Gli autori desiderano ringraziare Laurence Cooper, Harjeet Singh, e Lenka Hurton per il loro lavoro nella creazione del primo K562 aAPC e mIL21 vettori di fusione. Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito dal Programma UT Scientist medico MD Anderson, la Fondazione San Baldrick, e le leggende di Friendswood.

1. Isolamento di PBMC da Buffy Coat Cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) ottenuti per centrifugazione densità di galleggiamento su Ficoll-Paque da donatore sano campioni di buffy coat derivato da leucaferesi. <ol><li> Il Ficoll-Paque centrifugazione è fatto come protocollo per fabbricante, con piccole modifiche. </li><li> Aggiungi PBS a un normale-donatore di sangue-banca buffy coat ad un volume finale di 140 mL (tipico il volume buffy coat è 40-70 ml). </li><li> Strato di 35 ml di campione buffy coat su 15 ml di Ficoll-Paque (4 tubi). </li><li> Centrifugare a 400g per 20 minuti senza freno. </li><li> Recuperare il PBMC dal Ficoll-Paque: interfaccia plasma, non gettare i globuli rossi alla fine del Ficoll-Paque. </li><li> Lavare PBMC tre volte con PBS, centrifugazione di volta in volta a 400g per 10 minuti. </li><li> PBMC può essere utilizzato direttamente per l&#39;espansione delle cellule NK in questa fase o cellule NK può essere isolato da RosetteSep (sezione 4) </li><li> PBMC restanti possono essere congelati in FBS contenente il 10% di DMSO in azoto liquido. </li><li> Aspirare il Ficoll e raccogliere i globuli rossi dal punto 5 a due tubo da 50 ml per centrifuga, lavare tre volte con PBS (aggiunti a 50 ml mark), ogni volta che aspirare la scrematura surnatante la parte superiore dello strato di RBC per rimuovere granulociti. </li><li> I globuli rossi possono essere utilizzati immediatamente per la depurazione RosetteSep  delle cellule NK (vedi capitolo 4) o conservati in uguale volume di soluzione Alsever è a 4 ° C per un uso successivo (I globuli rossi si possono conservare per un massimo di 4 settimane). </li></ol> 2. Espansione delle cellule NK L&#39;espansione delle cellule NK può essere avviata utilizzando PBMC purificati o cellule NK. La quantità di PBMC utilizzati per l&#39;espansione può essere variata in base alla quantità di cellule NK desiderato al termine di una espansione tre settimane, fare riferimento alla sezione risultati rappresentativi per i dettagli. (Vedi Nota 1) STIMOLAZIONE 1 Giorno 0 <ol><li> Per ogni 5x10 6 PBMC da espandere, conteggio e irradiare 10x10 6 K562 CL9 mIL21 utilizzando un irradiatore gamma a 100 Gy. </li><li> Irradiazione post, lavare le cellule con PBS e risospendere in espansione dei media cellule NK (NKEM). </li><li> Semi di 5x10 6 PBMC con 10x10 6 irradiati K562 CL9 mIL21 (rapporto 1:2) in 40 mL di NKEM in un pallone T75 e metterlo in posizione verticale in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> Giorni 3 e 5 <ol start="4"><li> Recuperare le cellule mediante centrifugazione a 400g per 5 minuti e sostituire la metà della media con NKEM fresca (aggiungendo IL2 fresco per l&#39;intero volume media) e continuare la cultura. </li></ol> STIMOLAZIONE 2 7 ° giorno <ol><li> Contare il numero di cellule in coltura, alla fine di una settimana. </li><li> Mettere da parte 5x10 5 celle per fenotipizzazione mediante citometria di flusso (vedi nota 2) </li><li> Per ogni 5x10 6 celle da restimolati, conteggio e irradiare 5x10 6 K562 CL9 mIL21 utilizzando un irradiatore gamma a 100 Gy. </li><li> Aggiungi un numero uguale di irradiati K562 CL9 mIL21 (rapporto 1:1) e risospendere in NKEM a 2.5x10 5 cellule totale / mL (vedere Nota 3). </li><li> Semi di cellule in fiasche T75 (massimo 50 ml per ogni cilindro). </li></ol> Giorni 10 e 12 <ol start="6"><li> Contare il numero di cellule. </li><li> Cambia supporto intero con NKEM fresca sulla base del numero di cellule (vedere Nota 3). </li></ol> Giorno 14 <ol start="8"><li> Alla fine di due settimane di espansione contare il numero di cellule in coltura. </li><li> Mettere da parte 5x10 5 celle per fenotipizzazione mediante citometria di flusso (vedi nota 2) </li><li> Se l&#39;espansione è stata avviata da PBMC cellule NK può essere purificato in questa fase di espansione utilizzando il protocollo RosetteSep purificazione (vedi capitolo IV). Se l&#39;espansione è stata avviata da purificato le cellule NK procedere alla stimolazione 3. </li><li> Dopo la purificazione mettere da parte 5x10 5 celle per fenotipizzazione mediante citometria di flusso per verificare la purezza delle cellule NK (come al punto 8). </li><li> Procedere con stimolazione 3 usando tutte le cellule NK purificate (vedi Nota 4). </li></ol> STIMOLAZIONE 3 <ol><li> Risospendere le cellule NK con irradiati K562 CL9 mIL21 (rapporto 1:1) in NKEM base ai numeri di cellulare (vedere Nota 3). </li></ol> Giorni 17 e 19 <ol start="2"><li> Contare il numero di cellule. </li><li> Cambia media con NKEM fresca sulla base del numero di cellule (vedere Nota 3). </li></ol> Giorno 21 <ol start="4"><li> Alla fine delle tre settimane di espansione contare il numero di cellule in coltura. </li><li> Recuperare 1x10 6 celle per l&#39;analisi di citometria a flusso per la piena del pannello degli anticorpi fenotipizzazione delle cellule NK (vedi tabella 1). </li><li> Congelare le cellule in FBS contenente il 10% di DMSO ad una densità massima di 5x10 7 celle per flaconcino per uso futuro. </li></ol> 3. Test di citotossicità delle cellule NK <ol><li> Scongelare una fiala di cellule NK e le sementi in NKEM, un giorno prima performing test di citotossicità per permettere il recupero. </li><li> Per ogni test di citotossicità delle cellule NK utilizzando una linea singola cellula bersaglio, 6x10 5 cellule NK e 3x10 5 cellule bersaglio sono obbligatori (vedi nota 5). </li><li> Preparare CAM-Media diluendo calceina-AM (stock 1 mg / mL in DMSO) in NKEM (vedi Nota 6). </li><li> Risospendere 10 6 cellule bersaglio in 1 ml di CAM-media (vedi nota 7). </li><li> Incubare per 1 ora a 37 ° C, con agitazione occasionale. </li><li> Risospendere le cellule NK a 1x10 6 cellule / ml e aggiungere 200uL di sospensione delle cellule NK a ciascuno dei 3 pozzi di un U-basso 96-pozzetti corrispondenti a 10: 1 E: rapporto T mostrato nella Figura 1. (Vedi nota 8) </li><li> Aggiungi 100uL dei media completa per tutti i pozzetti rimanenti ad eccezione di &quot;Massimo&quot;. </li><li> Aggiungi 100uL del 2% Triton X-100 al &quot;Massimo&quot;. </li><li> Effettuare diluizioni seriali delle cellule NK per il successivo E 5: Rapporti con il trasferimento di T 100uL di cellule di volta in volta, mescolare bene. Eliminare 100uL degli ultimi pozzi (E: rapporto T di 0.3125:1). </li><li> Dopo 1 ora di carica calceina, lavare le cellule bersaglio in NKEM due volte, centrifugando per 5 min a 1200 giri al minuto. (Vedi nota 9) </li><li> Ricontare le cellule bersaglio e risospendere a 1x10 5 cellule / ml. </li><li> Aggiungere 100 ml di cellule bersaglio ad ogni pozzetto (1x10 4 / e). Centrifugare per 1 minuto a 100g per iniziare il contatto delle cellule. </li><li> Incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 per 4 ore. </li><li> Mescolare delicatamente la cultura pipettando con un pipetter 100 ul al fine di sospendere in modo uniforme la calceina rilasciato, spin down piastra a 100g per 5 minuti per far sedimentare le cellule e trasferimento 100 l del surnatante in una nuova piastra avendo cura di evitare bolle. Pop eventuali bolle che si possono formare con ago sottile. </li><li> Leggere la piastra con un lettore di piastre a fluorescenza (eccitazione filtro di 485 nm, emissione filtro di 530 nm). Leggere in basso è raccomandato. </li><li> Calcolare Lysis specifici percentuale secondo la formula [(rilascio spontaneo rilascio di test) / (massimo stampa - rilascio spontaneo)] x 100. </li></ol> 4. Purificazione di cellule NK RosetteSep <ol><li> Prendere di 100 volte l&#39;eccesso di globuli rossi a quella di PBMC o cellule espanse, in una provetta da 50 ml (100:1 RBC: PBMC). </li><li> Se si utilizza globuli rossi freschi procedere direttamente alla fase successiva o se i globuli rossi venivano conservati in soluzione Alsever s, contare il numero di globuli rossi e lavare appropriati (100 volte in eccesso) quantità di globuli rossi con PBS integrata con il 2% FBS tre volte, centrifugando a 1200 rpm per 10 minuti ogni volta. </li><li> Combina globuli rossi con PBMC dal punto 1.7 o cellule espanse a partire dal punto in PBS 2,10 + 2% FBS ad un volume finale di 1 mL per 5x10 7 di PBMC o cellule espanse. </li><li> Aggiungere 1ml di RosetteSep  umani Cocktail cellule NK di arricchimento per 1x10 6 di PBMC o cellule espanse. </li><li> Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti con dolce mescolando ogni 5 minuti. </li><li> Aggiungere uguale volume di PBS mix + 2% FBS delicatamente e strato sulla parte superiore di Ficoll-Paque. </li><li> Ripetere le operazioni di Ficoll-Paque centrifugazione citati per l&#39;isolamento PBMC (Sezione I). </li><li> Contare le cellule NK recuperato dopo purificazione e mettere da parte 5x105 cellule per phenotpying mediante citometria di flusso per la purezza delle cellule NK (Punto 8). </li></ol> 5. Note NOTA 1. Cellule NK può essere espansa direttamente da PBMC, o da RosetteSep  purificato le cellule NK. Abbiamo preso atto di efficienza simile espansione, ma alcuni donatori possono avere molto basso numero di cellule NK con conseguente difficoltà da purificare RosetteSep prima espansione. NOTA 2. Noi abitualmente uso CD56-FITC, CD16-PE, e CD3-PE-Cy5 per fenotipizzazione durante l&#39;espansione, enumerando le cellule NK, come quelle che sono negativi e CD3-CD16 o CD56-positive. NOTA 3. Ad ogni cambio dei media o la stimolazione, risospendere le cellule a 2,5 x 10 5 / ml per mantenere PBMC / numero di cellule NK pari o inferiore a 2 milioni di euro mL nelle fasi di picco di espansione. Questo consentirà di evitare l&#39;esaurimento delle sostanze nutritive e di contribuire a realizzare la massima espansione e sopravvivenza. NOTA 4. Il tasso di espansione è donatore NK dipendente e alla fine di stimolazioni 1 o 2 parte delle cellule possono essere congelati e parte ampliato ulteriormente a seconda delle esigenze sperimentali. Abbiamo avuto un buon successo nell&#39;usare le cellule congelate per le espansioni in un secondo momento. NOTA 5. Al fine di consentire margine di errore si consiglia di utilizzare un minimo di 7x10 5 cellule NK risospese in 700 ULS di NKEM e 4x10 5 calceina-AM cellule bersaglio colorate risospese in 4 ml di NKEM per l&#39;impostazione del test di citotossicità. Se si utilizza pipetta multicanale per la semina delle cellule bersaglio maggiori volumi di cellule (fino a 6x10 5 in 6 ml) può essere richiesto in base alle dimensioni del supporto bacino utilizzato. Anche i numeri consigliati cellule NK sono specifici per la E: T ratio mostrano nel protocollo, per l&#39;utilizzo di più E: T ratio aumentareil numero delle cellule NK per ml di conseguenza (ad esempio per un 40:1 E: 4x10 rapporto T usare 6 cellule / ml) NOTA 6. Si consiglia di eseguire una preliminare calceina-AM carico titolazione per la linea di cellule bersaglio di scelta, utilizzando i seguenti diluizioni di 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 e 1:100 per ottenere differenza ottimale tra massimo rilascio e spontaneo. NOTA 7. Quando si utilizza una linea aderente cella come obiettivo, prima preparare sospensione singola cella utilizzando non enzimatica delle cellule tampone dissociazione. Se si esegue ADCC, preparare un tubo duplicato di cellule bersaglio nel CAM-media. NOTA 8 Se si esegue ADCC, aggiungere stessa cellule NK di 3 pozzi che corrisponde a 10:1 E:. T per ADCC. Ripetere l&#39;operazione per i donatori aggiuntivi. Ripetere l&#39;operazione per le cellule bersaglio aggiuntivi. NOTA 9. Se si esegue un esperimento ADCC, dopo 45 minuti di carico calceina, aggiungere 10ug di anticorpi specifici per indurre ADCC contro le cellule bersaglio. Dopo 15 minuti, lavare le cellule bersaglio in terreno completo due volte, centrifugando per 5 min a 1200 giri al minuto. Risospendere le cellule a 1x10 5 cellule / ml e procedere con il passo successivo nel protocollo. 6. RAPPRESENTANTE RISULTATI <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Quando l&#39;espansione è effettuata secondo lo schema descritto sopra, usando 5x106 PBMC come materiale di partenza, tipico delle cellule NK gamma rese da 1x10 dal 9-10 ottobre cellule (variabilità donatore dipendente). La figura mostra l&#39;espansione delle cellule NK volte (n = 19) rispetto alle cellule NK presenti nel prodotto originale (media + / - quartile). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Le cellule NK ampliato esprimere vari recettori delle cellule NK, che sono paragonabili alle cellule primarie non espanso NK con poche eccezioni (CD11b, CD160 e CD244). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Ripresa PBMC da Buffy pelo è donatore dipendente e può variare da 6 a 300x10 800x10 6. Le cellule NK possono prevedere 2% - 18% dei PBMC. RosetteSep per la purificazione delle cellule espanse, recupero di puro cellule NK al giorno 14 compreso tra 40-70%. Seguendo il protocollo raccomandato di espansione e di purificazione, la purezza delle cellule NK del 99% può essere previsto. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Cellule NK espanso hanno dimostrato la citotossicità contro una serie di linee cellulari tumorali tra cui il neuroblastoma, leucemia mieloide acuta, l&#39;osteosarcoma e il melanoma (rappresentante uccidendo AML mostrato come lisi specifica per cento).

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

NK di espansione cellulare e Media di attivazione (NKEM) <ul><li> 90% di RPMI 1640 (Cellgro) </li><li> 10% di siero fetale bovino (Gibco) </li><li> 1x penicillina / streptomicina (Cellgro) </li><li> 1x L-Glutammina (Gibco) <ul><li> Filtro dei media Sterilizzare prima dell&#39;uso. </li></ul></li><li> 50 U / mL IL2 (Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc.) <ul><li> - Diluito da una UI / mL 200 stock. Aggiungi IL2 alla quantità desiderata di mezzi poco prima di utilizzare ogni volta. </li></ul></li></ul> PBMC e NK cella di isolamento <ul><li> Ficoll-Paque (GE Healthcare) </li><li> Soluzione di Alsever (Sigma) </li><li> RosetteSep umani NK arricchimento Cocktail Cell (Tecnologie Stemcell) </li></ul> Test di citotossicità delle cellule NK <ul><li> Calceina-AM (Invitrogen) <ul><li> Soluzione madre è a 1 mg / ml, conservare congelato in aliquote di 50 microlitri. Sciogliere in NKEM mezzi per ottenere la diluizione desiderata per la colorazione delle cellule. </li></ul></li></ul> Anticorpi L&#39;elenco degli anticorpi utilizzati per la fenotipizzazione delle cellule NK sono elencati nella tabella sottostante; <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Anticorpo </td><td> Volume per test </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Provetta 1 </td><td valign="top"> Isotipo FITC Isotipo FITC Isotipo FITC Isotipo FITC FACS Buffer Volume totale </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td> Provetta 2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 FACS Buffer Volume totale </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td> Tubo 3 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC FACS Buffer Volume totale </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen R &amp; D Systems Miltenyi Biotec R &amp; D Systems BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td> Tubo 4 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC FACS Buffer Volume totale </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td> Tubo 5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 FACS Buffer Volume totale </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td> Tubo 6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS Buffer Volume totale </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood nk cells

Natural killer (NK) svolgono un ruolo importante nella sorveglianza immunitaria contro una varietà di microrganismi infettivi e tumori. Limitata disponibilità di cellule NK e la capacità di espandere in vitro ha limitato lo sviluppo di immunoterapia delle cellule NK. Qui si descrive un metodo per estendere in modo efficiente grandi quantità di funzionali NK cellule ex vivo utilizzando cellule che esprimono K562 legata alla membrana IL21, come artificiale delle cellule presentanti l&#39;antigene (aAPC). Terapie con cellule NK adottivi fino ad oggi hanno utilizzato un prodotto cellulari ottenute da steady-state leucaferesi del donatore seguita da deplezione delle cellule T o selezione positiva delle cellule NK. Il prodotto è solitamente attivata in IL-2 durante la notte e poi somministrato il giorno seguente 1. A causa della bassa frequenza di cellule NK nel sangue periferico, un numero relativamente piccolo di cellule NK sono stati consegnati nel corso degli studi clinici. L&#39;incapacità di propagare le cellule NK in vitro è stato il fattore limitante per la generazione di numero di cellule sufficiente per l&#39;ottimale risultato clinico. Alcuni di espansione delle cellule NK (5-10 volte più di 1-2 settimane) è essere raggiunto attraverso alte dosi di IL-2 solo 2. L&#39;attivazione di cellule T autologhe possono mediare l&#39;espansione delle cellule NK, presumibilmente anche attraverso il rilascio di citochine locali 3. Supporto con stroma mesenchimale o cellule che presentano l&#39;antigene artificiale (aAPCs) in grado di supportare l&#39;espansione delle cellule NK sia da sangue periferico e cordone ombelicale 4. Combinato NKp46 e l&#39;attivazione da CD2 legate agli anticorpi perline è attualmente commercializzato per l&#39;espansione delle cellule NK (Miltenyi Biotec, Auburn CA), con conseguente espansione circa 100 volte in 21 giorni. Studi clinici utilizzando aAPC-espanso o attivate le cellule NK sono in corso, uno che utilizza la linea cellulare leucemica CTV-1 al primo e attivare le cellule NK 5 senza significativa espansione. Un secondo processo utilizza EBV-LCL per l&#39;espansione delle cellule NK, raggiungendo una espansione media 490 volte in 21 giorni 6. Il terzo utilizza un K562-based aAPC trasdotte con 4-1BBL (CD137L) e legata alla membrana IL-15 (MIL-15) 7, che ha raggiunto una media di espansione NK 277-volte in 21 giorni. Anche se, le cellule NK espansa utilizzando K562-41BBL-mIL15 aAPC sono altamente citotossici in vitro e in vivo rispetto ai non espanso cellule NK, e partecipare a ADCC, la loro proliferazione è limitata dalla senescenza attribuito a un accorciamento dei telomeri 8. Più di recente di 350 volte l&#39;espansione delle cellule NK è stato segnalato con K562 esprimere MICA, 4-1BBL e IL15 9. Il nostro metodo di espansione delle cellule NK descritta nel presente documento produce rapida proliferazione delle cellule NK senza senescenza raggiungere un&#39;espansione media 21 mila volte in 21 giorni.

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Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Qui si descrive un metodo per estendere in modo efficiente e purificare un gran numero di cellule NK e valutare la loro funzione.

Espansione, di purificazione, e la valutazione funzionale delle cellule del sangue umano periferico NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

48.1K Views.  MD Anderson Cancer Center - University of Texas. Qui si descrive un metodo per estendere in modo efficiente e purificare un gran numero di cellule NK e valutare la loro funzione.

Video: Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

Purificazione della popolazione di cellule specifiche per fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &#947;&#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

Espansione del sangue periferico umano γδ cellule T con Zoledronato

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

Gli antigeni Protetto funzionali globuli rossi dalla membrana innesto di Compact Poligliceroli Hyperbranched

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Rilevamento glicogeno in cellule periferiche mononucleate del sangue con Periodic Acid Schiff colorazione

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generazione di Human alloantigene-specifiche cellule T da sangue periferico

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease and treatment. It has the potential to predict therapeutic efficacy and identify novel therapeutic targets. Whole blood staining utilizes unmanipulated blood, which minimizes artifacts that can occur during sample preparation. However, whole blood staining must also be done on freshly collected blood to ensure the integrity of the sample. Additionally, it is best to prepare antibody cocktails on the same day to avoid potential instability of tandem-dyes and prevent reagent interaction between brilliant violet dyes. Therefore, whole blood staining requires careful standardization to control for intra and inter-experimental variability.
Here, we report deployment of an automated liquid handler equipped with a two-dimensional (2D) barcode reader into a standard process of making antibody cocktails for flow cytometry. Antibodies were transferred into 2D barcoded tubes arranged in a 96 well format and their contents compiled in a database. The liquid handler could then locate the source antibody vials by referencing antibody names within the database. Our method eliminated tedious coordination for positioning of source antibody tubes. It provided versatility allowing the user to easily change any number of details in the antibody dispensing process such as specific antibody to use, volume, and destination by modifying the database without rewriting the scripting in the software method for each assay.
A proof of concept experiment achieved outstanding inter and intra- assay precision, demonstrated by replicate preparation of an 11-color, 17-antibody flow cytometry assay. These methodologies increased overall throughput for flow cytometry assays and facilitated daily preparation of the complex antibody cocktails required for the detailed phenotypic characterization of freshly collected anticoagulated peripheral blood.

Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.

Un approccio semi-automatico di preparare anticorpi cocktail per l&#39;analisi immunofenotipica di Human sangue periferico

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Destrano migliora l'efficienza di trasduzione lentivirale di cellule NK primarie Murine ed umane

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Espansione, di purificazione, e la valutazione funzionale delle cellule del sangue umano periferico NK

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