Os autores gostariam de agradecer Laurence Cooper, Harjeet Singh, e Lenka Hurton por seu trabalho na criação da inicial K562 AAPC e mIL21 vetores de fusão. Financiamento para este trabalho foi fornecido pelo MD Anderson UT Programa Cientista Médico, a Fundação St. Baldrick, eo Legends of Friendswood.

1. Isolamento de PBMCs de Buffy Brasão Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são obtidos por centrifugação de empuxo sobre densidade Ficoll-Paque de doadores saudáveis ​​amostras obtidas por buffy coat leucaférese. <ol><li> A centrifugação Ficoll-Paque é feito como protocolo por fabricante, com pequenas modificações. </li><li> Adicionar PBS a um doador de sangue normal-bancárias buffy coat para um volume final de 140 mL (volume casaco típico buffy é 40-70 mL). </li><li> Camada de 35 mL de amostra buffy coat, em 15 mL de Ficoll-Paque (4 tubos). </li><li> Centrifugar a 400 g por 20 minutos sem freio. </li><li> Recuperar o PBMCs do Ficoll-Paque: interface plasma, não descartam a hemácias no fundo do Ficoll-Paque. </li><li> Lavar PBMCs três vezes com PBS, centrifugação cada vez menos 400g por 10 minutos. </li><li> PBMCs podem ser usados ​​diretamente para a expansão das células NK, nesta fase, ou células NK pode ser isolado por RosetteSep (Seção 4) </li><li> PBMCs restantes podem ser congelados em FBS contendo DMSO 10% em nitrogênio líquido. </li><li> Aspirar o Ficoll e recolher os glóbulos vermelhos a partir do passo 5 em duas tubo de centrífuga de 50 mL, lavar três vezes com PBS (adicionado a 50 mL marca), cada vez aspirar o sobrenadante desnatação do topo da camada de RBC para remover granulócitos. </li><li> Os glóbulos vermelhos podem ser utilizados imediatamente para RosetteSep  purificação das células NK (consulte a Seção 4) ou armazenado em volume igual de solução Alsever é a 4 ° C para uso posterior (Os glóbulos vermelhos pode ser reservado para um máximo de 4 semanas). </li></ol> 2. NK expansão celular A expansão das células NK pode ser iniciado usando PBMCs ou purificada de células NK. A quantidade de PBMCs usado para a expansão pode ser variado com base na quantidade de células NK desejado no final de uma expansão de três semanas, consulte a secção representativa resultados para obter detalhes. (Ver Nota 1) ESTIMULAÇÃO 1 Dia 0 <ol><li> Para cada 5x10 6 PBMCs ser expandido, contagem e irradiar 10x10 6 K562 CL9 mIL21 usando um irradiador gama a 100 Gy. </li><li> Pós-irradiação, lavar as células com PBS e ressuspender em células NK expansão media (Nkem). </li><li> Semente de 5x10 6 PBMCs com 10x10 6 irradiados K562 CL9 mIL21 (1:2) em 40 mL de Nkem em um frasco T75 e colocá-lo na posição vertical em uma incubadora a 37 ° CO C e 5% 2. </li></ol> Dias 3 e 5 <ol start="4"><li> Recuperar as células por centrifugação a 400g por 5 min e substituir metade da mídia com Nkem fresco (adicionando IL2 fresco para o volume de mídia inteira) e continuar a cultura. </li></ol> ESTIMULAÇÃO 2 Dia 7 <ol><li> Contar o número de células em cultura no final de uma semana. </li><li> Separe 5x10 5 células para fenotipagem por citometria de fluxo (ver nota 2) </li><li> Para cada 5x10 6 células para ser restimulated, contagem e irradiar 5x10 6 K562 CL9 mIL21 usando um irradiador gama a 100 Gy. </li><li> Adicionar um número igual de irradiados K562 CL9 mIL21 (1:1) e ressuspender em Nkem em 2.5x10 5 total de células / mL (Ver Nota 3). </li><li> Células de sementes em frascos T75 (máximo 50 mL por frasco). </li></ol> Dias 10 e 12 <ol start="6"><li> Contar o número de células. </li><li> Mudança de mídia inteira com Nkem fresco com base no número de células (Veja Nota 3). </li></ol> Dia 14 <ol start="8"><li> No final de duas semanas de expansão contar o número de células em cultura. </li><li> Separe 5x10 5 células para fenotipagem por citometria de fluxo (ver nota 2) </li><li> Se a expansão foi iniciada a partir de PBMCs as células NK pode ser purificado nesta fase de expansão utilizando o protocolo de purificação RosetteSep (consulte a Seção IV). Se a expansão foi iniciada a partir de células NK purificada proceder à estimulação 3. </li><li> Após purificação de lado 5x10 5 células para fenotipagem por citometria de fluxo para verificar a pureza das células NK (como no Passo 8). </li><li> Prosseguir com Estimulação 3 usando todas as células NK purificado (ver Nota 4). </li></ol> ESTIMULAÇÃO 3 <ol><li> Células NK ressuspender com irradiados K562 CL9 mIL21 (1:1) em Nkem com base em números de células (ver nota 3). </li></ol> Dias 17 e 19 <ol start="2"><li> Contar o número de células. </li><li> Mudança de mídia com Nkem fresco com base no número de células (ver nota 3). </li></ol> Dia 21 <ol start="4"><li> No final de três semanas de expansão contar o número de células em cultura. </li><li> Recuperar 1x10 6 células para análise de citometria de fluxo para o pleno NK painel de anticorpos de células fenotipagem (Ver Tabela 1). </li><li> Congelar células em FBS contendo DMSO 10%, a uma densidade máxima de 5x10 7 células por frasco para uso futuro. </li></ol> 3. NK ensaio de citotoxicidade celular <ol><li> Descongelar um frasco de células NK e sementes em Nkem, um dia antes da performing ensaio de citotoxicidade para permitir a recuperação. </li><li> Para cada ensaio de células NK citotoxicidade usando uma linha única célula-alvo, 6x10 5 células NK e 3x10 5 células-alvo são exigidos (ver nota 5). </li><li> Prepare CAM-Media diluindo calceína-AM (estoque 1 mg / mL em DMSO) em Nkem (Ver Nota 6). </li><li> Ressuspender 10 6 células-alvo em 1 mL de CAM-media (ver nota 7). </li><li> Incubar por 1 hora a 37 ° C, com agitação ocasional. </li><li> Células NK ressuspender em 1x10 6 células / mL e adicionar 200uL de suspensão de células NK a cada um dos três poços de um U-bottom 96 poços da placa a 10 correspondentes: 1 razão E: T mostrado na Figura 1. (Ver Nota 8) </li><li> Adicione 100uL de mídia completo para todos os poços restantes, exceto para &quot;Máximo&quot;. </li><li> Adicione 100uL de 2% Triton X-100 a &quot;máxima&quot;. </li><li> Realizar diluições em série das células NK para a E 5 subseqüentes: relações T, transferindo 100uL de células de cada vez, misture bem. Descartar 100uL dos poços passado (razão E: T de 0.3125:1). </li><li> Após 1 hora de carregamento calceína, lave as células-alvo em Nkem duas vezes, centrifugação por 5 min a 1200 rpm. (Ver Nota 9) </li><li> Re-contar as células-alvo e ressuspender em 1x10 5 células / mL. </li><li> Adicionar 100 mL de células-alvo para cada poço (1x10 4 / bem). Centrifugar por 1 min a 100g de iniciar o contato da célula. </li><li> Incubar a 37 ° C e 5% CO 2 por 4 horas. </li><li> Misture delicadamente a cultura por pipetagem com uma pipeta de 100 L, a fim de suspender a uniformemente calceína lançado, spin down placa de 100g por 5 minutos para sedimentar as células e transferir 100 mL do sobrenadante para um novo prato com cuidado para evitar bolhas. Pop as bolhas que se podem formar com agulha fina. </li><li> Leia a placa usando um leitor de placas fluorescentes (excitação filtro de 485 nm, a emissão de filtro de 530 nm). Leitura de fundo é recomendado. </li><li> Calcule Lise Percentual específicas de acordo com a fórmula [(versão de testes de liberação espontânea) / (liberação máxima - liberação espontânea)] x 100. </li></ol> 4. NK Purificação celular por RosetteSep <ol><li> Tome de 100 vezes o excesso de glóbulos vermelhos ao de PBMCs ou células expandidas, em um tubo de 50 mL (100:1 RBC: PBMC). </li><li> Se usar os glóbulos vermelhos frescos prosseguir diretamente para a etapa seguinte ou se a hemácias foram armazenados em solução Alsever s, contar o número de hemácias e de lavagem adequados (100 vezes em excesso) quantidade de hemácias com PBS suplementado com 2% FBS três vezes, centrifugar a 1200 rpm por 10 minutos a cada vez. </li><li> Combine com hemácias PBMCs a partir do passo 1.7 ou células expandidas a partir do passo 2,10 em PBS + 2% de SFB para um volume final de 1 mL por 5x10 7 de PBMCs ou células expandidas. </li><li> Adicionar 1μL de RosetteSep  Human Enrichment Célula NK Cocktail por 1x10 6 de PBMCs ou células expandidas. </li><li> Misture bem e deixe em temperatura ambiente por 20 minutos, com suave mistura a cada 5 minutos. </li><li> Adicionar igual volume de PBS + 2% FBS mix suave e camada em cima de Ficoll-Paque. </li><li> Repita os passos de Ficoll-Paque centrifugação descrita para o isolamento de PBMC (Seção I). </li><li> Contagem das células NK recuperado após purificação e reserve 5x105 células para phenotpying por citometria de fluxo para NK pureza celular (Passo 8). </li></ol> 5. Notas NOTA 1. Células NK pode ser expandida diretamente de PBMCs, ou de RosetteSep  células purificadas NK. Temos observado a eficiência de expansão semelhante, mas alguns doadores podem ter muito baixo o número de células NK, resultando na purificação dificuldade RosetteSep antes da expansão. NOTA 2. Rotineiramente usamos CD56-FITC, CD16-PE, e CD3-PE-Cy5 para fenotipagem durante a expansão, enumerando as células NK como aqueles que são CD3-CD16 negativos e ou CD56-positivo. NOTA 3. A cada troca de mídia ou estimulação, as células ressuspender a 2,5 x 10 5 mL / para manter os números PBMC / NK de células iguais ou abaixo de 2 milhões por mL em estágios de pico de expansão. Isto irá prevenir a depleção de nutrientes e ajudar a alcançar a expansão máxima e sobrevivência. NOTA 4. A taxa de expansão NK é doador dependentes e no final de estímulos 1 ou 2 parte das células pode ser congelada e parte ampliada ainda mais, dependendo da necessidade experimental. Tivemos um bom sucesso na utilização das células congeladas por expansões em um momento posterior. NOTA 5. A fim de permitir espaço para erro recomendamos a utilização de um mínimo de 7x10 5 células NK ressuspenso em 700 uls de Nkem e 5 4x10 calceína-AM células-alvo manchada ressuspenso em 4 mL de Nkem para a configuração do ensaio de citotoxicidade. Se estiver usando uma pipeta multicanal para semeadura células-alvo volumes mais altos de células (até 6x10 5 em 6 mL) pode ser necessário com base no tamanho da mídia de bacia a ser utilizado. Também o número de células NK recomendado especificamente para a E: T mostram índices no protocolo, para a utilização de maior E: relações T aumentaro número de células NK por mL em conformidade (por exemplo, para um 40:1 E: T 4x10 uso proporção 6 células / mL) NOTA 6. Recomendamos realizar uma titulação calceína-AM carregamento preliminar para a linhagem de células-alvo de escolha, utilizando os seguintes diluições de 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 e 1:100 para alcançar diferença ideal entre a liberação máxima e espontânea. NOTA 7. Ao usar uma linha de células aderentes como alvo, primeiro preparar a suspensão única célula usando não enzimático celular buffer de dissociação. Se estiver executando ADCC, prepare um tubo duplicata de células-alvo no CAM-media. NOTA 8 Se executar ADCC, adicione mesmas células NK a 3 poços correspondentes a 10:1 E:. T para o ADCC. Repita o procedimento para doadores adicionais. Repita o procedimento para as células-alvo adicional. NOTA 9. Se realizar um experimento ADCC, após 45 minutos de carregamento calceína, adicione 10ug de anticorpos específicos para induzir o ADCC contra as células-alvo. Após mais 15 minutos, lave as células-alvo em meio completo, duas vezes, centrifugação por 5 min a 1200 rpm. Ressuspender as células em 1x10 5 células / mL e prossiga com a próxima etapa do protocolo. 6. RESULTADOS REPRESENTANTE <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Quando a expansão é realizada conforme o esquema descrito acima, usando 5x106 PBMCs como matéria-prima, típica das células NK rendimento varia de 1x10 outubro 09-10 células (variabilidade doador dependente). A figura mostra a expansão de células NK vezes (n = 19) em comparação com as células NK presentes no produto original (média + / - quartil). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. As células NK expandidas expressar vários receptores de células NK que são comparáveis ​​aos unexpanded principal células NK com algumas exceções (CD11b, CD160 e CD244). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. PBMCs recuperação de Buffy coat é doador dependente e pode variar de 6 a 300x10 800x10 6. Células NK pode incluir 2% - 18% das PBMCs. Para a purificação RosetteSep de células expandidas, recuperação de pura células NK no dia 14 faixas de 40-70%. Seguindo o protocolo recomendado de expansão e purificação, a pureza das células NK de 99% pode ser esperado. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Expanded células NK demonstraram citotoxicidade contra uma série de linhagens de células tumorais, incluindo neuroblastoma, AML, osteosarcoma e melanoma (representante matando AML mostrado como lise por cento específico).

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	<li>McKenna, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Good+manufacturing+practices+production+of+natural+killer+cells+for+immunotherapy:+a+six-year+single-institution+experience.">Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience.</a> Transfusion. 47, 520-520 (2007).</li><li>Koehl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ex+vivo+expansion+of+highly+purified+NK+cells+for+immunotherapy+after+haploidentical+stem+cell+transplantation+in+children.">ex vivo expansion of highly purified NK cells for immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation in children.</a> Klinische Padiatrie. 217, 345-345 (2005).</li><li>Klingemann, H. G., Martinson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+for+clinical+applications.">ex vivo expansion of natural killer cells for clinical applications.</a> Cytotherapy. 6, 15-15 (2004).</li><li>Ayello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cord+blood+natural+killer+and+lymphokine+activated+killer+lymphocytes+following+ex+vivo+cellular+engineering.">Characterization of cord blood natural killer and lymphokine activated killer lymphocytes following ex vivo cellular engineering.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 12, 608-608 (2006).</li><li>Carlens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+in+vitro+expansion+of+cytotoxic+human+CD3-CD56++natural+killer+cells.">A new method for in vitro expansion of cytotoxic human CD3-CD56+ natural killer cells.</a> Hum Immunol. 62, 1092-1092 (2001).</li><li>Boissel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+increase+expansion+of+cord+blood+natural+killer+cells.">Umbilical cord mesenchymal stem cells increase expansion of cord blood natural killer cells.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 14, 1031-1031 (2008).</li><li>North, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-primed+human+natural+killer+cells+lyse+NK-resistant+tumor+targets:+evidence+of+a+two-stage+process+in+resting+NK+cell+activation.">Tumor-primed human natural killer cells lyse NK-resistant tumor targets: evidence of a two-stage process in resting NK cell activation.</a> J Immunol. 178, 85-85 (2007).</li><li>Berg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical-grade+ex+vivo-expanded+human+natural+killer+cells+up-regulate+activating+receptors+and+death+receptor+ligands+and+have+enhanced+cytolytic+activity+against+tumor+cells.">Clinical-grade ex vivo-expanded human natural killer cells up-regulate activating receptors and death receptor ligands and have enhanced cytolytic activity against tumor cells.</a> Cytotherapy. 11, 341-341 (2009).</li><li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+highly+cytotoxic+human+natural+killer+cells+for+cancer+cell+therapy.">Expansion of highly cytotoxic human natural killer cells for cancer cell therapy.</a> Cancer Res. 69, 4010-4010 (2009).</li><li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+potential+of+human+natural+killer+cells.">Replicative potential of human natural killer cells.</a> Br J Haematol. 145, 606-606 (2009).</li><li>Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+with+high+cytotoxicity+by+K562+cells+modified+to+co-express+major+histocompatibility+complex+class+I+chain-related+protein+A,+4-1BB+ligand,+and+interleukin-15.">Ex vivo expansion of natural killer cells with high cytotoxicity by K562 cells modified to co-express major histocompatibility complex class I chain-related protein A, 4-1BB ligand, and interleukin-15.</a> Tissue Antigens. 76, 467-467 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

NK Expansão de células e meios de ativação (Nkem) <ul><li> 90% RPMI 1640 (Cellgro) </li><li> 10% de soro fetal bovino (Gibco) </li><li> 1x Penicilina / Estreptomicina (Cellgro) </li><li> 1x L-Glutamine (Gibco) <ul><li> Esterilizar filtro media antes de usar. </li></ul></li><li> 50 U / mL IL2 (Proleukin, Vacinas e Diagnósticos da Novartis, Inc) <ul><li> - Diluído a partir de um estoque 200 IU / mL. Adicionar IL2 a quantidade desejada de mídia imediatamente antes da utilização cada vez. </li></ul></li></ul> PBMC e isolamento de células NK <ul><li> Ficoll-Paque (GE Healthcare) </li><li> Alsever solução de (Sigma) </li><li> RosetteSep Human Enrichment NK Cocktail Cell (Stemcell Technologies) </li></ul> NK ensaio de citotoxicidade celular <ul><li> Calceína-AM (Invitrogen) <ul><li> Solução estoque é de 1 mg / mL loja, congelada em 50 alíquotas mL. Dissolver em media Nkem para alcançar diluição desejada para a coloração de células. </li></ul></li></ul> Anticorpos A lista dos anticorpos utilizados para fenotipagem de células NK estão listadas na tabela abaixo; <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Anticorpo </td><td> Volume por teste </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Tubo 1 </td><td valign="top"> Isotipo FITC Isotipo FITC Isotipo FITC Isotipo FITC FACS buffer Volume Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen </td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td> Tubo 2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 FACS buffer Volume Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen </td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td> Tubo 3 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC FACS buffer Volume Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD PharMingen R &amp; D Systems Miltenyi Biotec R &amp; D Systems BD PharMingen BD PharMingen </td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td> Tubo de 4 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC FACS buffer Volume Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen </td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td> Tubo 5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 FACS buffer Volume Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td> Tubo 6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS buffer Volume Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood nk cells

Natural killer (NK) desempenham um papel importante na vigilância imune contra uma variedade de microorganismos infecciosos e tumores. Disponibilidade limitada de células NK e capacidade de expansão in vitro restringiu o desenvolvimento de NK imunoterapia celular. Aqui nós descrevemos um método eficiente para expandir a vastas quantidades de funcional NK ex vivo células usando células que expressam K562 ligada à membrana IL21, como uma célula apresentadora de antígeno artificial (AAPC). Terapias com células NK adotivos até à data têm utilizado um produto de células obtidas por steady-state leucaférese do doador seguida pela depleção de células T ou seleção positiva de células NK. O produto é geralmente activado no IL-2 durante a noite e então administrado no dia seguinte 1. Devido à baixa freqüência de células NK no sangue periférico, um número relativamente pequeno de células NK foram entregues nos ensaios clínicos. A incapacidade para propagar células NK in vitro tem sido o fator limitante para a geração de números de celular suficiente para um resultado clínico favorável. Alguma expansão das células NK (10/05 vezes ao longo de 1-2 semanas) tem ser alcançado através de altas doses de IL-2 sozinho 2. Ativação de células T autólogas podem mediar a expansão das células NK, presumivelmente, também através da liberação de citocinas local 3. Suporte com estroma mesenquimal ou células antígeno apresentando artificial (aAPCs) pode apoiar a expansão das células NK, tanto sangue periférico e sangue do cordão 4. NKp46 combinado e CD2 ativação por anticorpos revestido contas é atualmente comercializado para expansão de células NK (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resultando em expansão de cerca de 100 vezes em 21 dias. Ensaios clínicos utilizando AAPC-expandido ou ativadas as células NK estão em curso, uma utilizando a linha de células leucêmicas CTV-1 para o principal e ativar as células NK 5, sem expansão significativa. Um segundo julgamento utiliza EBV-LCL para expansão de células NK, atingindo uma média de expansão 490 vezes em 21 dias 6. A terceira utiliza uma AAPC K562 baseado transduzidas com 4-1BBL (CD137L) e ligada à membrana IL-15 (MIL-15) 7, que alcançou uma média de expansão NK 277 vezes em 21 dias. Embora, as células NK expandida usando K562-41BBL-mIL15 AAPC são altamente citotóxica in vitro e in vivo em comparação com unexpanded células NK, e participar no ADCC, sua proliferação é limitada pela senescência encurtamento dos telômeros atribuída a 8. Mais recentemente, uma expansão de 350 vezes das células NK foi relatado usando K562 MICA expressar, 4-1BBL e IL15 9. Nosso método de expansão de células NK aqui descritos produz rápida proliferação das células NK, sem senescência alcançar uma expansão média 21 mil vezes em 21 dias.

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Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Aqui nós descrevemos um método eficiente para expandir e purificar um grande número de células NK e avaliar a sua função.

Expansão, Purificação e Avaliação Funcional de Células NK do sangue periférico

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

48.1K visualizações.  MD Anderson Cancer Center - University of Texas. Aqui nós descrevemos um método eficiente para expandir e purificar um grande número de células NK e avaliar a sua função.

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Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

Purificação da população de células específicas de separação de células de fluorescência Ativado (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Imunologia e Infecção

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &#947;&#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

Expansão do sangue periférico humano γδ células T usando zoledronato

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

Antígenos funcionais protegidos glóbulos vermelhos pela membrana enxerto de compactos Poligliceróis hiper

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Uma<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar respostas imunes de sangue periférico humano células mononucleares para Vírus Respiratório Sincicial Humano Infecção

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Detecção de glicogênio no sangue periférico células mononucleares com Periodic Acid Schiff Coloração

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Geração de Células T humanas alo-específicos a partir de Sangue Periférico

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease and treatment. It has the potential to predict therapeutic efficacy and identify novel therapeutic targets. Whole blood staining utilizes unmanipulated blood, which minimizes artifacts that can occur during sample preparation. However, whole blood staining must also be done on freshly collected blood to ensure the integrity of the sample. Additionally, it is best to prepare antibody cocktails on the same day to avoid potential instability of tandem-dyes and prevent reagent interaction between brilliant violet dyes. Therefore, whole blood staining requires careful standardization to control for intra and inter-experimental variability.
Here, we report deployment of an automated liquid handler equipped with a two-dimensional (2D) barcode reader into a standard process of making antibody cocktails for flow cytometry. Antibodies were transferred into 2D barcoded tubes arranged in a 96 well format and their contents compiled in a database. The liquid handler could then locate the source antibody vials by referencing antibody names within the database. Our method eliminated tedious coordination for positioning of source antibody tubes. It provided versatility allowing the user to easily change any number of details in the antibody dispensing process such as specific antibody to use, volume, and destination by modifying the database without rewriting the scripting in the software method for each assay.
A proof of concept experiment achieved outstanding inter and intra- assay precision, demonstrated by replicate preparation of an 11-color, 17-antibody flow cytometry assay. These methodologies increased overall throughput for flow cytometry assays and facilitated daily preparation of the complex antibody cocktails required for the detailed phenotypic characterization of freshly collected anticoagulated peripheral blood.

Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.

Uma abordagem automatizada-Semi Preparando Antibody Cocktails para Análise imunofenotípica de Sangue Periférico Humano

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran aumenta a eficiência de Lentivirus transdução das células NK primário murino e humano

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Expansão, Purificação e Avaliação Funcional de Células NK do sangue periférico

PLAYLIST