This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.

HINWEIS: Einige Schritte des Protokolls erfordern unter Arbeiten in einem sauberen Abzug. Außerdem erfordert das Verfahren eine Hefe Tetrade Präpariermikroskop mit einem 10X großen Arbeitsabstand Ziel ausgestattet Spheroplasting überwachen. Das Mikroskop sollte in der Haube vor der Zeit eingestellt werden. Entfernen Sie den Mikromanipulator Arm und Plattenhalter aus dem Anwendungsbereich und setzen diese Elemente in einem sicheren Ort weg vom Arbeitsbereich. 1. Herstellung von Sphäroplasten <ol><li> Wachsen Hefe unter gewünschten Bedingungen. Gebrauch über 2 x 10 8 Zellen für jede Probe, beispielsweise 4 ml einer Kultur bei 1,4 OD600 = 5 x 10 7 Zellen / ml. Obwohl sofortige Verarbeitung von Proben kann in einigen Fällen bevorzugt sein, für die meisten Anwendungen, Zell Aliquots auf Eis für bis zu 8 Stunden vor der Verarbeitung gelagert werden. </li><li> Übertragen Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenrohr und Spin in einer klinischen Zentrifuge bei Einstellung 5 (2345 rpm / 857,5 × g) für 3 min, um die Zellen zu pelletieren. </li&gt; <li> Dekantieren Sie das Medium dabei nicht zu Zellen aus dem Pellet zu verlieren. Vorsichtig resuspendieren Zellen in 1 ml Puffer ZK und fügen Sie 40 ul 1 M Dithiothreitol (DTT). Inkubieren Sie 2 min unter leichtem Mischen. Pellet-Zellen wie zuvor (siehe Schritt 1.2). </li><li> Resuspendieren Pellets in 1 ml Puffer ZK. Werden 5 ul einer frisch hergestellten Lösung von Zymolyase 100T, die gründlich gemischt wurde. Inkubieren für 20-30 min bei 30 ° C, um die Zellwand zu entfernen und Sphäroplasten. </li><li> Assay Eine 10 ul Tropfen der Zellsuspension auf einen Objektträger zu bestimmen, ob Spheroplasting abgeschlossen ist. Zellen unter dem Dissektionsmikroskop ohne Deckglas betrachtet. Die Zellen sind aufgedunsen und runde anstatt etwas länglich erscheinen und sollte nach der Zugabe von 20 &amp; mgr; l Wasser zu lysieren. Wenn Zellen nicht zur Lyse, Rückkehr der Probe auf 30 ° C und re-Assay alle 10 Minuten, bis das Wasser induzierte Lyse leicht zu beobachten ist. Pellet-Zellen wie zuvor (siehe Schritt 1.2). </li><li> Vorsichtig resuspendieren und waschen Zellpellet in 2,5 ml kaltem MES / Sorbit-Puffer. Pellet-Zellen wie zuvor (siehe Schritt 1.2). Vorsichtig resuspendieren Zellpellet in 300 bis 400 &amp; mgr; l kaltem MES / Sorbit-Puffer. Zellen auf Eis in dieser Phase für mehrere Stunden gehalten werden. </li></ol> 2. Chromosome Verbreitung HINWEIS: Die Glasflächen, auf denen Chromosomen verteilt, entweder werden Folien oder Deck-sollte vor der Zeit vorbereitet werden. Jeder Objektträger oder Deckglas sollte in Wasser getaucht werden, dann EtOH, dann trocknen gelassen, und poliert mit Objektiv Papier. Wenn Chromosomen auf Deckgläsern verteilt werden, sollte das Deckglas auf einem Objektträger mit Scotch Klebeband oder Gummizement befestigt werden. Soweit nicht anders erwähnt, wird der Rest des Protokolls beschreiben Ausbreitung entweder auf einem Objektträger oder Deckglas <ol><li> Verwendung einer P20-Pipette Pipette 20 ul Zellsuspension auf die Oberfläche einer sauberen Folie. </li><li> Verwendung eines P200 Pipette 40 ul 3% PFA / Saccharose-Lösung und vorsichtig mischen die solution durch &quot;wirbelnden&quot; die Folie mit der Hand, bis Schlieren Linien verschwinden. Den Objektträger unter dem Mikroskop, und bestätigen Sie, dass Zellen im Fokus. Die PFA-Lösung sollte im Abzug am Tag der Verwendung frisch zubereitet. Hinweis: Wenn das Protein von Interesse wurde durch das Verfahren nicht zuvor geprüft worden sind, ist es ratsam, zusätzliche Folien unter Verwendung von Lösungen, die 2 bis 4% PFA enthalten, um festzustellen, ob Retention des Proteins ist empfindlich gegen Fixierbedingungen vorzubereiten. A 4% PFA / Saccharose-Lösung wird in Fällen, in denen es wünschenswert ist, assoziiert Tubulin Mikrotubuli Visualisierung verwendet. Der Nachteil der höheren Fixiermittel Konzentration, dass die Chromosomen werden &quot;underspread&quot;, 2% PFA neigt auch dazu, &quot;underspread&quot; Chromosomen zu ergeben. </li><li> Verwendung eines P200 Pipette 80 ul 1% LIPSOL, wirbeln wie zuvor, um Lösungen möglichst vollständig zu mischen, starten Sie einen Timer. Wenn LIPSOL nicht verfügbar ist, können 80 &amp; mgr; l 1% NP40 oder 80 &amp; mgr; l dH 2 O werdensubstituierten (siehe Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 2). </li><li> Beobachten Sie die Zellen vorsichtig und sanft wirbeln den Schiebe alle 15 sec. Bei etwa 80% der Zellen lysiert (verschwunden) stoppen Sie den Timer, ziehen Sie sofort den Schlitten aus dem Mikroskop, fügen Sie 80 ul PFA / Saccharose-Lösung, und Schwenken vermischen. Lyse sollte aus zwischen 30 und 90 sec nach dem Start des Zeitgebers auftreten. HINWEIS: Wenn mehrere Folien zeigen Lyse etwa zur gleichen Zeit, kann man schließlich mikroskopische Beobachtung für den Rest der Folien weglassen und einfach nur vorsichtig Mal, wenn die Zeit zwischen Zugabe von LIPSOL und Zugabe der letzten Aliquot Fixiermittel. Allerdings ist diese Abkürzung nur zuverlässig bei der Herstellung mehrere Folien aus der gleichen Probe. Am besten ist es, um die Lyse von jeder Probe mikroskopisch zu überwachen, wenn verschiedene Folien werden aus Proben zu verschiedenen Zeiten aufgenommen oder aus verschiedenen Kulturen vorbereitet. </li><li> Legen Sie die Folie auf eine ebene Fläche und die Ausbreitung der Flüssigkeit über die gesamte unfrosted surface des Schiebers mit der Seite eines sauberen Einwegpipette Weide unterhalb des Meniskus des &quot;puddle&quot;, aber über der Oberfläche der Folie selbst, dh statt. nicht &quot;Rake&quot; der Oberfläche des Objektträgers mit der Pipette. Pipette auf verschiedenen Folien nicht wiederverwenden, um eine Kontamination der Proben zu vermeiden. </li><li> Lassen Sie die Objektträger über Nacht im Abzug trocknen. Unlöslichen Kernkomponenten wird auf die Gleitfläche zu regeln und zu binden. Für große Experimente, ist die Planung der Nutzung des Weltraums für die Trocknungsstufe wichtig. </li><li> Einmal getrocknet werden optimale Resultate erzielt, indem der in die Immunfärbung Stufe am gleichen Tag erhalten. Das getrocknete Saccharose-Lösung bettet jedoch die Ausbreitung Chromosomen in einer &quot;Honig&quot;, das Einfrieren von Proben erlaubt: Folien können auf eine Kunststoffschieber-Box überführt und bei -20 ° C über Jahre gelagert werden. </li></ol> 3. Immunfärbung <ol><li> Dip Slides in 0,2% Foto-Flo 30 Sek. um Honig zu entfernen. Lean gleitet aufeine Kante, wobei die Kante auf einem Papiertuch ruht, um restliche Photo-Flo entfernen. </li><li> Dip Slides in 1x TBS für 5 min waschen. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit durch gelehnt gleitet auf einer Kante, aber sie nicht austrocknen lassen. </li><li> Legen Sie Folien mattiert Seite nach oben, Pipette 300 ul TBS / BSA auf den Objektträger über die unfrosted Teil der Folie. </li><li> Inkubieren in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur für 15 min. (Große Plastikbehälter mit Wasser gesättigt Papierhandtücher unter einem Lochblech oder Kunststoffschieber Feld gesäumt von gesättigten Papierhandtücher). </li><li> Ablassen gleitet durch eine kurze Ruhe Rand des Objektträgers auf einem Papiertuch und lehnte den Schieber gegen einen geeigneten Träger (zB einem Reagenzglas Rack). Erlauben keine Oberfläche zu trocknen. </li><li> 80 ul TBS / BSA-Puffer, der die entsprechende Verdünnung des primären Antikörpers unmittelbar gelten. Wenn Antikörper Begrenzung, verwenden 40 ul und einem 22 x 22 mm Deckglas. Für grobe Kaninchenserum, das ist in der Regel zwischen einem und 1/50 1/500 Verdünnung. HINWEIS:Führen Titrationen für neue Antikörperpräparate. Die verdünnte Präparat, das High-Signal über dem Hintergrund ergibt gewählt wird. Um das Niveau der Hintergrundfärbung zu kontrollieren, sollte Kerne aus dem entsprechenden Deletionsmutante Stamm und / oder doppelte Trägern hergestellt sollte mit Präimmunserum gefärbt werden. </li><li> Legen Sie eine polierte 22 x 50 mm Deckglas auf der Folie zu vermeiden Blasen. Tun Sie dies, indem Sie die Deckglas zwischen dem Daumen und Zeigefinger an der langen Kante an Positionen in der Nähe von einem der kurzen Kante. Halten des Deckplättchens in einem 30 ° Winkel relativ zu gleiten, die kurze Kante der am weitesten von den Fingern wird abgesenkt, bis sie auf der Folie gerade innerhalb der Kante des &quot;puddle&quot; in der Nähe des bereiften Bereich des Schiebers ruht. Anschließend langsam das Deckglas in einer fließenden Bewegung, bis die Finger, die die Folie berühren die Bank, und dann los. Versuchen Sie nicht, die Position des Deckglases einzustellen, sobald sie landet. HINWEIS: Wenn Chromosomenspreads wurden vorbereitetklebten Deckgläser (anstatt direkt auf der Oberfläche der Folien), wird diese Probe Deckglas auf dem Objektträger in den Färbe- und Waschschritte fixiert zu bleiben. Eine zusätzliche Deck wird auf der Oberseite des Deckglases Probe gleichmäßig zu verteilen, der Antikörperlösung während der Färbung und anschließend verworfen platziert werden. </li><li> Die Objektträger in einer feuchten Kammer abgedichtet und Inkubation über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Halten Sie die mattierte Rand Die Objektträger in einen Objektträger Färbebank und tauchen in Küvette enthält TBS. </li><li> Tauchen Sie vorsichtig die Folie nach oben und unten, um das Deckglas zu entfernen. Versuchen, nicht zu viel Kraft zu verwenden, um dies zu tun. Waschen Sie die Objektträger 2x 10 Minuten durch Eintauchen in TBS. Objektträger aus Rack und Drain überschüssige Flüssigkeit durch Berührung Kante zu Papiertuch. Lassen Sie nicht die Oberfläche trocken. </li><li> Arbeiten unter gedämpftem Licht, sofort hinzufügen 80 ul TBS / BSA, das eine 1/1000-fachen Verdünnung von Fluorochrom konjugierten Sekundärantikörper (oder 40 &amp; mgr; l mit einer 22 x 22 mm Deckglas). Anzeiged Deck wie zuvor, und Inkubieren bei 4 ° C für 2 Stunden in der feuchten Kammer im Dunkeln. </li><li> Deckgläser zu entfernen, wie zuvor, abtropfen Folien und ermöglichen Oberfläche an der Luft trocknen für 1 bis 2 Stunden in der Dunkelheit. Lean Folien auf Papierhandtüchern wie zuvor. HINWEIS: Wenn die Verbreitung auf einem Deckglas montiert geführt wird, nehmen Sie das Deckglas aus der Folie vor dem Trocknen. Deckgläser werden dann wie für Dias in dem vorherigen Schritt beschrieben getrocknet. </li><li> Arbeiten unter gedämpftem Licht, fügen Sie etwa 30 &amp; mgr; l Medium, das Montage DAPI (drei 10 ul Tröpfchen) und dann vorsichtig senken Deckglas auflegen. Wenn die Spreads auf Deckgläsern, legen Sie die Tropfen Eindeckmedium auf einen sauberen Objektträger und Deckglas, Chromosom Seite nach unten auf die Folie. </li><li> Noch unter gedämpftem Licht, warten Sie 2 Minuten für Deck sich niederzulassen und zu versiegeln Kanten der Deckglas mit klarem Nagellack. Die Objektträger in eine flache Schiebeschachtel. HINWEIS: Bei der STED-Mikroskopie, Halterung mit ProLong Gold. Verwenden Sie 30 ul ProLong Gold-ohne DAPI und über Nacht heilen. Abdichtung mit Nagellack ist nicht notwendig. </li><li> Blick gleitet von Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskopie mit einem 40 oder 100x Objektiv mit einem Filtersatz passend für DAPI zu konzentrieren. Gegebenenfalls Speicherung des Objektträgers in der Dunkelheit bei 4 ° C für mehrere Wochen. Nicht einfrieren. </li></ol>

<ol>
	<li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast.">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li><li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast.">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li><li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes.">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li><li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis.">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li><li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+identifies+Monopolin:+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I.">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li><li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+RecA-like+recombinases:+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis.">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li><li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1/Aurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint.">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li><li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast.">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li><li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation.">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li><li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+:+a+publication+of+the.">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize...

Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae bietet viele Vorteile für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der biologischen Prozesse, einschließlich der Untersuchung von Proteinen, die Chromosom-Funktion steuern. Zwar gibt es die bekannten Vorteile von Bäckerhefe für genetische, molekularen und biochemischen Studien wird zytologische Untersuchungen der Verteilung der Proteine ​​in den Zellkern durch seine geringe Größe kompliziert. Die typische Hefenukleus hat einen Durchmesser von weniger als einem Mikrometer, die nur etwa das 5fache der Auflösungsgrenze des sichtbaren Lichts ist. Somit wird die Menge von Informationen über die Verteilung von Kernproteinen, die von herkömmlichen Immunfärbung oder durch Verwendung von fluoreszierenden Protein-Tags, wie zum Beispiel das grün fluoreszierende Protein (GFP) erhalten werden können, ist begrenzt. Ein nützlicher Ansatz zur Charakterisierung der subnuclear Verteilung von Proteinen ist Chromosom Oberfläche ausbreitet. Dieser Ansatz beinhaltet die Entfernung der Zellwand, stören und Zellkernmembranen und einellowing Die unlöslichen Bestandteile des Kerns, um auf die Oberfläche eines Objektträgers zu regeln. Diese unlöslichen Bestandteile sind die Kernmatrix und die Chromosomen. Darüber hinaus ermöglicht die Entfernung der löslichen Kerninhalte, die die Fähigkeit zur Chromatin gebundene Proteine ​​erkennen erhöht, das Chromosom Spreizverfahren zu einer wesentlichen Dekompression von Chromosomen, so dass die Ausbreitung Kernen haben einen Durchmesser von etwa 3 bis 5 um (z diploiden meiotischen Kerne) und 2 bis 3 um für diploide mitotischen Kernen. Diese Dekompression ermöglicht den Nachweis von Kernstruktur, die relativ schwierig oder unmöglich, in intakten Zellkernen zu beheben ist. Ein offensichtlicher Nachteil auf Chromosom Verbreitung ist die Möglichkeit, dass die Ausbreitung Verfahren kann teilweise oder vollständig die Struktur von Interesse stören. Von besonderem Interesse ist, dass einem bestimmten Chromosom gebundene Protein wurde, infolge des Streuverfahren verloren. Diese mögliche Komplikation should bei der Interpretation Daten gehalten werden. Ein Beispiel eines Proteins, das empfindlich auf den Spreizvorgang ist beta-Tubulin. Unter bestimmten Bedingungen kann sich die Spindel, die im Wesentlichen von Tubulin umfaßte, wird beim Aufspreizen 3 erhalten. Visualisierung der Spindel ist oft nützlich, um Kerne von Interesse Stufe. , Visualisierung Tubulin erfordert jedoch eine Behandlung mit einer hohen Konzentration Haarfestiger; Spindeln sind unter den nachstehend beschriebenen Standardbedingungen verloren. Dieses Beispiel zeigt, dass bei der Analyse der Verteilung von einem zuvor nicht charakterisiertes Protein, ist es wichtig, die Konzentration an Fixiermittel, um zu bestimmen, wie empfindlich das Protein an eine solche Variation variieren. Trotz der Bedenken in Bezug auf die Auswirkungen der Verbreitung Bedingungen auf Chromosomenstruktur hat die Nützlichkeit und Leistung des Verteilungsmethode in vielen Zusammenhängen gezeigt und hat breite Anwendung in der mitotischen und Charakterisierung, insbesondere meiotischen Zellen 4-7. Two Verbreitung Methoden ausgiebig genutzt. Die erste dieser Methoden, die von Dresser and Giroux 8 entwickelt, vermeidet die Verwendung von Reinigungsmittel und Verbreitung Zubereitungen, die relativ gut erhaltene Chromosomen-Morphologie, wenn für die DNA-spezifische Farbstoff DAPI gefärbt zu haben scheinen zu ergeben. Allerdings ist dieses Verfahren relativ schwierig zu vervollkommnen und die Qualität der Ausbreitung Kerne variiert stark, wenn eine Region eines Schiebers zu anderen Regionen verglichen. Dieses Problem kann man quantitative Ansätze, die die Abbildung viele nicht ausgewählten Kerne von einer Folie zur Datenerfassung Verzerrungen zu vermeiden beinhalten erschweren. Die zweite Chromosomenverteilungsmethode, die von Loidl und Klein 1 entwickelt, beinhaltet Ausgleichs Fixierung durch Paraformaldehyd, mit Lyse und Chromatin Dekompression durch eine Reinigungslösung gefördert. Wenn sie richtig durchgeführt wird, gibt diese Methode sehr reproduzierbare Ergebnisse mit weniger Region zu Region Variation im Vergleich zum Dresser and Giroux Verfahren. Diese Präsentation konzentriert sich auf eine Modified Version des Verfahrens von Loidl und Klein, wegen ihrer Zuverlässigkeit und Einfachheit. Chromosom Verbreitung ist nicht kompliziert oder zeitraubende; bis zu 100 Objektträger für Immunfärbung an einem Tag hergestellt werden. Darüber hinaus können die Ausbreitung Vorbereitungen in der Tiefkühltruhe für die Jahre vor Immunfärbung gespeichert werden und damit Labore können ein Repository von gefrorenem Chromosomen-Spreads, die verwendet werden können, wenn neue biologische Fragen stellen oder neue Nachweisreagenzien zur Verfügung zu entwickeln. Das Chromosom verbreiten Verfahren wird am häufigsten in Kombination mit Immunfärbung und Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie verwendet, aber es ist auch möglich, Objektträger für die Super-Resolution-lichtmikroskopische Methoden wie Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie vorzubereiten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zymolyase</td>
			<td>US Biological&#160;</td>
			<td>Z1004</td>
			<td>Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4&#176;C until ready for use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipsol&#160;</td>
			<td>L.I.P. Ltd&#160;</td>
			<td>no longer commercially available</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>USB</td>
			<td>19628</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard coverslip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-E or 12-540-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>P-7417</td>
			<td>Prepare 0.2% (v/v) solution in water.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4&#176;C for up to a month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG (H+L) Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting media with DAPI</td>
			<td>Vector 
			Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-1</td>
			<td>Store slides containing dried spreads in slots at -20&#176;C. Also, use as a wet chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td>Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-816</td>
			<td>Use as a wash basin for slides.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

Das Aussehen der Ausbreitung Kerne kritisch, hängt von der Balance zwischen Chromosom Fixierung und de-Verdichtung. Selbst wenn die Reagenzien korrekt ausgeglichen werden, kann die Variation in dem Grad der Chromosom de Verdichten in den verschiedenen Regionen der gleichen Folie und / oder zwischen verschiedenen Folien auftreten. Somit sollte die Qualität der Aufstriche in einer bestimmten Region eines Schiebers beurteilt werden, bevor Bilder interpretiert werden. Die Wirkungen der &quot;?...

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Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Oberfläche Verbreitung und Immunfärbung von Hefechromosomen

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.9K Aufrufe.  University of Chicago. A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Serie: Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS Bauelementherstellung und Oberflächenmodifizierung

Forschung

Biologie

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Reinigung von Mitochondrien aus Hefezellen

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

Hefekolonie Embedding-Methode

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Chromatographische Reinigung von hoch aktiven Hefe Ribosomen

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunfärbung von Dissected Zebrafisch embryonale Herz

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

Avidität-basierte extrazelluläre Wechselwirkung Screening (AVEXIS) für die Erkennung von Scalable Low-Affinität extrazellulären Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

High-Throughput-Physikalische Kartierung von Chromosomen unter Verwendung von Automated<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...