Die Autoren bedanken sich bei Laurence Cooper, Harjeet Singh und Lenka Hurton für ihre Arbeit danken bei der Erstellung der ersten K562 AAPC und mIL21 Fusionsvektoren. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde von der UT MD Anderson Physician Scientist Program, das St. Baldrick Stiftung und die Legends of Friendswood zur Verfügung gestellt.

1. Isolation von PBMCs aus Buffy Coat Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) werden durch Schwebedichte Zentrifugation auf Ficoll-Paque aus gesunden Spenders Buffy-Coat-Proben durch Leukapherese gewonnen wird. <ol><li> Die Ficoll-Paque Zentrifugation ist nach Hersteller-Protokoll mit geringfügigen Änderungen vorgenommen. </li><li> Add PBS zu einem normal-Spenderblut-Bank-Buffy-Coat auf ein Endvolumen von 140 mL (typische Buffy-Coat-Volumen ist 40-70 ml). </li><li> Schicht 35 ml Buffy-Coat-Probe auf 15 ml Ficoll-Paque (4 Röhren). </li><li> Zentrifugation bei 400g für 20 Minuten ohne Bremse. </li><li> Recover der PBMCs aus der Ficoll-Paque: Plasma-Schnittstelle, nicht verwerfen die roten Blutkörperchen an der Unterseite der Ficoll-Paque. </li><li> Wash PBMCs dreimal mit PBS, Zentrifugieren jedes Mal bei 400g für 10 Minuten. </li><li> PBMCs können direkt für die NK-Zell-Expansion in diesem Stadium oder NK-Zellen verwendet werden kann RosetteSep isoliert werden (Abschnitt 4) </li><li> Verbleibende PBMCs können in FBS eingefroren werden mit 10% DMSO in flüssigem Stickstoff. </li><li> Saugen Sie das Ficoll und sammelt die roten Blutkörperchen von Schritt 5 in zwei 50 ml Zentrifugenröhrchen, dreimal mit PBS (zu 50 ml Marke), absaugen jedes Mal der Überstand Skimming der Spitze des RBC-Schicht Granulozyten entfernen. </li><li> Die roten Blutkörperchen können sofort für RosetteSep  Reinigung von NK-Zellen (siehe Abschnitt 4) verwendet werden oder in gleicher Menge Alsever Lösung bei 4 ° C für eine spätere Verwendung (Die roten Blutkörperchen können gespeichert werden für maximal 4 Wochen). </li></ol> 2. NK-Zell-Expansion Die NK-Zell-Expansion eingeleitet mit PBMCs oder gereinigten NK-Zellen sein. Die Höhe der PBMCs für die Expansion verwendet bezogen auf die Menge der NK-Zellen am Ende einer dreiwöchigen Erweiterung gewünscht variiert werden kann, um repräsentative Ergebnisse für Details verweisen. (Siehe Hinweis 1) STIMULATION 1 Tag 0 <ol><li> Für jede 5x10 6 PBMCs erweitert werden, zählen und bestrahlen 10x10 6 K562 Cl9 mIL21 mit einem Gamma-Strahler bei 100 Gy. </li><li> Beitrag Bestrahlung, waschen Sie die Zellen mit PBS und Resuspendieren in NK-Zell-Expansion Medien (Nkem). </li><li> Seed 5x10 6 PBMCs mit 10x10 6 bestrahlt K562 Cl9 mIL21 (1:2 ratio) in 40 mL Nkem in einer T75 Flasche und legen Sie sie aufrecht in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> Tage 3 und 5 <ol start="4"><li> Recover Zellen durch Zentrifugation bei 400g für 5 min und ersetzen die Hälfte der Medien mit frischen Nkem (Zugabe von frischem IL2 für die gesamte Medien-Volumen) und die Kultur. </li></ol> STIMULATION 2 Tag 7 <ol><li> Zählt die Anzahl der Zellen in Kultur am Ende einer Woche. </li><li> Beiseite 5x10 5 Zellen zur Phänotypisierung mittels Durchflusszytometrie (siehe Hinweis 2) </li><li> Für jede 5x10 6 Zellen zu restimuliert werden, zählen und bestrahlen 5x10 6 K562 Cl9 mIL21 mit einem Gamma-Strahler bei 100 Gy. </li><li> Fügen Sie die gleiche Anzahl von bestrahlten K562 Cl9 mIL21 (1:1) und resuspendieren in Nkem in 2.5x10 5 insgesamt Zellen / ml (siehe Anmerkung 3). </li><li> Seed-Zellen in T75 Flaschen (maximal 50 ml pro Flasche). </li></ol> Tage 10 und 12 <ol start="6"><li> Zählen Sie die Anzahl der Zellen. </li><li> Ändern gesamten Medien mit frischen Nkem auf die Zellzahlen auf (siehe Anmerkung 3). </li></ol> Tag 14 <ol start="8"><li> Am Ende der zwei Wochen der Erweiterung zählen die Anzahl der Zellen in Kultur. </li><li> Beiseite 5x10 5 Zellen zur Phänotypisierung mittels Durchflusszytometrie (siehe Hinweis 2) </li><li> Wenn Expansion von PBMCs gestartet wurde der NK-Zellen können in dieser Phase der Expansion mit der RosetteSep Aufreinigungsprotokolls (siehe Abschnitt IV) gereinigt werden. Wenn Expansion wurde aus gereinigtem NK-Zellen vor der Stimulation 3 gestartet. </li><li> Nach der Reinigung beiseite 5x10 5 Zellen zur Phänotypisierung mittels Durchflusszytometrie, um die Reinheit der NK-Zellen (wie in Schritt 8) zu überprüfen. </li><li> Fahren Sie mit Stimulation 3 mit all der gereinigten NK-Zellen (siehe Anmerkung 4). </li></ol> STIMULATION 3 <ol><li> Resuspendieren NK-Zellen mit bestrahlten K562 Cl9 mIL21 (1:1) in Nkem auf Zellzahlen auf (siehe Anmerkung 3). </li></ol> Tage 17 und 19 <ol start="2"><li> Zählen Sie die Anzahl der Zellen. </li><li> Ändern Medien mit frischen Nkem auf die Zellzahlen auf (siehe Anmerkung 3). </li></ol> Tag 21 <ol start="4"><li> Am Ende der drei Wochen der Erweiterung zählen die Anzahl der Zellen in Kultur. </li><li> Recover 1x10 6 Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse für volle NK-Zell-Phänotypisierung Antikörper-Panel (siehe Tabelle 1). </li><li> Freeze-Zellen in FBS mit 10% DMSO bei einer maximalen Dichte von 5x10 7 Zellen pro Flasche für den zukünftigen Gebrauch. </li></ol> 3. NK-Zell-Zytotoxizität Assay <ol><li> Tauwetter ein Fläschchen von NK-Zellen und Saatgut in Nkem, einen Tag vor der performing Zytotoxizitätsassay zur Erholung zu ermöglichen. </li><li> Für jede NK-Zell-Zytotoxizität Assay mit einem einzelnen Ziel-Zelllinie, 6x10 5 NK-Zellen und 3x10 5 Zielzellen benötigt werden (siehe Hinweis 5). </li><li> Bereiten CAM-Media durch Verdünnen Calcein-AM (stock 1 mg / mL in DMSO) in Nkem (Siehe Anmerkung 6). </li><li> Resuspendieren 10 6 Zielzellen in 1 ml CAM-Medien (siehe Anmerkung 7). </li><li> Inkubation für 1 h bei 37 ° C, unter gelegentlichem Schütteln. </li><li> Resuspendieren NK-Zellen bei 1x10 6 Zellen / ml und fügen 200 &amp;mgr; l der NK-Zell-Suspension in jeden der 3 Wells einer U-Boden 96-Well-Platte entspricht bis 10: 1 E: T-Verhältnis in Abbildung 1 dargestellt. (Siehe Anmerkung 8) </li><li> Add 100 ul der komplette Medien, alle verbleibenden Vertiefungen, mit Ausnahme für &quot;Maximum&quot;. </li><li> Add 100 ul von 2% Triton X-100 auf &quot;Maximum&quot;. </li><li> Führen Sie serielle Verdünnungen der NK-Zellen für die 5 folgenden E: T-Verhältnissen durch die Übertragung von 100 ul der Zellen jedes Mal, gut mischen. Discard 100 ul aus den letzten Bohrungen (E: T-Verhältnis von 0.3125:1). </li><li> Nach 1 Stunde von Calcein Laden, Wasch-Zielzellen in Nkem zweimal Zentrifugation für 5 min bei 1200 Umdrehungen pro Minute. (Siehe Anmerkung 9) </li><li> Re-count die Zielzellen und resuspendieren bei 1x10 5 Zellen / ml. </li><li> Geben Sie 100 ul von Zielzellen in jede Vertiefung (1x10 4 / well). Säule für 1 min bei 100g zu Zelle Kontakt zu initiieren. </li><li> Bei 37 ° C und 5% CO 2 für 4 Stunden. </li><li> Mischen Sie die Kultur vorsichtig durch Pipettieren mit einer 100 ul Pipette, um gleichmäßig auszusetzen veröffentlicht Calcein, Spin-down Platte bei 100g für 5 Minuten die Zellen zu pelletieren und Transfer 100 ul des Überstandes auf eine neue Platte darauf achten, dass Luftblasen zu vermeiden. Pop keine Blasen, die Form mit feinen Nadel kann. </li><li> Lesen Sie die Platte mit einem fluoreszierenden Platte Leser (Anregungsfilter 485 nm, Emissions-Filter 530 nm). Unten lesen wird empfohlen. </li><li> Berechnen Prozent spezifische Lyse nach der Formel [(Test-Release-spontane Freisetzung) / (maximale Freisetzung - spontane Freisetzung)] x 100. </li></ol> 4. NK-Zell-Reinigung durch RosetteSep <ol><li> Nehmen Sie 100-fachen Überschuss an roten Blutkörperchen, dass der PBMCs oder expandierten Zellen in eine 50 ml Tube (100:1 RBC: PBMC). </li><li> Wenn Sie frische Erythrozyten direkt zum nächsten Schritt übergehen oder wenn die Erythrozyten in Alsever s Lösung gelagert wurden, zählen die Anzahl der roten Blutkörperchen und waschen entsprechende (100 facher Überschuss) Menge der roten Blutkörperchen mit PBS mit 2% FBS dreimal Zentrifugation bei 1200 rpm für jeweils 10 Minuten Zeit. </li><li> Kombinieren Sie Erythrozyten mit PBMCs aus Schritt 1.7 oder expandierten Zellen von Schritt 2.10 In PBS + 2% FBS auf ein Endvolumen von 1 ml pro 5x10 7 von PBMCs oder expandierten Zellen. </li><li> Add 1μL von RosetteSep  menschlichen NK-Zell-Anreicherung Cocktail pro 1x10 6 von PBMCs oder expandierten Zellen. </li><li> Gut mischen und bei Raumtemperatur inkubieren für 20 Minuten unter leichtem Mischen alle 5 Minuten. </li><li> Add gleichen Volumen PBS + 2% FBS vorsichtig mischen und Schicht auf Ficoll-Paque. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte der Ficoll-Paque Zentrifugation PBMC Isolation beschrieben (Abschnitt I). </li><li> Zählen Sie die NK-Zellen nach der Reinigung wieder und beiseite 5x105 Zellen für phenotpying mittels Durchflusszytometrie für NK-Zell-Reinheit (Schritt 8). </li></ol> 5. Hinweise ANMERKUNG 1. NK-Zellen können direkt aus PBMCs erweitert werden, oder von RosetteSep  gereinigt NK-Zellen. Wir haben ähnliche Expansion Effizienz festgestellt, aber einige Geber können sehr niedrige NK-Zellzahlen, was zu Schwierigkeiten Reinigung durch RosetteSep vor der Expansion haben. ANMERKUNG 2. Wir verwenden routinemäßig CD56-FITC, CD16-PE und CD3-PE-Cy5 zur Phänotypisierung während der Expansion, Aufzählen NK-Zellen als solche, die CD3-negative und CD16-oder CD56-positiv sind. ANMERKUNG 3. Bei jedem Medienwechsel oder Stimulation, um die Zellen auf 2,5 x 10 5 / ml PBMC / NK-Zell-Zahlen bei oder unter 2 Millionen pro ml zu halten in Spitzenzeiten Ausbaustufen. Dadurch wird verhindert, Erschöpfung der Nährstoffe und zur Erreichung maximaler Expansion und Überleben. ANMERKUNG 4. Die NK Expansionsrate ist Spenders abhängig und am Ende der Stimulationen 1 oder 2 ein Teil der Zellen können eingefroren werden und ein Teil weiter ausgebaut je nach den Versuchsbedingungen müssen. Wir haben gute Erfolge bei der Verwendung der eingefrorenen Zellen für Erweiterungen zu einem späteren Zeitpunkt hatte. ANMERKUNG 5. Um Raum für Fehler erlauben, empfehlen wir mit einem Minimum an 7x10 5 NK-Zellen in 700 uls der Nkem und 4x10 5 Calcein-AM gefärbt Zielzellen in 4 ml Nkem für den Aufbau der Zytotoxizitätsassay resuspendiert resuspendiert. Wenn Sie Mehrkanalpipette für die Aussaat Zielzellen höhere Volumen der Zellen (bis zu 6x10 5 in 6 mL) können je nach Größe der Medien Becken eingesetzt erforderlich sein. Auch die empfohlene NK-Zell-Zahlen sind speziell für den E: T-Verhältnissen zeigen, in das Protokoll, für die Verwendung von höheren E: T-Verhältnissen zu erhöhender NK-Zellzahlen pro ml entsprechend (zB für eine 40:1 E: T-Verhältnis verwenden 4x10 6 Zellen / ml) ANMERKUNG 6. Wir empfehlen die Durchführung einer vorläufigen Calcein-AM loading Titration für die Ziel-Zelllinie der Wahl, mit den folgenden Verdünnungen von 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 und 1:100, um eine optimale Differenz zwischen maximaler und spontane Freisetzung zu erreichen. ANMERKUNG 7. Wenn Sie ein Anhänger Zelllinie als Ziel, zunächst vorbereiten einzigen Zellsuspension mit nicht-enzymatische Zelle Dissoziationspuffer. Wenn die Durchführung ADCC, bereiten ein Duplikat Rohr von Zielzellen in CAM-media. ANMERKUNG 8 Bei der Durchführung ADCC, fügen gleichen NK-Zellen zu 3 wells entsprechende bis 10:1 E:. T für ADCC. Wiederholen Sie für weitere Spender. Wiederholen Sie für weitere Zielzellen. ANMERKUNG 9. Wenn der Durchführung einer ADCC Experiment nach 45 Minuten von Calcein Laden, fügen 10ug der spezifischen Antikörper zu induzieren ADCC gegen die Zielzellen. Nach 15 Minuten, waschen Zielzellen in Vollmedium zweimal Zentrifugation für 5 min bei 1200 Umdrehungen pro Minute. Die Zellen auf 1x10 5 Zellen / ml und fahren Sie mit dem nächsten Schritt in das Protokoll. 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Wenn die Erweiterung, wie es gemäß dem Schema durchgeführt oben beschrieben, mit 5x106 PBMCs als Ausgangsmaterial, typische NK-Zell-Erträge reichen von 1x10 Oktober von 9 bis 10 Zellen (Spender Variabilität). Die Abbildung zeigt NK-Zell-fache Expansion (n = 19) im Vergleich zu NK-Zellen in das ursprüngliche Produkt (Median + / - Quartil). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Die erweiterte NK-Zellen exprimieren verschiedene NK-Zell-Rezeptoren, die vergleichbar mit dem expandierten primären NK-Zellen mit wenigen Ausnahmen (CD11b, CD160 und CD244) sind. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. PBMCs Erholung von Buffy coat ist Spenders abhängig und kann von 300x10 6 bis 800x10 6-Reihe. NK-Zellen können aus 2% - 18% der PBMCs. Für RosetteSep Reinigung von expandierten Zellen, Gewinnung von reinen NK-Zellen am Tag 14 reicht von 40-70%. Mit der empfohlenen Protokoll der Expansion und der Reinigung kann NK-Zell-Reinheit von 99% gerechnet werden. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Expanded NK-Zellen haben Zytotoxizität gegen eine Reihe von Tumor-Zelllinien, einschließlich Neuroblastom, AML, Osteosarkom und Melanom (Vertreter AML Töten als Prozent spezifische Lyse gezeigt) nachgewiesen.

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NK-Zell-Expansion und Aktivierung Media (Nkem) <ul><li> 90% RPMI 1640 (CellGro) </li><li> 10% fötalem Rinderserum (Gibco) </li><li> 1x Penicillin / Streptomycin (CellGro) </li><li> 1x L-Glutamin (Gibco) <ul><li> Filter sterilisieren Medien vor dem Gebrauch. </li></ul></li><li> 50 U / ml IL2 (Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc) <ul><li> - Von einem 200 IU / ul Lager verdünnt. Add IL2 auf die gewünschte Menge an Medien kurz vor der Verwendung jeder Zeit. </li></ul></li></ul> PBMC und NK-Zell-Isolation <ul><li> Ficoll-Paque (GE Healthcare) </li><li> Alsever-Lösung (Sigma) </li><li> RosetteSep menschlichen NK-Zell-Anreicherung Cocktail (Stemcell Technologies) </li></ul> NK-Zell-Zytotoxizität Assay <ul><li> Calcein-AM (Invitrogen) <ul><li> Stammlösung ist bei 1 mg / ml, Lagerung in 50 ul Aliquots eingefroren. Man löst in Nkem Medien auf die gewünschte Verdünnung für Zellfärbung erreichen. </li></ul></li></ul> Antibodies Die Liste der Antikörper für die NK-Zell-Phänotypisierung verwendet werden in der nachstehenden Tabelle aufgeführt sind; <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Antikörper </td><td> Volume pro Test </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Tube 1 </td><td valign="top"> Isotyp FITC Isotyp FITC Isotyp FITC Isotyp FITC FACS-Puffer Gesamtvolumen </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td> Tube 2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 FACS-Puffer Gesamtvolumen </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td> Rohr 3 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC FACS-Puffer Gesamtvolumen </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen R &amp; D Systems Miltenyi Biotec R &amp; D Systems BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td> Tube 4 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC FACS-Puffer Gesamtvolumen </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td> Tube 5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 FACS-Puffer Gesamtvolumen </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td> Tube 6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS-Puffer Gesamtvolumen </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood nk cells

Natürliche Killerzellen (NK) Zellen spielen eine wichtige Rolle in Immunüberwachung gegen eine Vielzahl von infektiösen Mikroorganismen und Tumore. Begrenzte Verfügbarkeit von NK-Zellen und die Fähigkeit, in vitro zu erweitern hat die Entwicklung von NK-Zell-Immuntherapie beschränkt. Hier beschreiben wir eine Methode, um effizient zu erweitern riesige Mengen an funktionellen NK-Zellen ex vivo mit K562-Zellen, die Membran-gebundenen IL21, als ein künstliches Antigen-präsentierenden Zelle (AAPC). NK-Zell-Therapien Adoptiveltern bis dato eine Zelle Produkt von steady-state Leukapherese des Spenders durch Depletion von T-Zellen oder positive Selektion von NK-Zellen, gefolgt erhalten eingesetzt. Das Produkt ist in der Regel in IL-2 über Nacht und aktiviert dann verabreicht folgenden Tag 1. Aufgrund der geringen Häufigkeit von NK-Zellen im peripheren Blut, haben eine relativ kleine Zahl von NK-Zellen in klinischen Studien geliefert. Die Unfähigkeit, NK-Zellen in vitro zu propagieren ist der limitierende Faktor für die Erzeugung ausreichender Zellzahlen für optimale klinische Ergebnis gewesen. Einige Expansion von NK-Zellen (5-10 fach über 1-2 Wochen) wurde durch High-dosiertem IL-2 allein 2 erreicht werden. Die Aktivierung von autologen T-Zellen vermitteln können NK-Zell-Expansion, vermutlich auch durch Freisetzung von lokalen Zytokin-3. Unterstützung mit mesenchymalen Stromazellen oder künstliche Antigen-präsentierende Zellen (aAPCs) unterstützt die Expansion von NK-Zellen sowohl aus dem peripheren Blut und Schnur Blut 4. Kombinierte NKp46 und CD2 Aktivierung durch Antikörper-beschichteten Beads ist derzeit für NK-Zell-Expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA) vermarktet, was in etwa 100-fache Expansion in 21 Tagen. Klinische Studien mit AAPC-Erweiterung oder-aktivierten NK-Zellen sind im Gange, eine mit leukämischen Zelllinie CTV-1 bis prime und aktivieren NK-Zellen 5 ohne wesentliche Erweiterung. Eine zweite Studie nutzt EBV-LCL für NK-Zell-Expansion, das Erreichen einer mittleren 490-fache Expansion in 21 Tagen 6. Die dritte nutzt eine K562-basierte AAPC transduziert mit 4-1BBL (CD137L) und membrangebundene IL-15 (mIL-15) 7, die eine mittlere NK Expansion erreicht 277-fach in 21 Tagen. Obwohl die NK-Zellen erweitert mit K562-41BBL-mIL15 AAPC hochcytotoxisch sind in vitro und in vivo im Vergleich zu unexpanded NK-Zellen, und beteiligen sich an ADCC, ist ihre Verbreitung durch Seneszenz zugeschrieben Telomerverkürzung 8 begrenzt. In jüngerer Zeit eine 350-fache Expansion von NK-Zellen wurde berichtet, mit K562 Ausdruck MICA, 4-1BBL und IL15 9. Unsere Methode der NK-Zell-Expansion hierin beschriebenen produziert schnelle Verbreitung von NK-Zellen ohne Seneszenz Erreichen einer medianen 21.000 fache Expansion in 21 Tagen.

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Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Hier beschreiben wir eine Methode, um effizient zu erweitern und zu reinigen eine große Anzahl von menschlichen NK-Zellen und beurteilen ihre Funktion.

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Serie: Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

Reinigung von spezifischen Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &#947;&#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

Expansion von humanen peripheren Blut γδ T-Zellen mit Zoledronat

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

Antigene geschützten funktionellen Red Blood Cells durch die Membran Pfropfung von Compact hyperverzweigten Polyglycerinen

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease and treatment. It has the potential to predict therapeutic efficacy and identify novel therapeutic targets. Whole blood staining utilizes unmanipulated blood, which minimizes artifacts that can occur during sample preparation. However, whole blood staining must also be done on freshly collected blood to ensure the integrity of the sample. Additionally, it is best to prepare antibody cocktails on the same day to avoid potential instability of tandem-dyes and prevent reagent interaction between brilliant violet dyes. Therefore, whole blood staining requires careful standardization to control for intra and inter-experimental variability.
Here, we report deployment of an automated liquid handler equipped with a two-dimensional (2D) barcode reader into a standard process of making antibody cocktails for flow cytometry. Antibodies were transferred into 2D barcoded tubes arranged in a 96 well format and their contents compiled in a database. The liquid handler could then locate the source antibody vials by referencing antibody names within the database. Our method eliminated tedious coordination for positioning of source antibody tubes. It provided versatility allowing the user to easily change any number of details in the antibody dispensing process such as specific antibody to use, volume, and destination by modifying the database without rewriting the scripting in the software method for each assay.
A proof of concept experiment achieved outstanding inter and intra- assay precision, demonstrated by replicate preparation of an 11-color, 17-antibody flow cytometry assay. These methodologies increased overall throughput for flow cytometry assays and facilitated daily preparation of the complex antibody cocktails required for the detailed phenotypic characterization of freshly collected anticoagulated peripheral blood.

Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.

Ein Semi-automatisierten Ansatz zur Vorbereitung Antikörper-Cocktails für immunphänotypische Analyse von menschlichem peripherem Blut

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran erhöht die Effizienz der Lentivirale Transduktion von murinen und menschliche primäre NK-Zellen

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

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