Wir danken Emeka Ifedigbo für technische Unterstützung und Dr. Shivraj Tyagi für wertvolles Know-how. Wir danken auch der Harvard NeuroDiscovery Zentrum für Unterstützung bei der Mikroskopie. Diese Arbeit wurde teilweise durch eine American Heart Association Predoctoral gewähren 09PRE2250120 zu Hilaire Lam, und NIH Zuschüsse, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, verliehen an AMK Choi unterstützt.

Die gesamte Protokoll benötigt 2 Tage für Zell-Isolierungen aus tierischem Gewebe, 5-10 Tage für die Zell-Proliferation und eine zusätzliche 10-14 Tage für die Zelldifferenzierung bei Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche. Ein weiterer Tag ist für die Zelle Engagements und der Ernte von Proben erforderlich. 1. Isolierung von Maus Tracheobronchial Epithelzellen (MTEC). Hinweis: Alle nachfolgend beschriebenen Verfahren wurden überprüft und genehmigt von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss am Brigham and Womens Hospital / Harvard Medical School Area. Bevor Sie beginnen: <ul><li> Bereiten Ham &#39;s F12 Medien mit Antibiotika. Bis 250 ml Hams F12 Basalmedien (CellGro) add 2,50 ml einer 100 X Penicillin / Streptomycin (10 2 U/mL-10 2 mg / mL) Lösung und 250 mL einer 1000 X Fungizone Lösung. Lagerung bei 4 ° C für bis zu 4 Wochen. </li><li> Bereiten Sie eine Lösung von 0,15% Pronase. Add 15 mg Pronase bis 10 ml Hams F12 Medien mit Antibiotika. Machen Sie frisch und halten auf Eis bis zum Gebrauch. </li><li> Bereiten Sie eine saubere Arbeitsfläche und sterile OP-Instrumente geeignet für Kleintier-Chirurgie, und eine lamellare Gewebekultur Haube für die Zell-Isolierungen. Alle anderen Geräte gilt als Standard für die tierische Zellkultur einschließlich befeuchteten CO 2-Inkubatoren, kalten Raum, Tisch-Zell-Zentrifugen, das inverse Mikroskop und Einweg-Kunststoff-Pipette und Kultur ware. </li><li> Bereiten Kollagen I-Lösung (50 pg / mL in 0,02 N Essigsäure). Pipette 1,0 ml Kollagen-Lösung in jede Vertiefung einer 12-Well Transwell-Platte (Corning). Wrap in Parafilm und lassen Sie über Nacht stehen auf einer flachen Oberfläche bei Raumtemperatur. </li></ul><ol><li> Mit Hilfe eines im Handel erhältlichen Mausstamm (dh C57Bl / 6, männlich 6-8 Wochen alt), euthanize Mäusen mit einem anerkannten Methode der Sterbehilfe, wie CO 2-induzierte Narkose. In der Regel 6 Mäusen erbringt genügend Zellen (1.5-2.0 x 10 5 Zellen / Maus) das Seeding einer 12-well Transwell Platte. </li><li> Sprühen Sie die Tierkadaver mit 70% EtOH-Lösung, um das Feld zu sterilisieren. </li><li> Mit sauberen chirurgischen Schere und Skalpell, entfernen Sie die Haut um die trachealen Bereich, und setzen die Luftröhre. Öffnen Sie den Bauch, entlang des Brustbeins geschnitten, und entfernen Sie den Brustkorb. Entfernen Gewebe bis zum Ende der Luftröhre ausgesetzt ist. </li><li> Legen Sie Luftröhre in einen 50 mL konische Röhrchen mit 30 ml Hams F12 Medium mit Antibiotika, auf Eis. </li><li> In einem sterilen lamellar-Haube, Transfer Luftröhrengewebe eine sterile 100 mm Petrischale mit 10 ml Hams F12 Medium mit Antibiotika. </li><li> Sanft sezieren Bindegewebe mit einer sterilen Pinzette und chirurgische Schere. </li><li> Transfer Luftröhrengewebe, um eine neue 100 mm Petrischale mit 10 ml Hams F12 Medium mit Antibiotika zu spülen. Cut Luftröhre entlang der vertikalen Achse zu Lumen aussetzen. </li><li> Transfer Luftröhre zu einem 50-ml-Tube mit 10 ml 0,15% Pronase-Lösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Am zweiten Tag haben bereit: <ul><li> Bereiten Sie eine DNAse I-Lösung. Um 18 ml Hams F12 Medien mit Antibiotika 2 mL einer 10 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA)-Stammlösung und 10 mg rohes Pankreas DNAse I. mach 1 mL aliquotiert und bei -20 ° C (aufgetaut auf Eis vor der Verwendung). </li><li> Bereiten Ham &#39;s F12 Medium mit Antibiotika mit 20% fötalem Rinderserum (FBS). Zu 200 ml Hams F12 Basalmedien (Invitrogen) mit 50 mL hitzeinaktiviertem FBS, 2,5 ml einer 100 X Penicillin / Streptomycin (10 2 U/mL-10 2 mg / mL) Lösung und 250 mL einer 1000 X Fungizone Lösung . </li><li> Bereiten MTEC Basismedium mit Antibiotika. Um 475,5 mL DMEM/F12 basischen Medien (CellGro) add 7,5 ml 1 M HEPES-Lösung, 10 ml 200 mM Glutamin-Lösung, 2 ml einer 7,5% NaHCO 3-Lösung, 5 ml einer 100 X Penicillin / Streptomycin-Lösung, 500 mL einer 1000 X Fungizone Lösung </li><li> Bereiten MTEC medium/10% FBS. Um 45 ml MTEC grundlegende Medium mit Antibiotika, 5 ml hitzeinaktiviertem FBS. </li></ul></li><li> Schütteln Sie das Rohr (aus Schritt 1.8) 10-12 mal, und dann lassen Sie es für 30-60 Minuten stehen bei 4 ° C. </li><li> Fügen Sie 10 ml Hams F12 Medium mit 20% FBS und Antibiotika, um die Röhre und rock 12 mal. </li><li> Bereiten Sie 3 15 ml konische Röhrchen mit 10 ml Hams F12 Medium mit 20% FBS und Antibiotika. </li><li> Entfernen Luftröhren von Pronase-Lösung, abgesehen von dieser Lösung auf Eis. Transfer Luftröhre zum ersten konischen Rohr mit Hams F12 und das Röhrchen 12 mal. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei weitere Male. </li><li> Kombinieren Sie Pronase-Lösung mit den drei Überstände aus Schritt 1,13 in eine 50 ml Tube. Verbleibende Gewebe. </li><li> Zentrifugation bei 1400rpm (390 xg; Eppendorf 5810R-Zentrifuge mit einer A-4 bis 62 Rotor ausgestattet) für 10 min bei 4 ° C und Überstand verwerfen. </li><li> Vorsichtig das Pellet in 1 ml DNAse-Lösung (100-200 ul / Trachea)und inkubieren 5 min auf Eis. </li><li> Zentrifugation bei 1400rpm (390 xg) für 5 min bei 4 ° C und Überstand verwerfen. </li><li> Zellpellet in 8 ml MTEC-Medium mit 10% FBS </li><li> Platte Zellsuspension auf Primaria Platten (Falcon). Bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 95% Luft, 5% CO 2 für 5 Stunden (Anmerkung: Dies ist eine negative Selektion Schritt für Fibroblasten). </li><li> Sammeln Zellsuspension aus Platten und Spülen Platten zweimal mit 4 ml MTEC mit 10% FBS. Pool Zellsuspension und wäscht in einem 50 mL konischen Rohr. </li><li> Conserve 1 mL für Zytospin und Zellzählung. Spin in einer Tischzentrifuge für 5 min bei 5.000 rpm (Eppendorf 5415D). Nehmen Sie 500 mL und Pellet erneut in verbleibende Überstand. Verwenden Sie 100 ul zur Zellzählung mit dem Trypanblau Vitalfärbung Methode. Conserve 4 Aliquots von 100 ul für Zytospin Analyse </li><li> Spin restlichen 15 mL Zellsuspension bei 1400rpm (390 xg) bei 4 ° C für 10 min. </li></ol> 2. Vermehrung und Differenzierung von MTEC Bei Air-Liquid-Interface Bereiten Retinsäure Stammlösungen. Stammlösung A: Wiegen Retinsäure in der Dunkelheit (Herr 300,44 g / mol) zu einer 5 mM Stammlösung in 95% EtOH zu machen. Shop in eine Folie eingewickelt Rohr bei -80 ° C. Bei Bedarf bereiten Stammlösung B (5 pM) durch Zugabe von 50 ul Stock A, 500 mL BSA-Lösung (100 mg / mL) und 49,5 ml Hanks balanced salt solution (HBSS). Shop in eine Folie eingewickelt Rohr bei -80 ° C für bis zu 4 Wochen. Bereiten MTEC Verbreitung Medium mit Retinsäure. Auf 45,7 mL MTEC Basalmedien Antibiotika enthalten, fügen Sie 2,5 ml hitzeinaktiviertem FBS, 1 ml Retinsäure Lager B, 250 ul Insulin-Lösung (2 mg / ml Insulin in 4 mM HCl), 250 ul Epidermal Growth Factor-Lösung (5 g / mL EGF in HBS mit 1 mg / mL BSA), 200 ul Rinder Hypophysenextrakt (15 mg / mL in HBS mit 1 mg / mL BSA), 50 ul Transferrin-Lösung (5 mg / ml Transferrin in HBS mit 1 mg / mL BSA ), 50 ul Cholera-Toxin-Lösung (100 mg / mL in HBS mit 1 mg / mL BSA). Filter sterilisieren endgültigen Medien Herstellung und Verwendung innerhalb von 2 Tagen der Vorbereitung. <ol><li> Entfernen Kollagenlösung von Transwell Platten stehen lassen unter der Motorhaube für 5 min, und waschen mit PBS 2 mal. </li><li> Nach der Zentrifugation Zellpellet in einem geeigneten Volumen der Proliferation Medien (500 mL), um plating von 7,5 x 10 4 -1,0 x10 5 Zellen pro Vertiefung zu erleichtern. Pipette 500 ul Zellsuspension auf der apikalen Oberfläche der Transwell Polycarbonatmembran einzufügen. Fügen Sie 1,5 ml der Proliferation Medien, um die basale Kompartiment des Transwell. </li><li> Inkubieren Sie die versunkenen MTEC Kulturen bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 95% Luft, 5% CO 2 für 7-10 Tage. </li><li> Warten Sie drei Tage vor wechselnden Medien die erste Zeit. Ändern Medien jeden zweiten Tag. Monitor-Kulturen durch visuelle Inspektion und Messung der transepithelialen Zellwiderstand mit einer Elektrode (EVOM Ohmvoltometer, World Precision Instruments, Sarasota, FL). </li><li> Wenn die Zellen konfluent erscheinen und epithelialen Widerstandes erreichte heute 1000 Ω / cm 2, sind die Zellen bereit, bei ALI unterscheiden. </li><li> Bereiten MTEC Basalmedien mit 2% NuSerum. Add NuSerum zu MTEC Basismedium zu einer Endkonzentration von 2% V / V. Add Retinsäure Lager B bis zu einer Endkonzentration von 1 x 10 -7 M vor der Verwendung. Bereiten Sie frische und innerhalb von 2 Tagen. </li><li> Lassen Sie Zelle für 10-14 Tage zu differenzieren, indem apikalen Medien und Austausch der Basalmedien mit 750 ul MTEC Basalmedien mit 2% Nuserum und Retinsäure. Ändern Sie den Basalmedien und waschen der apikalen Seite mit MTEC mit 2% NuSerum jeden zweiten Tag. </li></ol> 3. Anwendung von Zigarettenrauch zu Cultured Epithelzellen <ol><li> Expose der apikalen Seite der Transwell Kulturen Mainstream Zigarettenrauch mit einem CS Zellexposition System (EMI Instruments, Pittsburgh, PA). Siehe Abbildung 1 für Photographie des Apparates. Siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte für technische Spezifikationen. Kurz gesagt, besteht die Vorrichtung aus einer Schlauchpumpe, die jede Zigarette raucht in ~ 7-8 Züge, Zeichnung in den Mainstream Rauch in einem Polypropylen-Linie, die einen belüfteten Exposition Kammer verbunden ist. Die Exposition Kammer bei 37 ° C durch zirkulierendes Wasser, und bei einer Atmosphäre von 5% CO 2 auf eine Gasleitung. Die Zellen können, um den Rauch mit Kentucky 3R4F Forschung Verweis Filterzigaretten (The Tobacco Research Institute, University of Kentucky, Lexington, KY) ausgesetzt werden. Typischerweise Zellen sind, um den Rauch von 1 bis 2 Zigaretten ausgesetzt, wodurch 100-200 mg / m 3 von insgesamt Feinstaub (TPM). Control-Kulturen werden Raumluft und für ein gleichwertiges Expositionszeit ausgesetzt. </li><li> Das TPM ist nach dem Protokoll des Herstellers mit dem TE geliefert gemessen-10c Rauchmaschine (Teague Enterprises). Kurz gesagt, ist ein Filter (Pallflex) in ein Inline-Edelstahl-Halter auf einem Entnahmerohr, der von der Probenahme-Anschluss auf der Räucherkammer, um eine konstante Strömungspumpe (Abtasteinheit) platziert. Ein Abfluss Schlauch verbindet die Abtasteinheit eine Gasuhr (Dry Gas Meter, ONM61, 67, AEM). Der Filter wird vor und nach der Gasentnahme gewogen. Das gesamte Material abgelagert auf dem Filter in mg ist für das Gesamtvolumen der Luftproben normalisiert. </li><li> Die Zellen können dann zu jedem Zeitpunkt (dh, 0-24 Uhr) nach der Exposition für Standard-Zell-analytische Verfahren (dh, Western Immunoblot-Analyse, mRNA-Analyse, etc.) oder Mikroskopie (dh, konfokale oder Elektronenmikroskopie) geerntet werden. Die Kulturmedien kann auch für Cytokine oder LDH-Freisetzung für Zytotoxizitätsassays analysiert werden. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Erfolgreiche epithelialen Isolation, Proliferation und Differenzierung bei ALI sollte eine intakte Monolayer mit einem Pflasterstein-Morphologie zu erhalten. Transepithelilal Zellwiderstand von gesunden Kulturen sollten ca. 1000-2000 Ω / cm 2 sein. Abbildung 2 zeigt eine Monoschicht von Maus respiratorischen Epithelzellen für Epithelzellen und Cilien Marker unter Kontrollbedingungen und nach Zigarettenrauch Exposition gefärbt. Abbildung 3 zeigt repräsentative elektronenmikroskopische Aufnahmen von gesunden MTEC Kulturen darstellt Ultrastruktur und Zilien Morphologie. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Vorbereitung von Epithelzellen durchläuft drei Phasen, eine Isolierung Schritt, eine Ausbreitung der Bühne, und eine Differenzierung der Bühne an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (Schema). Epithelzellen sind von der Maus Luftröhre, auf Transwells, wo sie sich vermehren in Submerskultur ausgesät isoliert und dann in die Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, wo sie in vollem Umfang zu differenzieren umgewandelt. Experimente sind in der Regel am 24. Tag der kontinuierlichen Kultur durchgeführt. Das Bild zeigt ein Modell-System für die Belichtung von kultivierten Zellen zu Mainstream-Zigarette zu rauchen. Ein Transwell ALI Kultur ist innerhalb einer benutzerdefinierten modular Zigarettenrauch Lieferung System, das für Temperatur, Luftfeuchtigkeit und CO 2 gesteuert wird gestellt. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2 Epitheliale Zellkulturen wurden fixiert und Zellkerne (Hoechst 33258), F-Aktin (grün; Alexa-Fluor-488-konjugierten Phalloidin). Und die Zilien Marker acetyliertes α-Tubulin (rot, Cy3-konjugierten sekundären Antikörper). Die unteren Bilder zeigen gleichwertige Bilder von Epithelzellen 4 Stunden nach der Exposition gegenüber Tabakrauch (2 Zigaretten, 150 mg / m 3). (B) Lactatdehydrogenase (LDH)-Freisetzung wurde im Basalmedium 24 Stunden nach der Exposition gegenüber unterschiedlichen Dosen von Zigarettenrauch wie angegeben gemessen. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Air-Liquid-Interface Kulturen von Epithelzellen aus der Maus trachealen Epithel isoliert in mehrere Subtypen unterschieden, die durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) haben die Eigenschaften von Flimmerepithel, basal, und nicht Flimmerzellen 1. Diese Zellen sind typisch pseudostratified respiratorischen Epithels. Abbildung Etiketten entsprechen: bb: Basaltemperatur, a: Axonem, m: Mitochondrien, n: Kern, s: Substrat (Polycarbonat-Membran), mv: microvili

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Das Protokoll beschreibt Isolierung von Maus tracheale Epithelzellen aus den Protokollen der Sie et al angepasst., 1, und andere 2-3 mit Modifikationen. Wie bei jedem Protokoll beschreibt Zelle Isolationen, ist der wichtigste Aspekt, um eine Verunreinigung durch bakterielle oder pilzliche Erreger durch strikte aseptische Techniken zu vermeiden. Ein zweiter wichtiger Schritt ist, Fibroblasten-Kontamination der Kulturen, die durch sorgfältige Präparation der Luftröhre vermieden werden kö...

* Die Zigarettenrauchen Maschine ist eine speziell entwickelt und gefertigt 14 &quot;x14&quot; x20 &quot;Dual gekammert und mit Wassermantel hellen Farbton klarer Beweis dafür, 1 / 2&quot; dicken Polycarbonat Lexan Kammer für Zigarettenrauch Exposition mit der Temperatur gesteuert, Wasserstand Sensor gesteuert off-System abgeschaltet. Eine Zigarette rauchen / schnaufend ist für eine variable Zigarette paffte Tarife installiert. Wenn das Gerät in Betrieb ist, imitiert sie einen Inkubator in dem Sinne, dass die Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Kohlendioxid in das System gesteuert werden. Das System umfasst: (I) eine maßgeschneiderte Zweikammer-/ Wasser-ummantelten Einheit, die eine kontrollierte Umgebung für Gewebekultur Experimente unterhält. (II) Eine digitale Hochleistungs-, hohe Präzision Doppelpumpe Wassertemperatur Thermostat mit Wasserstandssensor und Temperaturregelung (III) Eine Zigarette rauchen Einheit mit schnaufend Pumpe. (IV) A Pumpzyklus Sensorsteuerung Rate Cycler (IV) A Edelstahl hohe Präzision in-Line Filterhalter. (V) Ein abnehmbarer Deckel montiert 11 / 2 &quot;Größe axiale Gleichmäßigkeit Zigarettenrauch Umluftgebläse. (VI) Ein mittlerer Größe Wasserbad mit Halterung für die Wasser-Pumpe. (VII) A 1 / 2&quot; dicken Plexiglas Tablett mit Halterungen für die puff Pumpe und Halter für Zigarettenasche Sammler. Diese Maschine, wie beschrieben, kann mit ähnlichen im Handel erhältlichen Rauchen Maschinen wie der Art zur Verfügung, die von TSE-Systeme (ersetzt <a href="http://www.tse-systems.com">www.tse-systems.com</a> ).

isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface

Pulmonale Epithelzellen aus den Atemwegen von Mäusen und kultiviert bei Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) als ein Modell der differenzierten respiratorischen Epithels isoliert werden. Ein Protokoll ist für die Isolierung und die Preisgabe dieser Zellen Mainstream Zigarettenrauch (CS) beschrieben, um epithelialen Zell-Antworten auf CS Exposition zu studieren. Das Protokoll besteht aus drei Teilen: der Isolierung von Epithelzellen der Atemwege von der Maus Luftröhre, die Kultivierung dieser Zellen an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) als ausdifferenzierten Epithelzellen und die Lieferung von kalibrierten Mainstream CS, diese Zellen in Kultur. Die ALI Kultur-System ermöglicht die Kultur des respiratorischen Epithelien unter Bedingungen, die mehr ähneln ihren physiologischen Einstellung als gewöhnliche flüssige Kultur-Systemen. Die Untersuchung der molekularen und zellulären Reaktionen auf Lunge CS Exposition ist ein kritischer Faktor für das Verständnis der Auswirkungen von Umweltfaktoren Luftverschmutzung auf die menschliche Gesundheit. Forschungsergebnisse in diesem Bereich kann letztlich zum Verständnis der Ätiologie der chronisch-obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) und andere Tabak-bedingten Krankheiten, die wichtigsten globalen Gesundheitsprobleme darstellen beitragen.

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Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Pulmonale Epithelzellen aus den Atemwegen von Mäusen isoliert und kultiviert bei Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche als ein Modell der differenzierten respiratorischen Epithels. Ein Protokoll ist für die Isolierung, Kultivierung und Freilegen dieser Zellen zu Mainstream Zigarettenrauch beschrieben, um molekulare Antworten zu diesem Umweltgift zu studieren.

Isolierung von Maus respiratorischen Epithelzellen und der Exposition gegenüber Experimental Zigarettenrauch bei Air Liquid-Interface

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

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Research

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Serie: Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

Experimentelle Menschliche Pneumokokken Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Forschung

Medizin

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolation, Kryokonservierung und Kultur der Menschen Amnion Epithelzellen für Klinische Anwendungen

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

Automatisierte Messung von Lungenemphysem und Klein Airway Remodeling im Zigarettenrauch ausgesetzten Mäuse

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolierung und Kultur Expansion von tumorspezifischen Endothelzellen

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Comparing the Effects of Electronic Cigarette Vapor and Cigarette Smoke in a Novel In Vivo Exposure System

Electronic cigarettes (E-cigarettes) are being widely used, and growing in popularity. It is estimated that more than 9 million adults use them regularly. The potential adverse health effects of electronic cigarette vapor (E-vapor) exposure are poorly defined. While several animal models of E-vapor exposure have been developed, few models expose rodents to clinically relevant quantities of nicotine and make direct comparisons to cigarette smoke within the same exposure system. Here, we present a method for constructing and operating an E-vapor chamber and cigarette smoke chamber. The chambers are constructed by outfitting anesthesia chambers with a computer controlled pumping system that delivers consistent amounts of E-vapor or cigarette smoke to rodents. Nicotine exposure is measured indirectly by quantifying pre and post-exposure serum cotinine levels. This exposure system can be modified to accommodate various types of E-cigarettes&#160;and tobacco cigarettes, and can be used to compare the effects of E-vapor&#160;and cigarette smoke in vivo.

Comparing the Effects of Electronic Cigarette Vapor and Cigarette Smoke in a Novel In Vivo Exposure System

This protocol describes a method for exposing rodents to electronic cigarette vapor (E-vapor) and cigarette smoke. Exposure chambers are constructed by modifying anesthesia chambers with an automated pumping system that delivers E-vapor or cigarette smoke to rodents. This system can easily be modified to accommodate many experimental endpoints.

Vergleich der Effekte von elektronischen Zigarettendampf und Zigarettenrauch in einem Roman<em&gt; In vivo</em&gt; Belichtungssystem

Electronic cigarettes (E-cigarettes) are being widely used, and growing in popularity. It is estimated that more than 9 million adults use them regularly. ...

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high incidence in aging populations. The current conventional therapies for COPD focus mainly on symptom-modifying drugs; thus, the development of new therapies is urgently needed. Qualified animal models of COPD could help to characterize the underlying mechanisms and can be used for new drug screening. Current COPD models, such as lipopolysaccharide (LPS) or the porcine pancreatic elastase (PPE)-induced emphysema model, generate COPD-like lesions in the lungs and airways but do not otherwise resemble the pathogenesis of human COPD. A cigarette smoke (CS)-induced model remains one of the most popular because it not only simulates COPD-like lesions in the respiratory system, but it is also based on one of the main hazardous materials that causes COPD in humans. However, the time-consuming and labor-intensive aspects of the CS-induced model dramatically limit its application in new drug screening. In this study, we successfully generated a new COPD model by exposing mice to high levels of ozone. This model demonstrated the following: 1) decreased forced expiratory volume 25, 50, and 75/forced vital capacity (FEV25/FVC, FEV50/FVC, and FEV75/FVC), indicating the deterioration of lung function; 2) enlarged lung alveoli, with lung parenchymal destruction; 3) reduced fatigue time and distance; and 4) increased inflammation. Taken together, these data demonstrate that the ozone exposure (OE) model is a reliable animal model that is similar to humans because ozone overexposure is one of the etiological factors of COPD. Additionally, it only took 6 - 8 weeks, based on our previous work, to create an OE model, whereas it requires 3 - 12 months to induce the cigarette smoke model, indicating that the OE model might be a good choice for COPD research.

This study describes the successful generation of a new chronic obstructive pulmonary disease (COPD) animal model by repeatedly exposing mice to high concentrations of ozone.

Generation von eine chronisch obstruktive Lungenerkrankung-Modell bei Mäusen durch wiederholte Ozonbelastung

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to gases, particles or complex atmospheres (e.g., cigarette smoke), thus providing realistic physiological exposure of the apical surface of the human alveolar region to air. In contrast to sequential exposure models with linear aerosol guidance, the modular design of the radial flow system meets all requirements for the continuous generation and transport of the test atmosphere to the cells, a homogenous distribution and deposition of the particles and the continuous removal of the atmosphere. This exposure method is primarily designed for the exposure of cells to airborne particles, but can be adapted to the exposure of liquid aerosols and highly toxic and aggressive gases depending on the aerosol generation method and the material of the exposure modules.
Within the framework of a recently completed validation study, this exposure system was proven as a transferable, reproducible and predictive screening method for the qualitative assessment of the acute pulmonary cytotoxicity of airborne particles, thereby potentially reducing or replacing animal experiments that would normally provide this toxicological assessment.

We present a robust, transferable and predictive in vitro exposure system for the screening and monitoring of airborne particles concerning their acute pulmonary cytotoxicity by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface (ALI).

Bewertung der akuten Inhalationstoxizität von Luftpartikeln durch Aussetzen kultivierter menschlicher Lungenzellen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear formulations that prevent cell desiccation will result in ocular surface protection and the maintenance of cell metabolic activity. During dehydration, cells undergo the process of loss of metabolic activity and subsequently cell death. This work describes a method for assessing the efficacy of artificial tear formulations. The metabolic dye (i.e., alamarBlue) changes from a low fluorescent molecule resazurin to a fluorescent molecule resorufin in viable cells. The biological performance of an artificial tear formulation is measured as the ability of the formulation to (a) maintain cell viability and (b) provide cell protection from desiccation. Growth media and saline are used as controls for the cell viability/desiccation tests. Cells are incubated with test solutions for 30 min and then desiccated for 0 or 5 min at 37 &#176;C and 45% relative humidity. Cell metabolic activity after initial exposure and after cell desiccation is then determined. The results show the comparative effects of eye drop formulations on cell metabolic activity and desiccation protection. This method can be used to test dry eye formulations that are designed to treat individuals with evaporative dry eye.

The purpose of this protocol is to evaluate if different artificial tear formulations can protect human corneal epithelial cells from desiccation using an in vitro model. After exposure to artificial tear formulations and desiccation, human corneal epithelial cells are assessed for metabolic activity.

Wirkung künstlicher Tränenformulierungen auf die Metabolische Aktivität menschlicher Hornhautepithelzellen nach Exposition gegenüber Dericcation

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

Induktion und Analyse von oxidativem Stress in Dornröschen-Transposon-transfizierten menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

Endothelial cells (ECs) are crucial for vascular and whole-body function through their dynamic response to environmental cues. Elucidating the transcriptome and epigenome of ECs is paramount to understanding their roles in development, health, and disease, but is limited in the availability of isolated primary cells. Recent technologies have enabled the high-throughput profiling of EC transcriptome and epigenome, leading to the identification of previously unknown EC cell subpopulations and developmental trajectories. While EC cultures are a useful tool in the exploration of EC function and dysfunction, the culture conditions and multiple passages can introduce external variables that alter the properties of native EC, including morphology, epigenetic state, and gene expression program. To overcome this limitation, the present paper demonstrates a method of isolating human primary ECs from donor mesenteric arteries aiming to capture their native state. ECs in the intimal layer are dissociated mechanically and biochemically with the use of particular enzymes. The resultant cells can be directly used for bulk RNA or single-cell RNA-sequencing or plated for culture. In addition, a workflow is described for the preparation of human arterial tissue for spatial transcriptomics, specifically for a commercially available platform, although this method is also suitable for other spatial transcriptome profiling techniques. This methodology can be applied to different vessels collected from a variety of donors in health or disease states to gain insights into EC transcriptional and epigenetic regulation, a pivotal aspect of endothelial cell biology.

The protocol describes the isolation, culture, and profiling of endothelial cells from human mesenteric artery. Additionally, a method is provided to prepare human artery for spatial transcriptomics. Proteomics, transcriptomics, and functional assays can be performed on isolated cells. This protocol can be repurposed for any medium- or large-size artery.