie das Stiftloch auf 1,5 Flächeneinheiten, um eine breite Ebene von insgesamt 1,5 Mikrometern zu erfassen, und legen Sie den Fokus auf die injizierte Seite des Gehirns.
Aktivieren Sie auf der Registerkarte Erfassung die Option Kachelscan-Imaging und legen Sie die Abmessungen auf 10 x vier fest. Stellen Sie im Aufnahmemodusfenster den Zoom auf 1,1 ein, um Stichmarken zwischen den Kachelscanbildern zu vermeiden. Stellen Sie die Bildgröße auf 1024 x 1024 Pixel und die Mittelung auf zwei ein, um eine qualitativ hochwertige Bildaufnahme zu gewährleisten.
Stellen Sie im Kanalfenster track one auf Alexa 488 und track two auf Alexa 555 ein. Laden Sie den Dia auf die Bühne und wählen Sie einen Abschnitt mit einer starken TH-Färbung. Klicken Sie im Erfassungsbereich auf live.
Stellen Sie im Kanalbereich die Laserstärke und -verstärkung auf Pegel ein, die das Signal maximieren und das Hintergrundrauschen begrenzen. Verwenden Sie die Bereichsanzeige, um sicherzustellen, dass die Signale nicht überbelichtet werden. Wiederholen Sie dies mit mehreren Folien.
Aktivieren Sie auf der Registerkarte Erfassung das Kontrollkästchen Positionen. Um mit der Bildgebung zu beginnen, verwenden Sie das Okular und wählen Sie den ersten Abschnitt mit positiver TH-Färbung. Setzen Sie dann den Fokus auf den Point of Interest und verschieben Sie die Bühne in die Mittellinie des Abschnitts.
Dadurch wird die Position in den X-, Y- und Z-Achsen gespeichert und ein Kachelscan abgebildet, der den gesamten Abschnitt erfasst. Wiederholen Sie dies für alle anderen Folien, einschließlich einer nicht injizierten Site. Trennen Sie Bilddateien mit geeigneter Software und importieren Sie sie in eine automatisierte Bildanalysesoftware.
Definieren Sie einen bereich von Interesse, indem Sie das Stiftanmerkungswerkzeug auswählen, um eine Anmerkung um die substantia nigra pars compacta zu zeichnen. Wechseln Sie zur Registerkarte Analyse und wählen Sie im Dropdown-Menü Analyse die Option Echtzeitoptimierung aus. Dadurch wird ein separates Fenster auf dem Schnittbild geöffnet, das eine Echtzeitänderung der Analyseparameter ermöglicht.
Wählen Sie unter dem Abschnitt Analysevergrößerung den entsprechenden Bildzoom aus. Wählen Sie unter dem Abschnitt Zelldetektion kernen Farbstoff als Farbstoff aus, der für die TH-Färbung verwendet wird. Passen Sie die nukleare Kontrastschwelle, die minimale Nukleare Intensität, die Aggressivität der Kernsegmentierung und die Einstellungen für die Kerngröße an, während Sie das Zeitabstimmungsfenster sorgfältig beobachten.
Wiederholen Sie diesen Vorgang mit mehreren Beispielen. Sobald eine angemessene Anzahl von Bildern abgetastet und die Echtzeitabstimmung entsprechend angepasst wurde, speichern Sie die Analyseeinstellungen im Dropdown-Menü Einstellungsaktionen. Wählen Sie alle zu analysierenden Bilder aus und klicken Sie auf Analysieren.
Wählen Sie die Analyseeinstellung aus, die gerade gespeichert wurde, und aktivieren Sie im Analysebereich das Kontrollkästchen Anmerkungs-Layer, aktivieren Sie dann Layer eins und klicken Sie auf Analysieren. Sobald Sie fertig sind, exportieren Sie die zusammenfassenden Analysedaten für alle Abschnitte, indem Sie die Option zum Exportieren von Objektanalysedaten auswählen. Dieser Datensatz könnte verwendet werden, um Veränderungen der Zellgröße als Reaktion auf ein Toxin oder Therapeutikum zu untersuchen.
Sechs Wochen nach Adeno-assoziierten Virus- oder AAV-Injektionen führte die stereotaktische Injektion von AAV, das das mutierte A53T alpha-Synuclein exprimierte, in die Substantia nigra im Rattengehirn zu einer signifikanten Verringerung der Dichte dopaminerger Neuronen. Die mittlere Anzahl von TH-positiven Neuronen pro Millimeter im Quadrat in der Substantia nigra von Ratten, denen AAV-A35T injiziert wurde, war im Vergleich zu Ratten, denen der AAV-Leervektor injiziert wurde, signifikant verringert. Ähnliche Beobachtungen wurden mit unvoreingenommener Stereologie gemacht.
Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, denken Sie daran, dass die Software nur so nützlich ist, wie sie trainiert wird. Daher muss Zeit und Sorgfalt darauf geachtet werden, dass eine einzelne Zelle als eine einzelne Zelle identifiziert wird. Die Software kann angepasst werden, um eine Fluoreszenzintensität anderer Proteine von Interesse wie Alpha-Synuclein zu messen, um festzustellen, ob Behandlungen den Proteinspiegel modulieren können.
Diese Technik hat eine höhere Effizienz ermöglicht, wenn die Wirkung mehrerer potenzieller Therapeutika auf die dopaminerge Neuronendichte getestet wurde.
