The authors acknowledge financial support from the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

HINWEIS: Plazenten sollte von Singleton gesunde Schwangerschaft gesammelt werden, mit einer Vorliebe für tigen Kaiserschnitt Abschnitte. Geschrieben sollte informierte Zustimmung zur Sammlung ihrer Plazenta gegeben werden. Ihre einschlägigen Menschen Forschung Ethik-Kommission sollte die Genehmigung alle Sammlung und Verwendung von menschlichen Geweben. 1. Isolierung von Amnion Epithelzellen <ol style="margin-left: 40px;"><li> Legen Sie die Plazenta auf eine sterile Oberfläche innerhalb einer Klasse II Sicherheitswerkbank. </li><li> Verwendung steriler Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS), wasche die so viel Blut wie möglich aus der Plazenta Oberfläche und Membranen. </li><li> Mit der Plazenta mit der Nabelschnur nach oben eingelegt, mechanisch trennen den äußeren Rand der Amnion und Chorion Membranen. </li><li> Einmal getrennt, manuell die Amnionmembran Streifen aus dem Chorion Membran der Plazenta, die rund um die Kante der Membran in Richtung der Nabelschnur. HINWEIS: Tö Beul, alle Stücke von verunreinigenden Chorion Membran aus dem Amnion zu entfernen. </li><li> Mit Hilfe einer sterilen Schere, schneiden Sie die Amnionmembran ca. 2 cm von der Basis der Nabelschnur und in einen 500-ml verschlossenen Behälter mit 250 ml HBSS. </li><li> Gründlich durch Schütteln des verschlossenen Flasche, die die Amnionmembran waschen. </li><li> Entfernen Sie die Amnionmembran aus dem Auffangbehälter mit einer sterilen Pinzette und Ort in eine 15 cm Petrischale. </li><li> Schneiden Sie die Amnionmembran in ca. 5 cm lang (bei vertikal mit einer Pinzette gehalten) Stücke, Verwerfen blutiger oder Papierreste. </li><li> Platz in einem 500 ml verschlossenen Behälter und wäscht mit 250 ml HBSS etwa 3-5 mal, oder bis die Amnionmembran durchscheinend ohne gefährdend Blut. HINWEIS: Jede Blut kann die Effizienz der enzymatischen reduzieren Abbaulösung. </li><li> Übertragen Sie alle Stücke von Amnionmembran in einen Behälter mit 50 ml der enzymatischen Abbaulösung, wobei darauf zuminimieren Trag von HBSS. </li><li> Inkubieren Sie die Amnion Stücke in enzymatischen Abbaulösung im Wasserbad oder warmen Raum bei 37 ° C für 15 min unter leichtem Schütteln, um alle verbleibenden Blut zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie die Amnionmembran Stücke aus der enzymatischen Abbaulösung und in einen neuen sterilen Behälter. </li><li> 100 ml frischer Enzymanalysenlösung in den Amnionmembran und bei 37 ° C für 60 min in einem Wasserbad oder warmen Raum unter leichtem Schütteln (erste Verdauung). </li><li> Entfernen Sie die Amnionmembran Stücke aufnehmen und in neue Container kümmert, damit die enzymatischen Abbaulösung von jedem Membranstück abtropfen lassen. ANMERKUNG: Diese kann durch Ziehen Amnion Stücke entlang der Innenrand des Behälters erreicht werden. </li><li> 100 ml frischer Enzymanalysenlösung in der Amnionmembran Stücke und Inkubation 60 min in einem Wasserbad oder warmen Raum bei 37 ° C unter leichtem Schütteln (zweite Verdauung). </li><li> Übergeben Sie die Zellschutzsperreauf aus Schritt 1.14 durch einen 70 um-Filter und Zentrifuge bei 1.000 × g für 10 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 4 ml HBSS, enthaltend 1 mg / ml Sojabohnenbasis-Enzym-Inhibitor. Sanft wiederholt Pipette mit einer 1 ml Pipette in eine Einzelzellsuspension zu erhalten. HINWEIS: In diesem Stadium Zellen auf Eis gelassen werden, bis die Zellen von der zweiten Digest sind im gleichen Stadium der Verarbeitung. </li><li> Entfernen Sie die Amnionmembran Stücke aufnehmen und in neue Container kümmert, damit die enzymatischen Abbaulösung von jedem Membranstück abtropfen lassen. ANMERKUNG: Diese kann durch Ziehen Amnion Stücke entlang der Innenrand des Behälters erreicht werden. </li><li> Übergeben Sie die Zellsuspension aus Schritt 1.18 durch einen 70 um-Filter und Zentrifuge bei 1.000 × g für 10 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 4 ml HBSS, enthaltend 1 mg / ml Sojabohnenbasis-Enzym-Inhibitor. Gently wiederholt pipettieren mit einer 1 ml pipette um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. </li><li> Pool-Zellen aus den beiden verdaut, oder alternativ halten Zelle verdaut, getrennt, bis nach der Zellzahl. HINWEIS: Dies verhindert, dass das Mischen von potenziell geringen Lebensfähigkeit Zellen mit hoher Tragfähigkeit Zellen. </li><li> Hinzufügen HBSS auf ein Endvolumen von 10-20 ml und führen Zellzahlen unter Verwendung von Trypanblau zur Rentabilität zu messen. </li><li> Bestätigen Sie den epithelialen Zell-Phänotyp mittels Durchflusszytometrie. Make up geeigneten Antikörper-Cocktails mit anti-EpCAM-PE (1: 2 Verdünnung) anti-CD90-PeCy5 (1: 250) und anti-CD105-APC (1: 100) in HBSS. </li><li> Resuspendieren eine Untergruppe von Zellen von einer oder beiden Digests in der Antikörpermischung in einer Konzentration von 25 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Für die Durchflusszytometrie Fleck 1 x 10 6 Zellen mit Antikörper-Cocktails, die Isotypkontrollen (z. IgG1 Isotyp-Kontroll-PE + Anti-CD90-PeCy5 + anti-CD105-APC). Halten ~ 1 x 10 6 Zellen ungefärbt für Durchflusszytometer Set-up. </li><li> Zellen in Antikörper-InkubationCocktails bei 4 ° C für 60 min. </li><li> Wasche die Zellen 3x in HBSS resuspendieren bei 5 bis 10 Millionen Zellen pro ml für die Durchflusszytometrie. </li><li> Führen Durchflusszytometrie und Anmerkungs Ergebnisse. Die Reinheit des Zell Isolat (der Prozentsatz der EpCAM-positive und CD90 / CD105-negativen Zellen) wird erwartet, dass 90 bis 95% und &lt;1% betragen. </li><li> Beiseite eine geeignete Anzahl von Zellen für den Test geeignete Qualitätskontrolle oder Freigabekriterien wie Endanwendung bestimmt. Hinweis: das kann Krankheit / Virus Screening oder andere Sicherheit oder biologischen Kriterien umfassen. </li><li> Für die übrigen Zellen, folgen Sie der Kryokonservierungsprotokolls oder alternativ direkt in die Kultur (direkt an Kultur Schritt 3.6). </li></ol> 2. Kryokonservierung von hAECs <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit mit Durchflusszytometrie Daten oder manuelle Zählung mit Trypanblau-Ausschluss. </li><li> Zentrifuge bei 700 × g für 5 min. </li><li> Resuspendieren Zells von 1-10 Millionen Zellen pro ml in Tierproduktfreien Kryokonservierung Medien. </li><li> Pipettieren ein geeignetes Volumen der Zellen in die O-Ring-Kryokonservierung Fläschchen aufnehmen und in einer kontrollierten Rate Gefriervorrichtung, wo die Abkühlung tritt bei etwa 1 ° C / min bis -80 ° C erreicht wird. </li><li> Übertragen Fläschchen in flüssigem Stickstoff zur Langzeitlagerung. </li></ol> 3. Auftauen und Kultur Cyropreserved hAECs <ol style="margin-left: 40px;"><li> Entfernen Kryokonservierung Fläschchen aus flüssigem Stickstoff und legen auf Eis. HINWEIS: Für die Übertragung nur - schnell weiter zum nächsten Schritt. </li><li> Auftauen Kryokonservierung Ampullen schnell bei 37 ° C, bis nur noch ein kleines Stück (~ 5 mm x 5 mm) des Eises verbleibt. Hinweis: Es ist wichtig, dass die Zelllösung nicht erwärmt, um die toxischen Wirkungen von DMSO bei der Kryokonservierung Medien reduzieren. </li><li> Verdünne Kryokonservierung Medium 10-fach mit kaltem (ca. 4 ° C) serumfreien Medien, tropfenweise in einer geeigneten Größed Rohr oder Behälter. </li><li> Zentrifuge bei 700 × g für 5 min bei RT. </li><li> Ein Resuspendieren in serumfreien Medium, um eine ungefähre Konzentration von 1 Million Zellen pro ml. Bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit mit automatisierten oder manuellen Zählung mit Trypanblau-Ausschluss. Erwartete Lebensfähigkeit nach dem Auftauen werden 5-10% weniger als vor der Kryokonservierung Lebensfähigkeit. </li><li> Plattenzellen auf Standard-Zellkultur behandelten Kunststoffwaren, oder alternativ Typ-I-Kollagen zu beschichten Kulturoberflächen. </li><li> Für Typ-I-Collagen-Beschichtung folgen das Protokoll unter <ol><li> Bereiten säurelöslichem Kollagen Typ I aus der menschlichen Plazenta (15 mg Kollagen mit 25 ml entionisiertem Wasser und 50 ul Eisessig). </li><li> Bedeckung Becherglas mit Parafilm und rühren mäßig bei 37 ° C bis Kollagenstränge gelöst sind. </li><li> Sterile Filtercollagenlösung unter Verwendung einer 0,22 um-Filter. </li><li> Verdünnen Sie die gefilterten Kollagen Lager 01.10 mit VE-Wasser. Diese verdünnte Lager ist die Arbeits concentration Lösung für die Beschichtung von Kunststoff-und Membranoberflächen. </li><li> Kollagen-Kunststoff, Glas und Membranoberflächen für 2 h bei RT bei 37 ° C oder O / N bei 2-8 ° C. </li><li> Entfernen überschüssiger Flüssigkeit von der beschichteten Oberfläche, und lassen Sie sie O / N trocknen. </li><li> Spülen Sie mit sterilen Gewebekultur-Wasser oder HBSS vor der Einführung von Zellen und Medium. </li></ol></li><li> Platte hAECs in einer Dichte von 25.000 Zellen / cm 2 in einem serumfreien Medium und ermöglichen die Befestigung an für 72-96 h auf. </li><li> Nach Anlegen Verändern Medien durch vorsichtiges Ansaugen und Ersetzen mit einem geeigneten Volumen an Serum-freies Medium alle 2-3 Tage. </li><li> Passage-Zellen mit dem untenstehenden Protokoll <ol><li> Absaugen von Zellkulturmedien und wäscht mit 1x Volumen an sterilem HBSS </li><li> Hinzufügen 1x Volumen von enzymatischen Abbaulösung und Inkubation für 5-15 Minuten oder bis Zellen beobachtet Ablösen von der Zellkulturoberfläche. </li><li> Sammeln enzymatische Verdauung Lösung, die Zellen, die Gewährleistung cells werden aus der Zellkulturoberfläche durch wiederholtes Pipettieren des enzymatischen Aufschlußlösung vor der Zellkulturoberfläche abgelöst </li><li> Zentrifuge bei 700 × g für 5 min. </li><li> Zellpellet in einem geeigneten Volumen an HBSS mit 1 mg / ml Sojabohnenbasis Enzyminhibitor. Sanft wiederholt Pipette mit einer 1 ml Pipette in eine Einzelzellsuspension zu erhalten. </li><li> Serumfreies Medium hinzuzufügen einer ungefähren Konzentration von 1 Million Zellen / ml. Bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit mit automatisierten oder manuellen Zählung mit Trypanblau-Ausschluss. </li><li> Platte hAECs in einer Dichte von 25.000 Zellen / cm 2 in einem serumfreien Medium und mit Standardkultivierungsverfahren fortzusetzen. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Es gibt mehrere kritische Parameter, die erhebliche Auswirkungen auf den Erfolg dieser Methode haben können. Speicherung der Plazenta oder Amnion für 3 h vor der Isolierung hAECs kann logistischer oder Planungszwecke wünschenswert sein, es wird jedoch empfohlen, dass das Gewebe so schnell wie möglich verarbeitet werden. Wenn Gewebe gelagert werden soll, ist es empfehlenswert, dass der Lagerung nach der Präparation und Waschen der Amnionmembran geführt werden. Amnion in sterile HBSS mit Antibiotika bei 4 ° C gelag...

Zellen von perinatalen Quellen, wie Plazenta, Plazentamembranen, Nabelschnur und Fruchtwasser abgeleitet haben die Aufmerksamkeit von Forschern und Klinikern als potentielle Quelle von Zellen für die regenerative Medizin 1,2 angezogen. Der Grund für dieses Interesse ist, dass diese Zelltypen besitzen alle ein gewisses Maß an Plastizität und immunmodulatorische Fähigkeit 3, Eigenschaften, die von grundlegender Bedeutung für ihre mögliche therapeutische Anwendungen geeignet sind. hAECs sind eine heterogene Population Epithelzellen, die aus Laufzeit oder vorzeitigen Amnionmembran 4 abgeleitet werden kann, wodurch ein reichliches potentielle Quelle für regenerative Zellmaterial. Die Eigenschaften, die hAECs ansprechend als Zelltherapie machen gehören ihrer Multi, geringe Immunogenität und entzündungshemmende Eigenschaften. hAECs gefunden wurden hochmulti sowohl in vitro als auch in vivo, zur Differenzierung zu mesodermalen Abstammungslinien zu sein (cardiomyocytes, Muskelzellen, Knochenzellen, Fettzellen), endodermalen Linien (Bauchspeicheldrüsenzellen, Leberzellen, Lungenzellen) und ektodermalen Linien (Haare, Haut, Nervenzellen und Astrozyten) 5-10. Beruhigend, trotz ihrer Multipotenz hAECs Sie nicht, entweder Form Tumoren erscheinen oder zu fördern Tumorentwicklung in vivo. Darüber hinaus sind auch hAECs Immun privilegierten, zum Ausdruck geringe Klasse II Human-Leukozyten-Antigene (HLA) 8. Diese Eigenschaft wahrscheinlich zugrunde ihre Fähigkeit, Immunabstoßung nach allogener und xenogener Transplantation zu entgehen, wie in Studien mit immunkompetenten Affen, Kaninchen, Meerschweinchen, Ratten und Schweine von 11 bis 13 gezeigt. hAECs anzuzeigen potente immunmodulatorische und immunsuppressive Eigenschaften und bieten somit erhebliche praktische Vorteile für potentielle klinische Anwendungen bei Autoimmunerkrankungen Therapie. hAECs sind vermutlich immunmodulatorische Funktionen sowohl auf der angeborenen und adaptiven Immunsystem auszuüben. Aufe der Mechanismen vorgeschlagen, ist durch die Sekretion von immunmodulatorische Faktoren 14. Aktuelle Anwendungen der hAECs in vorklinischen Tierkrankheitsmodellen gehören die Behandlung von Schlaganfall, Multiple Sklerose, Lebererkrankungen, Diabetes und chronischen und akuten Lungenerkrankungen. Forscher haben Interesse an der Nutzung hAECs um nach Schlaganfall Gehirn Entzündung aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften gezeigt. Es gibt Hinweise darauf, dass hAECs die Blut-Hirn-Schranke, wo sie engraft überqueren können, überleben für bis zu 60 Tage, zu differenzieren zu Neuronen, verringern Entzündungen und fördern Regeneration geschädigter Gewebe des zentralen Nervensystems in Tiermodellen für neurologische Erkrankungen 15. hAECs bieten die Möglichkeit, gezielt und Rückwärts mehrere pathologische Wege, die zu der Entwicklung und Progression von Multipler Sklerose bei. Beispielsweise ergibt sich aus der präklinischen Tierstudien legen nahe, dass hAECs stark immunsuppressive undpotenziell induzieren peripheren Immuntoleranz und Reverse laufenden Entzündungsreaktionen. hAECs haben auch gezeigt, dass die Fähigkeit, in vivo in neurale Zellen zu differenzieren und zu verbessern endogenen Neuroregeneration durch die Sekretion einer Vielzahl von neurotrophen Faktoren 16 haben. Mensch und Nager Amnion Epithelzellen haben bereits ihre therapeutische Wirksamkeit nachgewiesen für die Behandlung von Lebererkrankungen in Tiermodellen. In einem Tetrachlorkohlenstoff Schäden Induktions Modell einer Lebererkrankung, HAEC Transplantation führen zur Verpflanzung von lebensfähigen hAECs in der Leber, in Begleitung mit reduzierter Hepatozyten Apoptose und Verminderung der Leberentzündung und Fibrose 17. hAECs kann ausgedrückt Pankreas Faktoren, einschließlich Insulin und Glucose-Transporter stimuliert werden. Mehrere Studien haben das Potenzial für hAECs den Blutglucosespiegel in diabetischen Mäusen 18 wiederherzustellen sucht. In Mäusen, diehAECs verringerte beide Tierkörpergewicht und den Blutzuckerspiegel auf ein normales Niveau nach der Injektion von Zellen. Diese Studien stellen ein starkes Argument für den Einsatz von hAECs zur Behandlung von Diabetes mellitus. hAECs haben eine nachgewiesene Rolle bei der Prävention und Reparatur von experimentellen akuten und chronischen Lungenschädigung in Erwachsenen und Neugeborenen-Modelle 19. Diese Studien zeigten, dass hAECs Differenzierung in vitro in funktionaler Lungenepithelzellen exprimieren multiple Lungen-assoziierten Proteine, einschließlich Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), des Ionenkanals, die bei Patienten mit zystischer Fibrose 20 mutiert ist. Außerdem, wenn hAECs an den verletzten Erwachsenen und Neugeborenen Lunge zugeführt, die reparative Wirkungen auszuüben sie über die Modulation der Immunzellen, wodurch Lungen Leukozytenrekrutierung, einschließlich Neutrophilen, Makrophagen und Lymphozyten 21-23. Angesichts ihrer Hülle und Fülle,Sicherheitsbilanz und bewährte klinische Anwendungen für mehrere Krankheiten, klinische Studien mit hAECs ist unvermeidlich. Mit dem Ziel, beschleunigte Umsetzung HAEC Therapien in klinischen Studien-entwickelten wir Methoden, um in einer für die klinischen Studien Weise zu isolieren, Kryokonservierung und Kultur hAECs mit Tierproduktfreien Reagenzien gemäß den aktuellen guten Herstellungspraxis (cGMP) Leitlinien . Wir basieren diesem Protokoll eine zuvor veröffentlichte Protokoll, das wir erfolgreich verwendet haben, um hAECs Verwendung von Tieren stammenden Reagenzien 6 zu isolieren. Wir veränderten das ursprüngliche Protokoll an Tieren stammenden Produkte mit tierischen Erzeugnissen freien Reagenzien zu ersetzen, und die anschließende Optimierung durchgeführt, um die Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Reinheit zu optimieren. Unser Ziel war es, ein Protokoll, das mit regulatorischen Standards für Zellfertigung für den menschlichen klinischen Studien erfüllen zu entwickeln.

<table><tbody><tr><td>Collection Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stripping tray</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-361B</td><td></td></tr><tr><td>Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17329&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Scissors - Sharp/Blunt Straight</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0562592&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile latex gloves&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Protective Apparel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protective Apparel (Gown)</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Isolation gowns</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Sterile latex gloves&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>General purpose face mask</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7511</td><td></td></tr><tr><td>Bonnets</td><td>Medline</td><td>CRI1001</td><td></td></tr><tr><td>Shoe covers</td><td>U-line</td><td>S-7873W</td><td></td></tr><tr><td>Media and Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td>without calcium or magnesium</td></tr><tr><td>TrypZean (animal product&amp;ndash;free recombinant trypsin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3449</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor&amp;nbsp; 1g/50mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS5</td><td>BioLife Solutions</td><td>205102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EpCam-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130 - 091-253</td><td></td></tr><tr><td>PE-isotype control</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-845</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-PeCy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>555597</td><td></td></tr><tr><td>PeCy5-isotype control</td><td>BD Pharmingen</td><td>557224</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD105-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>APC-isotype control</td><td>BD Pharmingen</td><td>340754</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type VI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml graduated pipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356550</td><td></td></tr><tr><td>10 ml graduated pipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml graduated pipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>50 ml falcon tubes</td><td>BD/Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml falcon tubes</td><td>BD/Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Petri dishes</td><td>Corning</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m filters</td><td>BD/Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m filters</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Pipette tips</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-401</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l Pipette tips</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-409</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Syringe</td><td>BD/Medical</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>Plastic spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-245-97&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Plastic weighing boat</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-102&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cryo vials</td><td>Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr Frosty</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biohazard Cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, cryopreservation and culture of human amnion epithelial cells for clinical applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

Wenn dieses Verfahren korrekt befolgt, sollte ein Durchschnittsertrag von 120 Millionen hAECs rechnen, wobei ein typischer Bereich von 80-160 Millionen Zellen. Aus diesen Erträgen kann eine durchschnittliche Überlebensfähigkeit von 83 ± 4% zu erwarten. Der erhöhte mittlere Ausbeute und einer etwas niedrigeren Lebensfähigkeit im klinischen Verfahren kann aufgrund der höheren Trypsin-Aktivität als die von Tieren stammenden Produkt aufgrund des Fehlens von Serumproteinen ist, und vielleicht auch. Isolierte hAECs ei...

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Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolation, Kryokonservierung und Kultur der Menschen Amnion Epithelzellen für Klinische Anwendungen

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

isolation-cryopreservation-culture-human-amnion-epithelial-cells-for

Research

JoVE Journal

Medicine

13.8K Aufrufe.  Wake Forest University Health Sciences. We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines. 

Serie: Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

Isolierung von humanen mesenchymalen Stammzellen und deren Anbau an der porösen Knochenmatrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

A Novel Kultur Modell für menschliche pluripotente Stammzelle Propagation auf Gelatine in Placenta Anlage Medien

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

Reprogrammierung primäre Fruchtwasser und Membrane Zellen zur Pluripotenz in Xeno-freien Bedingungen

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

Isolation von menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen für In-vitro- Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Einfrieren und Auftauen humanen embryonalen Stammzellen

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Biologie

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that the amniotic epithelium is a homogeneous layer. The human amnion can be divided into three anatomical regions: reflected, placental, and umbilical. Each region has different physiological roles, such as in pathological conditions. Here, we describe a protocol to dissect human amnion tissue in three sections and maintain it in vitro. In culture, cells derived from the reflected amnion displayed a cuboidal morphology, while cells from both placental and umbilical regions were squamous. Nonetheless, all the cells obtained have an epithelial phenotype, demonstrated by the immunodetection of E-cadherin. Thus, because the placental and reflected regions in situ differ in cellular components and molecular functions, it may be necessary for in vitro studies to consider these differences, because they could have physiological implications for the use of HAEC in biomedical research and the promising application of these cells in regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane to determine their heterogeneity and functional properties for possible application in clinical and physiopathological models.

In Vitro Kultur von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Amnionmembran

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

Menschlichen pluripotenten Stammzelle-Kultur auf Polyvinyl Alkohol-Co-Itaconic Säure Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit Xeno-freien Bedingungen

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Biotechnik

Weiterentwicklung der Kryolagerung von aus menschlichen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigment-Epithelzellen

Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in individuals with retinal degenerative diseases; however, studies on the stable and secure banking of these therapeutic cells are scarce. Highly variable cell viability and functional recovery of&#160;RPE cells after cryopreservation are the most commonly encountered issues. In the present protocol, we aimed to achieve the best cell recovery rate after thawing by selecting the optimal cell phase for freezing based on the original experimental conditions. Cells were frozen in the exponential phase determined by using the 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine labeling assay, which improved cell viability and recovery rate after thawing. Stable and functional cells were obtained shortly after thawing, independent of a long differentiation process. The methods described here allow the simple, efficient, and inexpensive preservation and thawing of hESC-derived RPE cells. Although this protocol focuses on RPE cells, this freezing strategy may be applied to many other types of differentiated cells.

Autoren-Spotlight: Entwicklung einer effizienten und praktikablen Methode zum Einfrieren von retinalen Pigment-Epithelzellen

This study provides a detailed protocol for the efficient cryopreservation of human stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.

Kryokonservierung von aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigmentepithelzellen im optimalen Stadium

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in ...

Isolation, Kryokonservierung und Kultur der Menschen Amnion Epithelzellen für Klinische Anwendungen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Isolierung von humanen mesenchymalen Stammzellen und deren Anbau an der porösen Knochenmatrix

A Novel Kultur Modell für menschliche pluripotente Stammzelle Propagation auf Gelatine in Placenta Anlage Medien

Reprogrammierung primäre Fruchtwasser und Membrane Zellen zur Pluripotenz in Xeno-freien Bedingungen

Isolation von menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen für In-vitro- Decidualization

Einfrieren und Auftauen humanen embryonalen Stammzellen

In Vitro Kultur von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Amnionmembran

Menschlichen pluripotenten Stammzelle-Kultur auf Polyvinyl Alkohol-Co-Itaconic Säure Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit Xeno-freien Bedingungen

Kryokonservierung von aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigmentepithelzellen im optimalen Stadium

Kryokonservierung von aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigmentepithelzellen im optimalen Stadium

Kryokonservierung von aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigmentepithelzellen im optimalen Stadium