Diese Arbeit wurde von der Bill and Melinda Gates Foundation (Grand Challenge Exploration Auszeichnung SBG), die National Institutes for Health Research (NIHR), Biomedical Research Centre in Microbial Diseases, und der NIHR Umfassende Local Research Network finanziert. Wir erkennen die NWDA für infrastrukturelle Unterstützung. Wir danken Prof. J. N Weiser, University of Pennsylvania und Prof. P Hermans, University of Nijmegen für die Pneumokokken-Isolate. Dank der EHPC Safety Committee für ihre Unterstützung und Beratung, um alle unsere Freiwilligen für ihre Teilnahme und Mathieu Bangert für die Fotos.

Ein. Ehrenamtliche Auswahl und Screening <ol><li> Gesunde Probanden durch Plakatwerbung und auf der Website der Universität nach dem NHS Forschung und Ethik Ausschuss Führung rekrutiert. </li><li> Die Einschlusskriterien für die Teilnahme sind: <ol><li> Erwachsene im Alter von 18-60 Jahren. </li><li> Spricht fließend Englisch und ist in der Lage, einfach zu kommunizieren sowohl Mobiltelefon und SMS. </li></ol></li><li> Die Ausschlusskriterien für die Teilnahme sind: <ol><li> Enger Kontakt mit gefährdeten Personen (Kinder, immunsupprimierten Erwachsenen, älteren, chronisch krank). </li><li> Aktuelle Raucher oder bedeutende Geschichte das Rauchen (&gt; 10 pack Jahre). </li><li> Asthma oder anderen Atemwegserkrankungen. </li><li> Schwangerschaft. </li><li> Allergie gegen Penicillin oder Amoxicillin. </li><li> Aktuelle Beteiligung an einer anderen klinischen Studie sei denn, Beobachtung oder in nicht-interventionellen Phase. </li><li> Nicht vollständig informierte Einwilligung zu geben. </li></ol></li><li>Eine erste Screening-Visite, etwa eine Woche vor der Impfung, eine fokussierte Anamnese und gezielte klinische Untersuchung. </li><li> Wenn eine zuvor unerkannte Störung gefunden wird, wird der Freiwillige aus der Studie ausgeschlossen und entsprechende Untersuchung wird durch die Grundversorgung organisiert werden. </li><li> Während des anfänglichen Screening über eine Blutbild erhalten wird, um sicherzustellen, dass die Anzahl der Leukozyten im Normalbereich ist vor der Inokulation Besuch. Eine Nasenspülung wird durchgeführt, um natürliche Pneumokokken Träger auszuschließen (vgl. 6,1). </li><li> Vor der Inokulation werden Freiwillige auf den Risiken, die mit der Teilnahme an der Studie beteiligten erzogen und sind mit einem Notfall Packungsbeilage, digitale Thermometer, Notrufnummern und 3-Tages-Kurs von Amoxicillin vorgesehen. </li></ol> 2. Vorbereitung der Impfung Stocks <ol><li> Vorbereitung der Impfung Bestände müssen in einer sauberen Umgebung durchgeführt werden. Die Pipetten verwendet werden, sollten nur verwendet werdend für Inokulumzubereitung. Alle Glas-und Kunststoff-ware sollten steril sein. Wir empfehlen, dass Impfen Aktien in einem eigenen Raum vorbereitet werden, mit einem dedizierten fumehood und Inkubator. </li><li> Pneumokokken-Stämme werden auf einer Agarplatte beimpft. Die Platten werden bei 37 ° C in 5% CO 2 über Nacht inkubiert. Die folgenden Tage alle Bakterien aus dem Blut-Agar-Platte abgeschabt und geimpft zu einem Wulst Bestandserhaltung System. Diese Raupe Aktien werden für die Impfung Stoffaufbereitung. Testen Sie die Perlen Aktien für Verschmutzung und Kolonie Einheitlichkeit vor der Zubereitung eine Impfung Lager. </li><li> Um die Inokulation Lager herzustellen, anzuimpfen eine Agarplatte mit zwei Wülsten von der gewünschten Pneumokokken Serotyp Wulst Lager, Ausstreichen, um die gesamte Platte abzudecken. Inkubieren Platten bei 37 ° C in 5% CO 2 über Nacht. Alle weiteren Inkubationen verwenden diese gleichen Bedingungen. Auch bebrüten die Vegitone media Nacht, um die Sterilität zu gewährleisten. </li><li> Am nächsten Morgen TupferHälfte der Platte, dabei nicht zu entfernen Blutagar, und fügen Sie 12 ml vorgewärmtes Vegitone Brühe. Wiederholen Sie mit der anderen Hälfte der Platte. Lassen Sie die zwei 12 ml-Fläschchen bei 37 ° C für 2 Stunden oder bis eine Veränderung der Trübung wird deutlich, was zuerst eintritt. </li><li> Fügen Sie die 12 ml bis 40 ml vorgewärmtes Vegitone Brühe und mischen. Wiederholen Sie dies für die anderen 12 ml Fläschchen. Dies ist Zeitpunkt = 0 ist. 100 ul zu entfernen, um die optische Dichte (OD) bei 600 nm abgelesen. Entfernen 20 ul zur Quantifizierung der Bakterien durch koloniebildende Einheit (CFU) Zählung unter Verwendung einer Variation des Verfahrens von Miles und Misra (M &amp; M) 7. Inkubieren beide Fläschchen. <ol><li> Für die M &amp; M, teilen eine Agarplatte in sechs Abschnitte. Fügen Sie 180 ul sterilem PBS zu sechs Vertiefungen einer 96-Well-Platte (U-Boden). Fügen Sie 20 ul der Brühe nach oben gut und mischen. Serienmäßig wird die Probe 1.10 sechsmal und entsorgen 20 ul aus dem sechsten gut. Platz drei 10 ul Tropfen von oben auch in den ersten Abschnitt desBlutagarplatte. Wiederholen Sie dies für die fünf anderen Brunnen. Sicherstellen, dass die Platte trocken ist, bevor es invertiert und inkubiert. </li><li> Am nächsten Tag die Anzahl der sichtbaren Kolonien in jeder Verdünnung Abschnitt und aufzeichnen. Verwendung der Verdünnung Abschnitt mit einer Anzahl zwischen 30 und 300, unterteilen die Anzahl der sichtbaren Kolonien durch drei um einen Durchschnittswert zu bekommen. </li><li> Multiplizieren Sie die durchschnittliche Anzahl der Kolonien mit dem Verdünnungsfaktor und dann geteilt durch 10 (die Menge der 10 ul drop). Dies gibt CFU / ul. </li><li> Multiplizieren Sie diese Zahl um 1.000 auf CFU / ml erhalten. </li></ol></li><li> Führen OD 600 Lesungen und Quantifizierung der Bakterien durch M &amp; M Verfahren stündlich bis frühen mittleren log-Phase erreicht wird, einen Außendurchmesser von 0,25. </li><li> Sobald dies OD erreicht, so ist sterilisiert 10% Glycerin zu einem Fläschchen und Herstellung von 1 ml Aliquots. Shop Aliquots bei -80 ° C. </li><li> Für eine konzentrierte Lager, zentrifugieren Sie das andere Gefäß bei 3.345 xg für 15 min und entfernen Sie den Überstand. Das Pellet in 22,5 ml Vegitone mittleren und 10% Glycerin. Bereiten Sie 1 ml und bei -80 ° C. </li><li> Lassen Aktien bei -80 ° C für mindestens 48 Stunden vor dem Auftauen und Quantifizierung. </li><li> Quantifizierung des gefrorenen Bakterien Aktie durch den M &amp; M-Methode. Testen Sie drei Lager Röhren einzeln um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Verwenden Sie den Wert erhalten, den Bestand an die gewünschte Inokulumkonzentration in Kochsalzlösung verdünnen, wie unten beschrieben. </li><li> Für eine Inokulation wird die Menge von Pneumokokken in dem Inokulum vor und nach der Inokulation berechnet. Diese Quantifizierung der Bakterien durch die M &amp; M Verfahren wird verwendet, um die durchschnittliche Anzahl von Pneumokokken in dem Inokulum, das für die Zeit, die es braucht, um die gesamte Verfahren ausführen ausmacht bestimmen. <ol><li> Bereiten Sie ein Inokulum, Verdünnen auf die gewünschte Konzentration, und führen Sie die Quantifizierung durch die M &amp; M-Methode für die &quot;pre-Impfung&quot; zählen. </li><li> In unserem Clinical Research Facility dauert es dem Team 30 min, um die gesamte Impfung abzuschließen. Pneumococcal Suspensionen in Kochsalzlösung wird in der Regel zeigen eine verringerte Anzahl in diesem Intervall. Um dies zu berücksichtigen, lassen wir die verdünnte Inokulum sitzen bei Raumtemperatur für 30 min und dann eine &quot;post-Impfung&quot; Quantifizierung der Bakterien durch die M &amp; M-Methode. </li><li> Der Mittelwert der vor und nach den endgültigen inokuliert Konzentration zu bestimmen. Stellen Sie die &quot;sitzend&quot; Zeit nach Ihrer klinischen Protokoll, sondern halten das Intervall so kurz wie möglich. </li></ol></li><li> Alle neuen Aktien sollten an ein Referenzlabor zur Bestätigung auf Lager Reinheit und Identität gesendet werden. </li></ol> 3. Inokulumzubereitung <ol><li> Vorbereitung des Inokulums sollte 30 Minuten vor der geplanten freiwilligen Impfung Termin beginnen. </li><li> Nehmen Sie eine der bisherigen Lager Rohre aus dem -80 ° C Gefrierschrank, auftauen und drehen Sie das Rohr in der Mikrozentrifuge bei 17.000 xg für 3 min. </li><li> Warm Blutagarplatten in der 37 ° C-Inkubator. Vorbereiteneine 96-Well-Platte für die bakterielle Quantifizierung von M &amp; M Verfahren und bereiten Verdünnungsröhrchen entsprechend der gewünschten Dosis. </li><li> Entfernen der Brühe aus dem zentrifugierten Überstand Rohr und das Pellet in 1 ml Kochsalzlösung. Dieser Schritt entfernt die Brühe aus dem Inokulum. </li><li> Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt. </li><li> Entfernen Sie die Kochsalzlösung Überstand und das Pellet in 1 ml Kochsalzlösung. </li><li> Führen Verdünnung Satz für die gewünschte Inokulumkonzentration und Quantifizierung von M &amp; M-Methode. </li><li> Nehmen Sie das Inokulum der Freiwilligen Ernennung und nach Beimpfen die Freiwilligen, wiederholen Sie die Quantifizierung im Labor. Das Röhrchen mit dem Datum und Inokulum Dosis und bei -80 ° C. </li><li> Um die Konsistenz Inokulation bis Inokulation zu gewährleisten, ist es wichtig, die gleichen Pipetten und engagierten Laborgeräte jedes Mal verwenden. </li></ol> 4. Impfung <ol><li> Freiwillige sollten bequem in einem halb liegende Position sitzen. </li><li&gt; Mit einem P200 Pipette und Sterilfilter Tipps auszuarbeiten 100 ul des Inokulums und die Spitze nur innerhalb der Nasenhöhle. </li><li> Langsam vertreiben das Inokulum auf die Nasenschleimhaut mit einer kreisförmigen Bewegung. </li><li> Entscheidend ist, dass die Pipettenspitze nicht in Kontakt mit der Nasenschleimhaut kommen als Störung der Integrität des Epithels könnte in den Bakterien in die Blutbahn führt. </li><li> Es ist auch wichtig, dass das Inokulum nicht zu weit nach hinten oder platziert wird es laufen in den Rachen, es sollte in der Nasenhöhle befinden. </li><li> Wiederholen Sie dies für die anderen Nasenloch. </li><li> Haben die Freiwilligen in der halb liegende Position bleiben für 10 min ohne Sniffing oder Schneuzen. Diese Zeit ist notwendig, um die Bakterien durch die Schleimhaut zu dispergieren. </li></ol> 5. Überwachung <ol><li> Volunteers werden täglich nach der Impfung überwacht. Dies beinhaltet eine tägliche SMS von den Freiwilligen die Ermittler vor 02.00 Uhr gesendet. </li><li> Wenn der Text is nicht empfangen um 2 Uhr die Freiwillige kontaktiert wird sein / ihr Wohlbefinden zu gewährleisten. Wenn er / sie nicht reagiert, wird die zugeordnete nächsten Angehörigen kontaktiert, um der Freiwilligen Wohlbefinden zu gewährleisten. </li><li> Freiwillige werden gebeten, auf allen oberen Atemwege Symptome bei jedem Termin berichten. Klinikpersonal fragt die Freiwillige seine / ihre Symptome zu beschreiben und Follow-up keine Beschwerden. </li><li> Die Antibiotika gegeben, um den Freiwilligen sind nur unter drei Umstände berücksichtigt werden, in dem Fall, dass sie krank sind und werden angewiesen, die ihnen von dem Forschungsteam zu nehmen, wenn sie die Durchführung Pneumokokken sind am Ende der Studie, oder wenn sie sich unwohl und unfähig, die Forschungs-Team zu kontaktieren. Der Freiwillige wird ermutigt, diese Notlicht mit ihnen halten zu allen Zeiten während der Studie und wird gebeten, das Forschungsteam auf einer täglichen Basis für die nächsten 7 Tagen kontaktieren. </li><li> Unser Team ist 24/7 erreichbar mit Krankenschwester Kontakt während der Arbeitszeit und zwei Ärzte zur Verfügung von hours. Alle Anfragen werden mit per Telefonanruf und / oder sofortige Überprüfung behandelt. Rückstellungen für unmittelbare, direkte Zulassung zu einer Infectious Disease Abteilung zur Verfügung, wenn nötig. </li></ol> 6. Nasal Wash (NW) Procedure <ol><li> Nasal Waschen (NW) in einem ersten Screening-Visite, sowie 48 Stunden, 7 und 14 Tage nach der Inokulation durchgeführt. Die NW-Methode verwendet wird, aus Naclerio et al. 8 Freiwillige natürlich kolonisiert durch S. pneumoniae sind Inokulation ausgeschlossen und Follow-up. </li><li> Der Freiwillige ist komfortabel und sitzt der Kopf wird wieder 30 ° aus der Senkrechten geneigt. </li><li> Bitten Sie die Freiwilligen einen tiefen Atemzug zu nehmen und halten den Atem an, während schob ihre Zunge nach oben und hinten gegen das Dach des Mundes. Während in dieser Stellung wird der Proband gebeten zu signalisieren, dass sie bereit sind. </li><li> Eine Spritze mit 20 ml Kochsalzlösung gefüllt ist in die vordere Nase Raum eingeführt und 5 ml Kochsalzlösung ausgestoßen wird. Die volunteer dann nach vorne beugt sofort und vertreibt die Flüssigkeit durch Ausatmen schnell durch die Nase in eine Folie Schüssel. </li><li> Diesen Vorgang 3 mal so daß jedes Nasenloch wurde zweimal gewaschen und die vollen 20 ml verwendet wurde. </li><li> Pool alle Proben zusammen in einem Zentrifugenröhrchen und senden an das Labor bei Raumtemperatur für die Verarbeitung. </li></ol> 7. Nasal Wash Verarbeitung <ol><li> Zentrifugation der Proben für 10 min bei 3345 x g. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Speicher als 1 ml Aliquots in beschrifteten Eppendorf-Röhrchen bei -80 ° C. </li><li> Fügen Sie 100 ul StGG Medium 9 zu dem Pellet und gründlich mischen. Sicherstellen, dass das Gesamtvolumen im Rohr an dieser Stelle bestimmt wird. Diese Verdünnung wird bei der Berechnung der CFU eines Wagens positive NW verwendet werden. </li><li> Platte eine 20 ul Tropfen des StGG mit dem resuspendierten Pellets auf einer Agarplatte mit Gentamicin und streifenfrei die gesamte Platte. <ol><li> Wenn die NW ist nach der ImpfungEntfernen Sie 10 ul aus dem StGG mit dem resuspendierten Pellets und Einsatz für bakterielle Quantifizierung durch M &amp; M-Methode. </li></ol></li><li> Hinzufügen 800 ul StGG der NW Rohr und gründlich mischen. </li><li> Platte 25 ul auf eine Agarplatte und 25 ul auf eine Schokolade Agarplatte, Schlieren die gesamte Platte. </li><li> Teilen Sie die verbleibenden Bakterien in StGG Medium in 2 Kryoröhrchen und bei -80 ° C suspendiert </li><li> Die Inkubation bei 37 ° C über Nacht in 5% CO 2. </li><li> Die Platten am nächsten Tag für Pneumokokken und andere potenzielle Atemwegspathogene. </li><li> Pneumokokken sind auf Platten durch Kolonie Morphologie identifiziert. Alpha hämolytische Kolonien mit Zeichner Morphologie subkultiviert auf Blut-Agar mit einem Optochin Disc und über Nacht inkubiert. </li><li> Mutmaßlich Pneumokokken Kolonien, Optochin sensitive sind, Gram gefärbt, um Gram positive Diplokokken bestätigen und serotypisiert mit dem Statens Serum Institut Pneumotest-Latex-Kit. </li></ol>

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	<li>Ferreira, D. M., Jambo, K. C., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+human+pneumococcal+carriage+models+for+vaccine+research.">Experimental human pneumococcal carriage models for vaccine research.</a> Trends in Microbiology. 19, 464-470 (2011).</li><li>Mera, R., Miller, L. A., Fritsche, T. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+and+multiple+resistance+in+Streptococcus+pneumoniae+after+the+introduction+of+the+conjugate+pneumococcal+vaccine.">Serotype replacement and multiple resistance in Streptococcus pneumoniae after the introduction of the conjugate pneumococcal vaccine.</a> Microbial Drug Resistance. 14, 101-107 (2008).</li><li>Tocheva, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Declining+serotype+coverage+of+new+pneumococcal+conjugate+vaccines+relating+to+the+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+in+young+children.">Declining serotype coverage of new pneumococcal conjugate vaccines relating to the carriage of Streptococcus pneumoniae in young children.</a> Vaccine. 29, 4400-4404 (2011).</li><li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).</li><li>Wu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+Streptococcus+pneumoniae+nasopharyngeal+colonization+model+in+adult+mice.">Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice.</a> Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).</li><li>Wright, A. K. A., Ferreira, D. M., Gritzfeld, J. F., Wright, A. D., Armitage, K., Jambo, K. C., Bate, E., Batrawy, S. E. l., Collins, A., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Nasal+Challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+is+Immunising+in+the+Absence+of+Carriage.">Human Nasal Challenge with Streptococcus pneumoniae is Immunising in the Absence of Carriage.</a> PloS Pathogens. 8 (4), e1002622 (2012).</li><li>Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+the+bactericidal+power+of+the+blood.">The estimation of the bactericidal power of the blood.</a> The Journal of Hygiene. 38, 732-749 (1938).</li><li>Naclerio, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediator+release+after+nasal+airway+challenge+with+allergen.">Mediator release after nasal airway challenge with allergen.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, 597-602 (1983).</li><li>O'Brien, K. L., Nohynek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+from+a+WHO+working+group:+standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae.">Report from a WHO working group: standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae.</a> Pediatr. Infect. Dis J. 22, 133-140 (2003).</li><li>Gritzfeld, J. F., Roberts, P., Roche, L., Batrawy, S. E. l., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+nasopharyngeal+swab+and+nasal+wash,+using+culture+and+PCR,+in+the+detection+of+potential+respiratory+pathogens.">Comparison between nasopharyngeal swab and nasal wash, using culture and PCR, in the detection of potential respiratory pathogens.</a> BMC Research Notes. 4, 122 (2011).</li><li>McCool, T. L., Cate, T. R., Moy, G., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+to+pneumococcal+proteins+during+experimental+human+carriage.">The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage.</a> J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die EHPC Plattform hat eine Reihe von Verwendungsmöglichkeiten einschließlich der Verwendung als Schleimhaut-Impfstoff-Modell und als Surrogat des Schutzes zum Testen neuer Protein Impfstoffen. Die Methode ist abhängig von einer konsequenten Impfung Technik und hoher Qualität NW. Reproduzierbarkeit kann ein Problem mit dem Inokulum sein. Durch die variable Natur der gefrorenen Aliquots bakteriellen, kann es schwierig sein, die gewünschte Dosis zu replizieren. Eine Halbierung oder Verdoppelung der gewünschte Dosis wird in Reichweite betrachtet. Es ist entscheidend, dass der bakterielle Quantifizierung erfolgt unmittelbar vor-und nach der Inokulation werden, um genau zu bestimmen Quantifizierung der Bakterien durch CFU Zählung. Aus diesem Grund kann es hilfreich sein, wenn freiwillige Termine gleichzeitig auftreten, so dass nur ein Inokulum vorbereitet zu werden brauchen und die Quantifizierung plating getan vor und nach der Impfung geschieht nicht mehr als 30 min auseinander. Die NW Methode erfordert die Kooperationration der Freiwilligen und würde nicht eine ideale Methode bei Kindern. Wenn die Ausbeute beträgt weniger als 5 ml, kann das Verfahren wiederholt, wobei bis zu einem zusätzlichen 20 ml enthält. Prothesenträger können reduzieren die NW Ausbeute. Wenn die Freiwillige hat eine blockierte / verstopfte Nase und die Salzlösung wird knapp vorne nach dem Einsetzen, blasen die Nase, die Spritze ein wenig weiter zurück, und neigen Sie den Kopf nach hinten mehr, wenn nötig. Die NW ist eine Technik, die besser mit der Praxis kommt. Einige Volumen wird in der Regel verloren, so ist das Ziel für eine Rückkehr von mindestens 10 ml werden. Wenn die Freiwillige kann Kochsalzlösung während der NW schmecken dann wird die Verbindung zwischen dem hinteren Nasopharynx und Oropharynx wurde nicht ausreichend von den ehrenamtlichen Zunge geschlossen. Wenn die Freiwillige schluckt die meisten der Saline, erklären den Vorgang erneut, betont das Schieben der Zunge gegen den Gaumen. Dann wiederholen Sie den Vorgang, um die Lautstärke zu erhöhen zurückgegeben. Wenn die NW enthält eine substantial Menge Schleim, ist es am besten, um es vor der Zentrifugation zu entfernen. Vortex die Probe, um alles, was an den Schleim gebunden werden könnten und dann zu entfernen, wie viel von den großen Stücken wie möglich beim Entfernen so wenig wie möglich Kochsalzlösung lockern. Eine vorherige EHPC Studie in den USA wurde sicher und abgeschlossen hatten keine unerwünschten Ereignisse 11. Um die Fortsetzung Sicherheit des EHPC Plattform zu gewährleisten, haben wir eine Notfall-Protokoll, das rund 24 Stunden Zugriff auf das Research-Team der Basis eingestellt ist. Volunteers sind Ansprechpartner zur Verfügung, so dass sie dem Forschungsteam Zugang 24 Stunden am Tag. Jede medizinische Versorgung benötigt wird in der Royal Liverpool University Hospital zur Verfügung gestellt. Als weitere Maßnahme zum Schutz erhält ein Sicherheits-Komitee, bestehend aus Klinikern und Wissenschaftlern von außerhalb der Arbeitsgruppe eine wöchentliche Sicherheitsbericht. Der Bericht enthält die bakteriellen Dosis jeder Freiwillige erhielten und ob irgendwelche Symptome oder Krankheit gemeldet wurden. Dieser Bericht ermöglicht die Sicherheit von the Studie extern ohne Voreingenommenheit kritisiert werden. Der Sicherheitsausschuss sind auch 24 Stunden am Tag in dem unwahrscheinlichen Fall eines Notfalls.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Cat # </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Fischer </td><td> G/0650/08 </td></tr><tr><td> 0,9% Natriumchlorid </td><td> B. Braun </td><td> 3627667 </td></tr><tr><td> Magermilchpulver </td><td> Fluka </td><td> 70166 </td></tr><tr><td> Trypton-Soja-Brühe </td><td> Becton Dickinson </td><td> 211768 </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> BDH </td><td> 284504S </td></tr><tr><td> Columbia-Agar mit chocolated Pferdeblut </td><td> Oxoid </td><td> PB0124 </td></tr><tr><td> Pneumotest-Latex-Kit </td><td> Statens Serum Institut </td><td> 51823 </td></tr></tbody></table>

experimental human pneumococcal carriage

Experimentelle menschlichen Pneumokokken Schlitten (EHPC) ist wissenschaftlich wichtig, weil nasopharyngealen Streptococcus pneumoniae ist sowohl die wichtigste Quelle der Übertragung und die Voraussetzung der invasiven Erkrankungen. Ein Modell des Wagens ermöglicht die genaue Bestimmung der immunologischen Korrelate des Schutzes, die Immunisierung Wirkung des Wagens und die Wirkung der Host Druck auf die Erreger im Nasen-Rachen-Nische. Weitere, Methoden der Schlittenerfassungselements nützlich in epidemiologischen Studien, einschließlich Impfstoff-Studien, verglichen werden können. Ziel Wir streben eine EHPC Plattform, die eine sichere und nützliche reproduzierbare Methode, die down-select Kandidat Roman Pneumokokken-Impfstoffe mit Prävention des Wagens könnte als Surrogat des Impfstoffs induzierte Immunität verwendet wird, zu entwickeln. Es wird zur Prüfung von Impfstoffkandidaten und Beschreibungen der Mechanismen EHPC und Impfstoff Schutz vor Carria arbeitenge 1. Aktuelle Konjugat-Impfstoffe gegen Pneumokokken Schutz von Kindern vor invasiven Erkrankungen, obwohl neue Impfstoffe werden dringend benötigt, da der aktuelle Impfstoff nicht verleihen, hat einen optimalen Schutz gegen nicht-bakteriämische Pneumonie und es hat Beweise vom Serotyp Austausch mit Nicht-Impfstoff-Serotypen 2-4. Verfahren Wir impfen mit S. pneumoniae suspendiert in 100 ul Kochsalzlösung. Sicherheit ist ein wichtiger Faktor bei der Entwicklung der EHPC Modell und wird durch intensive Freiwilligen Screening und Überwachung erreicht. Ein Sicherheits-Komitee, bestehend aus Klinikern und Wissenschaftlern, die unabhängig von der Studie sind bietet objektive Rückmeldung auf einer wöchentlichen Basis. Die bakterielle Inokulum ist standardisiert und erfordert, dass keine tierischen Produkte in Freiwilligen (Pflanzenöl-basierte Medien und Kochsalzlösung) sind geimpft. Die Dosen für die Besiedelung (10 4 -10 5) erforderlich sind viel niedriger than die in Tiermodellen (10 7) 5. Erfassen Pneumokokken Schlitten durch ein hohes Volumen (idealerweise&gt; 10 ml) ergänzt Nasenspülflüssigkeit relativ Schleim frei ist. Dieses Protokoll wird mit den wichtigsten Teilen der Protokoll nacheinander behandeln. Dies sind (a) Freiwillige Auswahl, (b) Pneumokokken Inokulumzubereitung, (c) Impfung, (d) Follow-up und (e) die Beförderung Erkennung. Ergebnisse Unsere aktuellen Protokoll wurde in über 100 Freiwilligen sicher in einem Bereich von Dosen mit zwei verschiedenen bakteriellen Serotypen 6. Eine Dosisfindungsstudie mit S. pneumoniae 6B und 23F wird derzeit durchgeführt, um die optimale Impfdosis für 50% Beförderung zu bestimmen. Ein vorhergesagter Satz von 50% des Wagens wird es der EHPC Modell hohe Empfindlichkeit für die Wirksamkeit des Impfstoffes mit kleinen Studie Zahlen haben.

Wir haben Erfahrung Impfen 159 Menschen, von denen 35 wurden Pneumokokken durchgeführt. Die niedrigste Dosis erreichten wir Wagen mit über Serotyp 6B war 11.100 CFU/100 ul pro Nasenloch, die höchste Dosis betrug 313.000 CFU/100 ul pro Nasenloch. Die niedrigste Dosis erreichten wir Wagen mit über Serotyp 23F war 9.000 CFU/100 ul pro Nasenloch, die höchste Dosis betrug 84.500 CFU/100 ul pro Nasenloch. Unsere Methode der Beförderung Assessment ist eine Nasenspülung gewählt, weil eine aktuelle Studie 10 zeigten, dass 91% der Freiwilligen Nasenspülung sich als komfortabler als Nasen-Rachen-Abstrich, der Nasenspülung war auch eher Krankheitserreger mit mikrobiologischen Kultur erkennen. Mikrobiellen Flora auf Blutagar Platten mit NW beimpft erholt variabel sein kann und schwer zu lesen. Gentamicin ist auf der ersten Blutagarplatte verwendet, um für Pneumokokken ausgewählt. Die Schokoladen-Agar Platte und die zweite Blutagarplatte werden verwendet, um andere mögliche respiratorischen Weg detektierenOgens, die helfen oder behindern Pneumokokken Kolonisierung kann. Ein Beispiel für eine Agarplatte mit NW beimpft, die leicht zu lesen ist, ist in Abbildung 1a gezeigt; eine schwierige Platte mit zahlreichen Arten der Flora ist in Abbildung 1b gezeigt. Bei jeder Bestellung Freiwilligen wurden gebeten, alle oberen Atemwege Symptome zu beschreiben, falls vorhanden, und Vergleiche zwischen den Trägern und nicht-Träger wurden markiert. Von den 145 Menschen vor kurzem mit Pneumokokken geimpft, beschwerte 28 von Symptomen (Tabelle 1). Acht von ihnen waren Träger, 20 waren es nicht. Die häufigsten Symptome waren unspezifisch nasale Symptome (Tabelle 1). Von den Fällen, in denen systemischen Symptomen wie Fieber und / oder Unwohlsein gemeldet wurden, zeigte keine der durchgeführten Untersuchungen Beweise für Pneumokokken-Erkrankungen und Symptome waren konsistent mit gleichzeitiger Virusinfektion außer in einem Fall einer Mandelentzündung. Zwei Pneumokokken positive Freiwilligen wurden mit Antibiotika behandelt. Einer beklagte Halsschmerzen und Ohrenschmerzen und nach einem Treffen mit dem Studium Arzt, wurde geraten, Antibiotika als Vorsichtsmaßnahme. Die anderen Freiwilligen wurde klinisch mit Mandelentzündung diagnostiziert. Alle Freiwilligen hatten rasche Rückbildung der Symptome. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50115/50115fig1.jpg" /> Abbildung 1. Blutagarplatte mit NW inokuliert. Blut-Agarplatten mit NW inokuliert können schwierig zu lesen. 1a ist ein Beispiel einer Platte, die leicht mit Pneumokokken deutlich sichtbar zu lesen. 1b ist eine Platte mit vielen Co-besiedelnder Pflanzen so dass es schwer zu erkennen, wenn Pneumokokken vorliegt. <table border="1"><tbody><tr><td> Symptome </td><td></td><td> Carriage (n = 32) </td><td> Kein Carriage (n = 112) </td></tr><tr><td> AlleSymptome </td><td></td><td> 24% </td><td> 18% </td></tr><tr><td> Systemisch </td><td> Fieber </td><td> 3% </td><td> 4% </td></tr><tr><td></td><td> Malaise * </td><td> 9% </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Lokal </td><td> Ears </td><td> 9% </td><td> 3% </td></tr><tr><td></td><td> Nase </td><td> 0 </td><td> 10% </td></tr><tr><td></td><td> Kehle </td><td> 12% </td><td> 3% </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Charakterisierung von Freiwilligen berichteten Symptome nach S. pneumoniae 6B Impfung. Alle Beschwerden wurden von der externen Sicherheits-Ausschuss überprüft und nach der vollständigen Untersuchungen wurden keine Symptome Pneumokokken-Erkrankungen zugeschrieben. Die häufigsten Symptome waren Halsschmerzen, verstopfte Nase und Grippe-ähnliche Erkrankung.

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Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimentelle menschlichen Pneumokokken Wagen bietet ein natürliches Vorbild des Wagens und ein mögliches Modell für den Einsatz in der Entwicklung von Impfstoffen. Diese Technik ist wertvoll und doch komplex und beinhaltet klinisches Risiko durch die Einführung eines Erregers in einem Menschen. Wir haben ein detailliertes Protokoll entwickelt.

Experimentelle Menschliche Pneumokokken Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

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15.4K Aufrufe.  Liverpool School of Tropical Medicine. Experimentelle menschlichen Pneumokokken Wagen bietet ein natürliches Vorbild des Wagens und ein mögliches Modell für den Einsatz in der Entwicklung von Impfstoffen. Diese Technik ist wertvoll und doch komplex und beinhaltet klinisches Risiko durch die Einführung eines Erregers in einem Menschen. Wir haben ein detailliertes Protokoll entwickelt.

Serie: Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Experimentelle Metastase Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Forschung

Medizin

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Experimentelle Erzeugung von Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) von menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

Stem Cell Transplantation in einem In-vitro- Simulierte Ischämie / Reperfusion-Modell

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Isolierung und funktionelle Charakterisierung der Menschen ventrikuläre Kardiomyozyten von Fresh Chirurgische Proben

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

Verfahren für Menschen V. saphena<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Perfusion und Außen Verstärkung

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one step treatments for acute and chronic skin lesions. Moreover, the management of chronic but also acute wounds resulting from trauma, diabetes, infections and other causes, remains challenging. In this study we describe a new method to create autologous micro-grafts from cutaneous tissue of a single patient and their clinical application. Moreover, in vitro biological characterization of cutaneous tissue derived from skin, de-epidermized dermis (Ded) and dermis of multi-organ and/or multi-tissue donors was also performed. All tissues were disaggregated by this new protocol, allowing us to obtain viable micro-grafts. In particular, we reported that this innovative protocol is able to create bio-complexes composed by autologous micro-grafts and collagen sponges ready to be applied on skin lesions. The clinical application of autologous bio-complexes on a leg lesion was also reported, showing an improvement of both re-epitalization process and softness of the lesion. Additionally, our in vitro model showed that cell viability after mechanical disaggregation with this system is maintained over time for up to seven (7) days of culture. We also observed, by flow cytometry analysis, that the pool of cells obtained from disaggregation is composed of several cell types, including mesenchymal stem cells, that exert a key role in the processes of tissue regeneration and repair, for their high regenerative potential. Finally, we demonstrated in vitro that this procedure maintains the sterility of micro-grafts when cultured in Agar dishes. In summary, we conclude that this new regenerative approach can be a promising tool for clinicians to obtain in one step viable, sterile and ready to use micro-grafts that can be applied alone or in combination with most common biological scaffolds.

The protocol describes a new method to disaggregate human tissues and to create autologous micro-grafts that, combined with collagen sponges, give rise to human bio-complexes ready to use in the treatment of skin lesions. Further, this system preserves cell viability of micro-grafts at different times after mechanical disaggregation.

Gewebecharakterisierung nach einer neuen Disaggregation Methode für Haut Micro-Grafts-Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Dreidimensionale Alginat-Perle Kultur der Menschen Hypophysenadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Ultrasonography in Experimental Reproductive Investigations on Rats

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in reproductive medicine. In the past, the study of reproductive system development in rodents has been based on one-time histological examination of excised tissues. Recently, with the development of high-resolution transabdominal ultrasound, high-quality sonography can now be performed to evaluate the reproductive organs of rats, allowing a new method for studying the reproductive system. Images were obtained using a high-resolution ultrasonographic system. Gynecological ultrasonography was performed on 28 eight-week-old non-pregnant rats and 5 pregnant Sprague-Dawley rats. We describe how to recognize organs of the reproductive system and associated structures in typical views during different phases of the estrus cycle. Color flow Doppler was used to measure uterine artery blood flow and evaluate uterine blood flow pattern changes during different stages of pregnancy. We have demonstrated that ultrasound exploration is a useful method for evaluating changes in internal reproductive organs. Its use raises the possibility of conducting additional experiments, including medical or surgical procedures, and provides the ability to monitor sonographic changes to internal organs without sacrificing animals.

This manuscript describes the utility of ultrasound performed on female rats to design experimental models for reproductive and gynecological investigation. A step-by-step explanation of how to perform ultrasonographic evaluation is shown.

Sonographie in experimentellen reproduktiven Untersuchungen an Ratten

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

Erweiterte Bildgebung der Lunge Homing menschlichen Lymphozyten in einem experimentellen In Vivo Modell der allergische Entzündung basierend auf Licht-Blatt Mikroskopie