Diese Arbeit wurde vom National Institute of Environmental Health Sciences unterstützt [K22ES012264 zu AJRB] und einem American Cancer Society InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173 bis 04] Pilot projectaward [zum AJRB]. Wir danken auch Mitglieder der Bishop-Labor für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Kommentare auf der Video-und Adam Brown insbesondere für das Beispiel von dem, was nicht zu tun. Wir danken Dr. Donald McEwen von Greehey Kinder-Krebs-Forschung für die Erlaubnis der Verwendung seiner Binokular / Video-Kamera Set-up für die Dreharbeiten der Dissektion Video. Wir bedanken uns bei Daron Brown in Corte Instruments zum Schärfen und Reparatur unserer Mikrodissektion Werkzeuge.

1. Entfernen Fremdwasser Gewebe von der Außenseite des Auges <ol><li> Gießen 1X PBS in den Deckel eines 35-mm-Schale. Das Niveau sollte knapp unterhalb der Lippe des Deckels werden. </li><li> Mit geraden Zangen, Transfer Auge (n) aus der Lagerung Rohr auf die 35mm Gericht. 1: Die Augen sind in PBS aus zwei Gründen unter Wasser. Der fremde Gewebe wird &quot;float&quot; vom Auge weg, so dass Sie sehen können, und entfernen Sie sie einfach, und 2. Während Dissektion, wird das Auge natürlich pflegen ihre Kugelform, während in der Schwebe, so dass Sie mit dieser Form eher als Arbeit gegen sie. </li><li> Mit beiden Paare von abgewinkelten Pinzette (45 ° und 15 °), sanft wie viel Muskel-und Bindegewebe wie möglich zu entfernen, ziehen das Gewebe gegen den Strich (also in Richtung der Hornhaut). Einige Bindegewebe bleibt. Dabei sollte nach den Augapfel so wenig wie möglich unter Druck zu setzen. </li><li> Handeln Sie Ihre 15 ° Zange für das Frühjahr Schere. Halten Sie das Auge ständig mit 45 ° Zange, mit der Feder Schere wegschneiden verbleibenden Muskel-und Bindegewebe sowie den Sehnerv. * Tipp: Verwenden Sie den äußeren Rand der Schere, um das Gewebe gegen den Strich schieben (in Richtung der Hornhaut-Sklera-teilen) und dann zu trimmen. Fort, bis alle fremden Gewebe aus dem Auge entfernt worden. </li></ol> 2. Entfernen Sie die Hornhaut und Linse <ol><li> Mit der Hornhaut nach oben, die 45 ° Zange kneifen eine kleine Falte in der Mitte der Hornhaut. </li><li> Mit dem Frühling Schere, einen kleinen Schnitt an der Basis der Klappe. Lassen Sie die Klappe. </li><li> Halten Sie die Augen noch mit einer Pinzette, legen Sie die untere Scherenblatt in und senkrecht zur Schnitt-und einen Schnitt in Richtung der Corneo-Sklera teilen. Versuchen Sie, Ihre Untermesser unter der Iris zu halten, damit sowohl die Hornhaut und Iris geschnitten werden. Schneiden Sie nicht den ganzen Weg auf die Hornhaut-Sklera-teilen. Halten einer Schere in das Auge eingesetzt. </li><li> Mit Ihren 45 ° Pinzette vorsichtig drehen das Auge, so dass die Schere parallel zur Hornhaut-Sklera trennen sind und machen einen kleinen Schnitt. Drehen Sie langsam den Blick um 360 °, so dass kleine Schnitte rundum. Auch hier versuchen, die untere Klinge Ihrer Feder Schere unter der Iris zu halten, damit sowohl die Iris und Hornhaut geschnitten werden. Heben Sie die Iris und Hornhaut weg vom Rest des Auges und werfen Sie sie weg. </li><li> Kippen Sie das Auge auf die Seite und drücken Sie sanft auf der hinteren Hälfte des Auges, wodurch der Linse aus. Entsorgen Sie das Objektiv. Das Innere des verbleibenden Augenmuschel ist durch das neuronale Netzhaut, die glatt und undurchsichtig sollten ausgekleidet. </li></ol> 3. Quarter die daraus resultierenden Augenmuschel, was zu einem 4 - &quot;petaled&quot; Blume-ähnliche Struktur <ol><li> Das Auge soll so positioniert, dass die Öffnung der Augenmuschel senkrecht auf den Körper sein. Verwenden Sie Ihre 45 ° Zange zu stabilisieren und die Position der Augenmuschel. </li><li> Halten Sie Ihre Feder Schere vor Ihnen, so dass sie senkrecht stehen, um Ihren Körper, legen Sie die untere Klinge Ihrer Feder Schere in die obere Kante der offenen Augenmuschel. Mit Ihren 45 ° Zange, richten Sie die Augenmuschel, so dass einem einzigen geraden Schnitt aus der Corneo-Sklera-Kluft in Richtung des Sehnervenkopfes gemacht werden kann. Alle Schnitte sollten senkrecht zur Hornhaut-Sklera-teilen und sofern nicht anders angegeben, gehen sollte möglichst nahe an den Sehnervenkopf wie möglich, ohne Schneiden hinein. </li><li> Drehen Sie die Augenmuschel 180 ° unter Beibehaltung der Rechtwinkligkeit mit Ihrem Körper. Verwenden Technik in Schritt 3.2 eine zweite senkrecht Schnitt zu machen. </li><li> Drehen Sie das Okular und wiederholen Sie die Technik in 3.2 beschrieben, zwei weitere Schnitte zu machen. Alle vier Schnitte sollten möglichst nahe an 90 ° auseinander wie möglich. Beachten Sie, dass das Auge nicht perfekt sphärische so gibt es eine gewisse Variabilität werden. </li></ol> 4. Cut jede der vier &quot;Laschen&quot; in zwei Hälften, die sich in einem Acht-Blütenblatt Blüte-Struktur <ol><li> Übertragen Sie die geviertelt Augenmuschel aus dem 35-mm-Schale auf einen sauberen Objektträger. Mit der Augenmuschel nach oben, darunter Kugel mit dem 45 ° Zange. Heben Sie ihn aus der Flüssigkeit und legen Sie es auf einen sauberen Objektträger. </li><li> Mit beiden Paare von abgewinkelten Pinzette vorsichtig öffnen sich die Augen, mit der neuronalen Netzhaut nach oben zeigt. AUF KEINEN FALL DIE neuralen Retina-es hilft dem Auge zu halten einige seiner Kugelform, so dass Sie nicht berufstätig sind dagegen. Es schützt auch die RPE entfernt, versehentlich in den folgenden Verfahren beschädigt. </li><li> Drehen Sie das Bild, bis eines der Blütenblätter steht senkrecht auf den Körper. </li><li> Verwenden Sie Ihre 15 ° Pinzette vorsichtig greifen die Ecke des Blütenblatt. Die Ecke des Blütenblatt sollte Hornhaut, nicht neuronalen Netzhaut oder RPE. Heben Sie die Ecke vorsichtig, so dass sie ihre Krümmung zu behalten. </li><li> Setzen Sie den unteren Klinge Ihrer Feder Schere zwischen dem Blütenblatt und der Folie. Richten Sie Ihr Schere, so dass eine einzelne, gerade, rechtwinklig geschnitten aus der Hornhaut-Sklera-Kluft in Richtung des Sehnervenkopfes gemacht werden kann. Cut möglichst nahe an den Sehnervenkopf wie möglich without Schneiden hinein. Lassen Sie das Blütenblatt, so dass sie auf der Folie liegen. </li><li> Drehen Sie die Folie 90 °, so dass die nächste Blütenblatt senkrecht auf Ihren Körper. Wiederholen Sie Schritt 4.5. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.5 und 4.6 noch zweimal. Die resultierende Struktur sollte wie ein Acht-Blütenblatt Blüte aussehen. </li></ol> 5. Entfernen Sie die neuralen Netzhaut <ol><li> Pipette 100-200 ul 1X PBS auf die Probe. Dies wird die neuronale Netzhaut klebt, wie Sie diese abziehen des RPE zu verhindern. </li><li> Typischerweise werden die neuronalen Netzhaut ist lose mit dem RPE befestigt. Allerdings dauert es, Übung und Geschick, um nur die neuralen Netzhaut und nicht der RPE zu entfernen. Fassen Sie ein Blütenblatt der neuronalen Netzhaut mit einem Paar abgewinkelte Pinzette und stabilisiert (gedrückt halten) den Rest des Auges mit dem anderen Paar abgewinkelte Pinzette. Ziehen Sie die neuralen Netzhaut weg vom Rest des Auges. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gesamte neuronale Netzhaut entfernt worden ist. * Tipp: Kleben Sie die Spitze des 15 ° Zange in den Sehnervenkopf für das Auge zu verankern. Dann nutzen Sie die 45 ° Pinzette aufkehren unter der neuronalen Netzhaut und heben Sie sie ab und weg. Es ist normalerweise am besten, die neuronalen Netzhaut von der Sehnerv Kopf in Richtung der Corneo-Sklera-teilen zu heben. Achten Sie darauf, wegzuziehen alle losen Reste der Iris. Die Iris ist ganz klebrig und kann ansonsten auf die RPE stecken. </li><li> Spülen Sie die Probe mit 1X PBS. Pipette 100-200 ul 1X PBS in die Probe und saugen ihn wieder aufzubauen. Entsorgen Sie die PBS. Bei Bedarf wiederholen, um Staub und Schmutz zu entfernen. </li></ol> 6. Montieren Sie Probe (n) auf einer Folie <ol><li> Pipette 80-90 ul von 90% Glycerin auf eine neue Folie in eine rechteckige Form. Verwenden Sie die Seite der Pipettenspitze, um eine gleichmäßige, rechteckige Abstrich von Glycerin zu machen. (Dies ist das Verfahren für die Montage von zwei RPE auf einer Folie.) </li><li> Setzen Sie den unteren Arm von 15 ° Zange unter der Probe. Heben Sie die Probe aus dem Sezieren gleiten. </li><li> Langsam senken die Probe in das Glycerin. Sanft wiggle der Zange, wie Sie sie herausziehen unter der Probe. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6,1-6,3 für die anderen Proben. </li><li> Drehen Sie die Folie, so dass die lange Seite senkrecht auf Ihren Körper. Halten Sie Ihr Deckglas in einem 45 ° Winkel auf die Folie, so dass es zu berühren ist die Folie. Move it auf die Glycerin-Abstrich, bis sie sich berühren. Aufrechterhaltung des Kontakts zwischen dem Deckglas und Objektträger, langsam das Deckglas entfernt von der Abstrich, auf den Rand der Folie. Line up den langen Seiten des Schlittens und das Deckglas, so dass sie parallel sind. Halten Sie die Ecken des Deckglases zwischen Daumen und Zeigefinger. </li><li> Nehmen Sie den 15 ° Zange in der anderen Hand. Cradle der oberen (kostenlos) Rand des Deckglases in die Armbeuge. Sehr langsam, senken Sie die Abdeckung aus Glas. Wenn der Kontakt zwischen dem Deckglas und Glycerin gemacht wird, zu stoppen und warten auf die Glycerin zu migrieren. Wiederholen Sie diesen Senken und warten, bis die RPE ganzen mounts vollständig abgedeckt werden. Dies ist die hochviskose Glycerin aus der Aufnahme von Luftblasen zu verhindern. NICHT drücken Sie auf dem Deckglas - das Glycerin wird Squeeze-out unter ihm, was Haftung sehr schlecht. </li><li> Mit klaren Nagellack, Farbe rund um den Perimeter, wo das Deckglas und Objektträger zu erfüllen. </li><li> Legen Sie die Folie auf der Oberseite eines leeren Rack, um zu trocknen. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Das Ergebnis dieser Prozedur sollte eine Struktur, die wie eine Blume aussieht und sollte recht symmetrisch sein. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Whole mount RPE von einem Wildtyp C67Bl/6J Maus. RPE aus schwarzem oder agouti Tiere sollten von dunkelbrauner Farbe und sollte eine glatte Oberfläche haben. Es ist normal, Wellen in der Topographie der Blütenblätter kündigen. Die Pigmentierung auf jedem geben Proben können etwas variable, durch variable Dichte der Pigmentierung sowohl der RPE und der darunter liegenden Aderhaut. Weiße Pfeile zeigen auf hypopigmentierte &quot;Kanäle&quot; - das ist normal und ist aufgrund der zugrunde liegenden Gefäßsystem des Auges. Blauer Pfeil zeigt auf physische Schäden am RPE und der zugrunde liegenden Aderhaut. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Whole mount RPE aus einer verdünnten Maus. Proben aus verdünnter Tieren geerntet werden in der Farbe von fast transparent zu Café au lait und in jeder ein Exemplar ist wie die Variabilität in sich haben, angegeben in schwarzen Kreisen hier. Im Allgemeinen sind RPE von jüngeren Tieren geerntet leichter und die von älteren Tieren geerntet werden dunkler. Schwarze Pfeile zeigen einige der zugrunde liegenden Blutgefäßen, die hypopigmentierte erscheint. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Phalloidin-Färbung kann verwendet werden, um körperliche Schäden an der RPE erkannt werden. Phalloidin-Färbung deutlich die Zellmembranen, zeigt die sechseckige Form des Epithels. (A) Beispiel aus einem schwarzen Maus. (B) Beispiel aus einer verdünnten Maus. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Ein schlecht präpariert RPE aus einer verdünnten Maus. (A) Werte in Klammern zeigen die Margen der Hornhaut, die zu breit sind, die dazu führen Knicken und / oder Falten können. Innerhalb der schwarzen Kreis sieht man große Mengen von Fremdstoffen Gewebe, das nicht aus dem hinteren Teil des Auges entfernt worden sind. Sie sind besonders offensichtlich, da die Probe aus einer verdünnten Tier. Das Blütenblatt in der linken unteren teilweise umgeschlagen. (B) Das ganze Berg sieht aus wie ein Windrad. Schwarze Pfeile zeigen einige der Einschnitte, die gemacht wurden. Viele der Kürzungen aus der Hornhaut-Sklera-Kluft in Richtung des Sehnervs sind nicht im Einklang mit dem Durchmesser. (C) Schwarze Pfeile zeigen an, wie die Kürzungen hätte erfolgen müssen, in Einklang mit dem Durchmesser und senkrecht zur Tangente.

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	<li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzo(a)pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice.">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li><li>Reliene, R. H. l. a. v. a. c. o. v. e., Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice.">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li><li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice.">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li><li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion.">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li><li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo.">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2010).</li><li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-,+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development.">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li><li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity.">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li><li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+phenotype+and+the+RPE:+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt?.">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?.</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li></ol>

Das RPE ist die Website des p un-Assay, einem In-vivo-Assay von Homologie-directed reparieren. Die p un-Assay wurde verwendet, um die Auswirkungen der verschiedenen DNA-Schäden 1,2 und DNA-Schäden Signal-und Reparatur-Gene 3,4,5 über die Häufigkeit von Homologie-directed Reparatur zu studieren. Dieser Test ist sehr empfindlich, Aufdeckung Single-Cell-Veranstaltungen auf der RPE 1. Es kann auch erkennen, Unterschiede im Timing der Homol...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>straight forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4903</td>
<td>tip: .08 x .04 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>45&deg; forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5005</td>
<td>tip: .05 x.01 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>15&deg; "up" forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5045A</td>
<td>tip: .1 x.06 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5604</td>
<td>comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel</td>
</tr>
<tr>
<td>binocular dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ziess</td>
<td>Discovery V.8</td>
<td>use reflected light source</td>
</tr>
<tr>
<td>phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A22283</td>
<td>Alexa Fluor 546</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium

Das retinale Pigmentepithel (RPE) liegt an der Rückseite des Säugetier-Auge, gerade unter der neuralen Netzhaut, die Photorezeptoren (Stäbchen und Zapfen) enthält. Das RPE ist eine Monoschicht von pigmentierten kubischen Zellen und Mitarbeiter eng mit der neuronalen Retina knapp darüber. Dieser Verein macht die RPE von großem Interesse für Forscher untersuchen Netzhauterkrankungen. Das RPE ist auch der Ort einer in vivo-Assay von Homologie-directed DNA-Reparatur, die p un-Assay. Die Maus Auge ist besonders schwer zu sezieren aufgrund seiner geringen Größe (ca. 3,5 mm im Durchmesser) und seine Kugelform. Dieser Artikel zeigt im Detail ein Verfahren für die Präparation des Auges führt einen ganzen Berg der RPE. In diesem Verfahren zeigen wir, wie man mit und nicht gegen die kugelförmige Struktur des Auges zu arbeiten. Kurz gesagt, sind das Bindegewebe, Muskeln und Sehnerv aus dem hinteren Teil des Auges entfernt. Dann werden die Hornhaut und die Linse entfernt. Als nächstes sind strategische Schnitte, die zu erheblichen Abflachung der übrigen Gewebe. Schließlich ist der neuronalen Retina vorsichtig abgehoben, enthüllt eine intakte RPE, die noch auf die zugrunde liegende Ader-und Lederhaut befestigt wird. Das ganze Berg kann die p un-Assay oder für die Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz Beurteilung des RPE Gewebe durchzuführen.

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Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Eine formale Demonstration der Zerlegung einer Maus Auge, was zu einem ganzen Berg der retinalen Pigmentepithels.

Präparation einer Maus Eye für einen ganzen Berg von retinalen Pigmentepithel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

dissection-mouse-eye-for-whole-mount-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

49.0K Aufrufe.  Greehey Children's Cancer Research Institute and Department of Cellular and Structural Biology. Eine formale Demonstration der Zerlegung einer Maus Auge, was zu einem ganzen Berg der retinalen Pigmentepithels.

Serie: Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

Experimentelle Modelle für das Studium der retinalen Pigmentepithelzellen Physiologie und Pathophysiologie

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Forschung

Neurowissenschaften

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Ganze Berge Vorbereitung des Adult Drosophila Bauchmark für Giant Fiber Injection Dye

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Zerlegung des Transversus Abdominis Muskels für die neuromuskuläre Junction-Analyse

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbus-Ansatz-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie bei Mäusen Retinapigmentepithel

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

Langfristige, serumfreie Kultivierung organotypischer Maus-Retina-Explanten mit intaktem retinalen Pigmentepithel

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

Immunfärbung von Whole-Mount-Netzhäuten mit der CLARITY Tissue Clearing Methode

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Isolierung der Netzhaut von Mäusen und Methanolbehandlung zur Untersuchung von retinalen Ganglienzellen

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

Autor im Rampenlicht: Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat für die Untersuchung von retinalen Ganglienzellen  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...