Die Charakterisierung der Genexpression auf transkriptomischer Ebene ist der Schlüssel zum Verständnis der Zellfunktion in Gesundheit und Krankheit. Unsere Methode konzentriert sich auf die Erfassung von Endothelzellen, der entscheidenden Schicht der Gefäßwand, aus den menestrigen Arterien menschlicher Spender für die transkriptomische Profilerstellung mit einer einzelligen und räumlichen Auflösung. Es gibt eine angereicherte Population von Endothelzellen aus einem Gefäß ohne Sortierschritt, was zu Zellverlust führen kann.
Darüber hinaus existieren andere Zelltypen, die die Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen im Gewebekontext ermöglichen. Wir haben diese Technik verwendet, um die arteriellen Veränderungen bei Diabetes und Fettleibigkeit zu untersuchen. Abhängig von der Verfügbarkeit des Gefäßes können diese Techniken auch umfunktioniert werden, um die Biologie in anderen Gefäßsystemen und anderen Krankheiten zu erforschen.
Wenn es das erste Mal ist, erfordern zwei wichtige Schritte die meiste Übung. Erstens, Kratzen, obwohl ausreichende Kraft ausgeübt werden sollte, um integrale Zellen zu entfernen, ohne tiefere Schichten abzulösen. Und zweitens, Kryostatenschnitt.
Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte kalt und flach sind und sich innerhalb der Grenzen der speziellen Folie befinden. Yingjun Luo und Xiaofang Tang, zwei Postdoktoranden aus meinem Labor, werden das Verfahren demonstrieren. Um mit dem Waschen des Gewebes mit DPBS zu beginnen.
Entfernen Sie mit steriler Pinzette und Dissektionsschere das Fett und das äußere Bindegewebe, bis das Gefäß sauber ist. Messen Sie die Länge des Gefäßes mit einem Lineal, das außerhalb der Schale platziert ist, und machen Sie Fotoaufnahmen. Schneiden Sie die Arteria mesenterica der Länge nach mit einer Schere ab, um das Gefäßlumen vertikal zu öffnen.
Befestigen Sie das Gefäß mit Nadeln an allen vier Ecken auf schwarzem Wachs und legen Sie die Intima frei. Fügen Sie einen Milliliter vorgewärmten Verdauungspuffer zu Intima hinzu. Mit einem sterilen Skalpell das Lumen des Gefäßes zweimal vorsichtig abkratzen.
Den Verdauungspuffer in ein Röhrchen überführen. Fügen Sie einen Milliliter Verdauungspuffer in die Intima hinzu und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die verbleibenden Zellen zu sammeln und die Zellsuspension in einen Schlauch zu übertragen. Inkubieren Sie Zellen bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten in einem Inkubator oder auf einer Wippe.
Fügen Sie M199-Medium zur Zellsuspension hinzu, um die enzymatische Reaktion abzuschrecken und vorsichtig zu mischen. Zentrifen Sie die Suspension fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius und 600 Mal G.At Ende der Zentrifugation, entfernen und lagern Sie den Überstand separat als Kontrollkultur, um zu beobachten, ob alle Zellen im Pellet eingefangen sind. Dann suspendieren Sie das Zellpellet erneut in einem Milliliter M199-Medium.
Beurteilen Sie die Zelllebensfähigkeit, indem Sie 10 Mikroliter Trypanblau mit 10 Mikrolitern Zellmaterial mischen. Beobachten Sie die Zellmorphologie und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Beschichten Sie zwei Vertiefungen einer Platte mit sechs Vertiefungen, indem Sie 500 Mikroliter Befestigungsreagenz für 30 Minuten bei Raumtemperatur in die Vertiefungen pipettieren.
Nachdem Sie die Brunnen mit sterilem DPBS gewaschen haben, geben Sie den Vollzellenbestand in eine Vertiefung ab, und der Überstand wird als Kontrolle in der zweiten Vertiefung aufbewahrt. Zentrifugieren Sie zuvor vorbereiteten Zellbestand bei vier Grad Celsius und 600 mal G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit einer P-1000-Pipette in 0,04% BSA in DPBS.
Gut mischen, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten. Führen Sie die Lösung durch ein 40-Mikrometer-Sieb, um Zellablagerungen zu entfernen. Zentrifen Sie dann die Suspension und entfernen Sie den Überstand wie gezeigt.
Suspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern 0,04% BSA in DPBS mit einer P-1000-Pipette und mischen Sie gut, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten. Wie bereits gezeigt, beurteilen Sie die Zelllebensfähigkeit mit Trypanblau. Beobachten Sie mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler die Morphologie der Einzelzellsuspension, suchen Sie nach Geweberesten und berechnen Sie die Anzahl der lebenden und toten Zellen.
Nach Zugabe von Isopentan zu einem Metallkanister in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis abkühlen. Gießen Sie OCT-Compound in Vertiefungen von markierter Kunststoff-Kryoform, um die Bildung von Blasen zu verhindern. Lassen Sie Kryoschimmel auf Trockeneis zum Abkühlen.
Schneiden Sie mindestens zwei koronale Abschnitte von einem Zentimeter in die Länge des Gefäßes. Tauchen Sie das Gewebe mit einer 12-Zoll-Pinzette in Isopentan ein, bis es eingefroren ist. Tauchen Sie das Gewebe bei der Ausrichtung schnell in OCT ein, wobei das Lumen in der Mitte sichtbar ist.
Greifen und legen Sie die Kryoformen auf Trockeneis und beobachten Sie das Einfrieren. Das OCT wird in ein bis zwei Minuten schrittweise von außen weiß. Lagern Sie diese Abschnitte bis zu sechs Monate lang in einem gesicherten Behälter bei minus 80 Grad Celsius.
Stellen Sie die gewünschte Kryostatentemperatur für die Kammer und den Probenkopf ein. Gleichen Sie die in OCT eingebetteten Gefäßabschnitte, Messer, Bürsten und Dias im Kryostaten etwa 30 Minuten lang auf minus 20 Grad Celsius aus. Reinigen Sie während des Ausgleichs die Maschine und alle Geräte, die die Abschnitte berühren können, einschließlich der Klinge, mit 70% Ethanol, gefolgt von RNase-Dekontaminationslösung.
Befestigen Sie die Probe, indem Sie eine kleine Menge OCT auf den kreisförmigen Kryostatblock geben und die Probe darauf legen, bevor sie gefriert. Nachdem Sie den Block in die Mitte des Probenkopfes gelegt haben, schrauben Sie den Block mit dem hohen schwarzen Griff auf der linken Seite fest. Schneiden Sie alle überschüssigen OCT, die das Schiff umgeben, weg.
Stellen Sie die Schnittdicke auf 10 Mikrometer am Kryostaten ein, schneiden Sie etwa 60 Abschnitte und legen Sie sie in ein vorgekühltes 1,5-Milliliter-Röhrchen, das RNA-Extraktionsreagenz enthält. Vortex, bis die Abschnitte vollständig aufgelöst sind. Extrahieren Sie die RNA wie im Textmanuskript beschrieben und lösen Sie das gereinigte RNA-Pellet in fünf Mikrolitern RNase-freiem Wasser auf.
Schneiden Sie 10 Mikrometer dicke Abschnitte mit Anti-Roll-Platte an Ort und Stelle. Drehen und vorsichtig abflachen, indem Sie den Abschnitt vorsichtig durch das umgebende OCT berühren. Wischen Sie die Folie mit Ethanol ab und wärmen Sie die Rückseite des Aufnahmebereichs mit dem Finger vor.
Platzieren Sie den Gewebeabschnitt mit RNase-freien Kryostatbürsten oder direkt mit dem Objektträger innerhalb des Quadrats und verwenden Sie nur das umgebende OCT. Legen Sie sofort einen Finger auf die Rückseite des Aufnahmebereichs, um den Abschnitt mit dem Objektträger zu schmelzen. Sobald der Abschnitt haftet, legen Sie die Folie auf die Kryoleiste, damit der Abschnitt einfrieren kann.
Schneiden Sie 10 Mikrometer dicke Gewebeschnitte, wie zuvor gezeigt, auf Gewebeoptimierungs- oder Genexpressionsobjektträger. Übertragen Sie die Folie auf einen Slide-Mailer, der auf Trockeneis platziert ist. Die Abbildung zeigt isolierte ECs, die mit dem beschriebenen Protokoll kultiviert wurden und eine ausgeprägte kopfsteinpflasterartige Morphologie mit minimalen kontaminierenden Zellen aufweisen.
Die Expression von EC-Marker vaskulärem Endothel-Cadherin wurde durch Immunfluoreszenz bestätigt, die Zell-zu-Zell-Verbindungen sichtbar macht. Etwa 80% der Zellen waren CD31-positiv, was darauf hindeutet, dass humane mesenteriale arterielle ECs den größten Teil der frisch isolierten Zellpopulation ausmachten. Erfolglose Isolierungen führen zu Zellen mit gestörter Morphologie, die möglicherweise mesenchymale Marker exprimieren oder sich verlängern, die einem fibroblastischen Zustand ähneln.
Die Abbildung zeigt eine repräsentative einheitliche mannigfaltige Approximation und Projektion, die für die Arteria mesenterica isoliert wurde, wobei das vorliegende Protokoll für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung auf isoliertem humanem mesenterialem arteriellem ECS verwendet wurde, wobei 34%-Zellen als ECs mit PECAM1 und VWF als Marker gruppiert sind. RNA von hoher Qualität sollte eine RNA-Integritätszahl von nicht weniger als sechs aufweisen, und das Verhältnis von 28S zu 18S ribosomalen RNA-Banden liegt so nahe wie möglich an zwei. Eine Schwäche oder Abwesenheit dieser ribosomalen RNA-Signale kann beobachtet werden, wenn RNAs abgebaut werden.
Die Hämatoxylin- und Eosinfärbung visualisierte die Morphologie des Gefäßes, so dass interessante Regionen identifiziert werden konnten. Die Genexpression wurde mit räumlicher Verankerung auf dem hämatoxylin- und eosingefärbten Gefäß visualisiert. Behandeln Sie Gewebe und Zellmaterial sorgfältig, um die RNA-Qualität aufrechtzuerhalten, insbesondere für die räumliche Transkriptom-Profilerstellung.
Stellen Sie sicher, dass das Gewebe auf Trockeneis gelegt wird, um den RNA-Abbau zu reduzieren. Behandeln Sie die Abschnitte und das Gewebe auch mit vorgekühlten Instrumenten. Wir konnten EC-Genexpressionsänderungen, einschließlich LncRNAs, im Zusammenhang mit Diabetes und ihrer Interaktion mit anderen Zelltypen untersuchen.
Wir können den Ort dieser transkriptomischen Veränderungen mithilfe von räumlichen Transkriptom-Profiling-Techniken ableiten.
