Die automatisierten seriellen Elektronenmikroskopietechniken. Der Tempobegrenzungsschritt in der Pipeline führt zur Erzeugung biologischer dreidimensionaler Modelle Bildverarbeitung. Unser Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, um eine dichtere Konstruktion von Bildvolumen in nur wenigen Tagen zu erzeugen.
Kombiniert mit einem Ansatz für quantitative Messungen mit dreidimensionalen Modellen. Mit dieser Technik kann die 3D-Struktur von Geweben, die nicht das Gehirn sind, potenziell analysiert werden, um für bestimmte Krankheiten typische strukturelle Beeinträchtigungen zu identifizieren und die diagnostische Strategie zu verbessern. Die Segmentierung ist ein mühsamer Schritt.
Nehmen Sie sich die Zeit, es so genau wie möglich zu machen, um das Korrekturlesen einer fehlerhaften Segmentierung zu vermeiden und den gesamten Prozess neu starten zu müssen. Das Design der Software manchmal nicht sehr benutzerfreundlich. Daher ist es wichtig, die Startarbeit für die Segmentierung zu sehen.
Öffnen Sie den Bildstapel, indem Sie die native Datei aus dem Mikroskop ziehen und ablegen, die den Stapel enthält, oder kaufen Sie das Ziehen und Ablegen des Ordners mit dem gesamten Bildstapel in das Softwarefenster Sobald der Stapel geöffnet wurde, gehen Sie zu Bild, Eigenschaften, um sicherzustellen, dass die Voxelgröße aus den Metadaten gelesen wurde. Verwandeln Sie das Bild in 8-Bit, indem Sie auf Bild, Typ und 8-Bit klicken. Wenn der ursprüngliche Stapel als verschiedene Kacheln erworben wird, wenden Sie Die Nähte in TrakEM2 an.
Erstellen Sie ein neues TrakEM2-Projekt mit New, TrakEM2 mit TrakEM2 Embedded Functions Segmentstrukturen von Interesse, falls erforderlich. Klicken Sie im TrakEM2-Gooey mit der rechten Maustaste auf "unter dem Vorlagenfenster", und wählen Sie neue untergeordnete Bereichsliste hinzufügen'Ziehen und ablegen Sie alles'in den Ordner, unter Projektobjekten'und eine'würde dort erscheinen. Drag & Drop, die Bereichsliste'von der Vorlage zu dem anything'located under project objects'On the image stack viewport, wählen Sie den Z-Space'mit dem Cursor.
Die Bereichsliste' wird mit der eindeutigen ID-Nummer angezeigt. Wählen Sie das Pinselwerkzeug oben und verwenden Sie die Maus, um eine Struktur zu segmentieren, indem Sie sie zytosol über den gesamten Z-Stack füllen. Exportieren Sie die segmentierte Masse, die in Ilastik als Saatgut für das Schnitzen verwendet werden soll.
Klicken Sie dazu mit der rechten Maustaste auf das Flächenlistenobjekt in der Z-Raumliste oder auf der Maske im Ansichtsport, und wählen Sie export'area list'als Beschriftungen T-I-F aus. Reduzieren Sie abhängig von der Auflösung, die für weitere Rekonstruktionen erforderlich ist, die Pixelgröße des Bildstapels durch Down-Sampling. Berücksichtigen Sie die Speicheranforderungen der Software, die für die Segmentierung und Rekonstruktion verwendet wird.
Ilastik verarbeitet Stapel von bis zu fünfhundert Pixeln auf X-Y. Berücksichtigen Sie die Mindestgröße, die die Objekte noch erkennbar erscheinen und somit segmentiert werden können. Verwenden Sie image'adjust size'Um den Kontrast zu erhöhen und die Segmentierung zu unterstützen, kann der unscharfe Maskenfilter angewendet werden, um Membranen knackiger zu machen.
Verwenden Sie process'filters'unsharp mass'Export the image stack as single images'for further processing in segmentation software, using file'save as'image sequence'and choose TIFF'format. Wählen Sie im Haupt-Ilastik-Gooey das Carving-Modul aus. Laden Sie den Bildstapel, indem Sie new'hinzufügen und fügen Sie ein einzelnes 3D/4D-Volume aus der Sequenz 'Wählen Sie das ganze Verzeichnis'und wählen Sie den Ordner mit dem Image-Stack als einzelne Dateien gespeichert'Am unteren Rand des neuen Fensters, wo Optionen zum Laden der Bilder vorhanden sind, stellen Sie sicher, dass Z"ausgewählt.
Für die folgenden Schritte finden Sie alle Operationen und Tasten auf der linken Seite der Hauptsoftware gooey. Verwenden Sie unter der Registerkarte Vorverarbeitung die bereits geprüften Standardoptionen. Verwenden Sie helle Linien 'Rich Filter'und halten Sie die Filterskala bei 1.600.
Dieser Umfang kann anschließend geändert werden. Nachdem die Vorverarbeitung abgeschlossen ist, wählen Sie die nächste Seite im Dropdown-Menü des Beschriftungsmoduls aus. Ein Objekt und ein Hintergrund sind standardmäßig vorhanden.
Wählen Sie den Objektkern aus, indem Sie darauf klicken, und zeichnen Sie eine Linie über der Interessenstruktur. Wählen Sie dann den Hintergrundkern aus, und zeichnen Sie eine oder mehrere Linien außerhalb des zu rekonstruierenden Objekts. Klicken Sie nun auf segment' und warten Sie.
Abhängig von der Leistung des Computers und der Größe des Stapels kann die Segmentierung einige Sekunden bis Stunden dauern. Sobald dies geschehen ist, sollte eine halbtransparente Maske, die die Segmentierung hervorhebt, über der segmentierten Struktur angezeigt werden. Führen Sie einen Bildlauf durch den Stapel durch, um die Segmentierung zu überprüfen.
Die Segmentierung ist möglicherweise nicht korrekt, wenn sie nicht der Struktur des Interesses folgt oder aus ihr austritt. Korrigieren Sie alle Überschüttungen, indem Sie einen Hintergrundsamen auf die verschüttete Segmentierung legen. Und fügen Sie einen Objektkern über das nicht rekonstruierte Segment des Objekts des Interesses hinzu.
Das genaue visuelle Korrekturlesen der Segmentierung mit Ilastik mag mühsam sein, aber es ist wichtig sicherzustellen, dass die exportierten Objekte keine Artefakte enthalten. Wenn die Segmentierung immer noch nicht korrekt ist, versuchen Sie, mit dem bias'Parameter zu ändern, der die Anzahl der akzeptierten unsicheren klassifizierten Pixel erhöht oder verringert. Der Wert ist standardmäßig 0,95.
Verringern Sie es, um ein Übergreifen oder Erhöhen zu begrenzen, wenn die Segmentierung zu konservativ ist. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, auf die Vorverarbeitung zu klicken und die Größe des Filters zu ändern. Durch die Erhöhung des Wertes werden die salz- und pfefferlärmähnlichen Effekte minimiert, aber auch Membranen verschwommener und kleinere Details schwerer zu erkennen sein.
Dies kann das Übergreifen begrenzen. Wiederholen Sie so viel wie nötig, solange alle gewünschten Objekte segmentiert wurden. Sobald ein Objekt fertig ist, navigieren Sie zu segment' und klicken Sie auf aktuelles Objekt speichern'Zwei neue Samen werden angezeigt, um die Segmentierung eines neuen Objekts zu starten.
Abstrakte Oberflächenmaße sofort als O-B-J-Dateien, indem Sie auf Export aller Netze klicken'Um manuell segmentierte Modelle in 3D in TrakEM2 zu visualisieren, Rechtsklickbereich Liste, dann wählen Sie in 3D anzeigen'Ein höherer Wert erzeugt eine niedrigere Auflösung Netz. Schließlich exportieren Sie das 3D-Netz als WaveFront O-B-J', indem Sie aus der Menüdatei 'export surfaces'WaveFront'Nach der Installation des Neuromorph-Toolkits, wie im Textprotokoll beschrieben, einen neuen Mixer auswählen. Importieren Sie die Objekte mithilfe des Neuromorph-Batchimports, indem Sie im Szenenmenü auf Importobjekte klicken, um mehrere Objekte gleichzeitig zu importieren.
Stellen Sie sicher, dass Sie aktivieren, neu vernetzen und glatte Schattierungen verwenden. Wählen Sie das Objekt aus dem Outliner aus, und ändern Sie die Octree-Tiefe der Re-Mesh-Funktion unter dem Menü des Modifizierers. Arbeiten Sie iterativ, um die Anzahl der Scheitelpunkte zu minimieren und zu vermeiden, dass Details in der Auflösung und korrekten Morphologie verloren gehen.
Beim Ändern der Octree-Tiefe ändert sich das Netz auf dem Haupt-Gooey entsprechend. Sobald Sie fertig sind, klicken Sie auf Anwenden, um den Prozess zu abschließen. Navigieren Sie zum Neuromorph-Menü im linken Bereich, und verwenden Sie die Bild-Superimposition-Tool-Image-Stack-Interaktionen, um den Bildstapel zu laden.
Achten Sie darauf, die physische Größe des Bildstapels für X, Y und Z einzugeben und den Pfad des Stapels auszuwählen, indem Sie auf Quelle Z.X und Y auf orthogonale Ebenen klicken. Sie sind optional und werden nur geladen, wenn der Benutzer den gültigen Pfad einfügt. Wählen Sie dann ein Netz im Ansichtsport aus, indem Sie mit der rechten Maustaste darauf klicken.
Geben Sie den Bearbeitungsmodus ein, indem Sie die Registerkarte drücken, wählen Sie einen oder mehrere Scheitelpunkte mit der rechten Maustaste aus und klicken Sie schließlich auf Bild am Scheitelpunkt anzeigen. Eine oder mehrere geschnittene Ebenen mit dem Mikrographen erscheinen überdem über dem Netz. Wählen Sie die Schnittebene aus, indem Sie mit der rechten Maustaste darauf klicken.
Drücken Sie dann die Steuerung Y und scrollen Sie über das 3D-Modell mit dem Mausscroll. Dies kann auch als Korrekturlesemethode verwendet werden. Hier ist die Segmentierung und Rekonstruktion mit TrakEM2 und Ilastik zu sehen.
Der TrakEM2 Gooey wird mit Objekten angezeigt, die manuell rot segmentiert sind. Die exportierte Maske kann dann als Eingabe für die halbautomatische Segmentierung verwendet werden. Von Ilastik können Masken zum manuellen Korrekturlesen weiter nach TrakEM2 exportiert werden.
Masken können als dreieckige 3D-Netze exportiert werden, um rekonstruierte Strukturen zu enthüllen. In diesem Beispiel wurden vier Neuronen, Astrozyten, Mikroglia und Pericyte mit diesem Verfahren rekonstruiert. Gezeigt wird eine 3D-Analyse rekonstruierter Morphologien mit kundenspezifischen Werkzeugen.
Hier ist ein isotropes Bildvolumen aus einem fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie-Datensatz. Eine dichte Rekonstruktion dieser Daten zeigt Axone, den astrozytischen Prozess und Dendriten. Dieser Mikrograph zeigt Beispiele für Ziele für Quantifizierungen wie Synapsen und astrozytische Glykogengranulate.
Die Maske aus diesem Mikrograph zeigt die Verteilung von Glykogengranulat um Synapsen. Hier ist eine grafische Darstellung der Eingabe und Ausgabe der grafischen Visualisierung des glykogenabgeleiteten Laktatabsorptionsmodells oder GLAM'Here zu sehen, bei dem ein Virtual Reality oder V-R-Headset bei der Arbeit an der dichten Rekonstruktion aus einem fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie-Dataset gezeigt wird. Aus einer Teilmenge von Neuriten kann eine immersive V-R-Szene beobachtet werden.
Der grüne Laser zeigt auf eine GLAM'Peak. ist von primärer Bedeutung, da die korrekte Größe der exportierten 3D-Objekte bestimmt wird und die Werte der tatsächlichen Größe entsprechen. Das Konzept der seriellen Schnittbildgebung, bildgebenden Segmentierung und 3D-Konstruktion ist ziemlich alt.
Die Entdeckung der technischen Beschleunigung führt zu Fortschritten bei den Colektomien bei der Überprüfung der Anatomie-Lehrbücher. Obwohl die Methode für die Hirnforschung in der Elektronenmikroskopie entwickelt wurde, kann sie auf jede mikroskopische Technik verallgemeinert werden, die Daten generiert. Außerdem kann jede Art von 3D-Bildgebungstechnik von solchen bildgebenden Segmentierungs- und Konstruktionstechniken profitieren. Inklusive C-T-Scans und M-R-I.
