Diese Studie wurde von einem Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC) Forschungsstipendium und Alberta Agriculture Funding Consortium gewähren DRB unterstützt. AMR ist durch ein NSERC Vanier kanadischen Graduate Scholarship, der University of Alberta Lehre Assistenzzeit und Queen Elizabeth II Graduiertenstipendium unterstützt.

Dieser Vorgang kann in 500 ul silikonisierten Röhrchen oder 6 ml Polystyrol Rundboden-FACS-Röhrchen durchgeführt werden. Letzteres ist normalerweise verwendet, wenn die Durchführung Lebensfähigkeit Analyse in Verbindung mit anderen Verfahren. Alle Bände beziehen sich auf 6 ml Polystyrol Rundboden-FACS-Röhrchen. Für 500 ul silikonisierten Röhrchen, reduzieren alle Bände von 1 / 5. Die optimale Konzentration für die Durchflusszytometrie-Analyse beträgt 2-4 x 10 6 Zellen pro 200 ul Volumen. Zellverlust kann durch dieses Verfahren entstehen und somit empfehlen wir, dass jede Probe von 4 x 10 6 Zellen bestehen zu Beginn des Verfahrens. 1. Cell Preparation <ol><li> Ernten Sie die Zellen - beziehen sich auf spezifische Verfahren für die entsprechenden Zelllinien oder primären Zellen Isolierungen. </li><li> Centrifuge Proben bei 335 x g für 10 Minuten und Dekantieren des Überstandes. </li><li> Die Zellen in 2 mL 1 x Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) - / - (kein Kalzium, kein Magnesium). </li><li> Centrifuge Proben bei 335 x g für 10 Minuten und Dekantieren des Überstandes. </li><li> Die Zellen in 1 ml 1 x Annexin V-Bindungspuffer. </li><li> Centrifuge Proben bei 335 x g für 10 Minuten und Dekantieren des Überstandes. </li><li> Die Zellen in 100 ul 1 x Annexin V-Bindungspuffer. </li></ol> 2. Die Anwendung des Annexin V / PI Stain <ol><li> Add Annexin V nach den Empfehlungen des Herstellers [zB 5 ul Annexin V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)]. </li><li> Die Röhrchen im Dunkeln für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Geben Sie 100 ul 1 x Annexin V-Bindungspuffer zu jedem Reaktionsgefäß. Es sollte etwa 200 ul in jedes Röhrchen werden. </li><li> Add 4 ul PI (Sigma, Kat. Nr. P-4864-10ml), dass die verdünnt wurden in 1 x Annexin V-Bindungspuffer (dh 1 ul PI mit 9 ul 1 x Annexin V-Bindungspuffer) 1:10. Man erhält einen endgültigen PI-Konzentration von 2 pg / mL in jeder Probe. </li><li> Die Röhrchen im Dunkeln für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Add 500 ul 1 x Annexin V-Bindungspuffer, um die Zellen zu waschen. </li><li> Centrifuge Proben bei 335 x g für 10 Minuten und Dekantieren des Überstandes. </li><li> Die Zellen in 500 ul 1 x Annexin V-Bindungspuffer und 500 ul 2% Formaldehyd zu einer 1% Formaldehyd (Fixativ)-Lösung zu schaffen. Mix Rohre durch vorsichtiges Schnippen. </li><li> Fix Proben auf Eis für 10 Minuten. Alternativ können die Proben über Nacht bei 4 ° C gelagert werden in der Dunkelheit. Wenn die letztere Methode gewählt wird, stellen Sie sicher zu sein über alle Rohre mit Annexin V / PI (einschließlich des Ersatzes Kontrollen) bezeichnet konsistent. </li><li> 1 ml 1 x PBS - / - zu jeder Probe und mischen Sie vorsichtig durch flicking. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 425 x g für 8 Minuten und Dekantieren des Überstandes. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,10 und 2,11. </li><li> Pellet Dazu den Schlauch. </li><li> Add 16 ul von 1:100 verdünnt RNase A (Sigma, R4642) zu einer Endkonzentration von 50 ug / mL zu geben. Inkubieren für 15 min bei 37 ° C. </li><li> 1 ml 1 x PBS - / - und vorsichtig mischen durch flicking. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 425 x g für 8 Minuten. </li><li> Die Proben werden nun analysiert werden. Alternativ können die Proben für die anschließende Färbung Schritte verwendet werden, wenn Annexin / PI-Färbung ist in parallel mit anderen Verfahren durchgeführt werden. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Beispiele von Zelltypen und Zelllinien, die in unterschiedlichem Maße von falsch-positiven PI-Färbung haben, sind in Abbildung 1 dargestellt. Um der falsch-positiven Ereignisse wurden die Zellen fixiert und anschließend mit RNase A behandelt Daraus ergibt sich eine signifikante Abnahme in der Zahl der falsch-positiven Ereignisse im Vergleich zu Zellen, die nicht unterzogen wurden RNase-Behandlung (Abbildung 2B). Abbildung 2C zeigt repräsentative Bilder von Zellen, die RNase-Behandlung unterzogen, im Vergleich zu Zellen, die keine RNase-Behandlung hatte. Abbildung 3 zeigt, wie die modifizierte Annexin V / PI-Protokoll, mit Fixierung und RNase Behandlungsschritte, auf herkömmliche Protokolle verbessert, indem die Anzahl der falsch-positiven Färbung Veranstaltungen. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Konventionelle Propidiumiodidfärbung Protokolle eine signifikante Anzahl von falsch positiven Ereignissen führen. Wir haben früher Ausmaß der falsch-positiven Färbung in primären Zellen in einem breiten Spektrum von Tiermodellen sowie in einer Vielzahl von Zell-Linien 10 ausgewertet. Repräsentative Bilder zeigen Ausmaß der falsch-positiven Färbung in drei einzigartigen Zellpopulationen (eine häufig verwendete Zelllinie - RAW Makrophagen und zwei primäre Zellen - Knochenmark der Maus Makrophagen (BMM) und Goldfische primären Nieren-Makrophagen (PKM)). Wahre positive Ereignisse die erwarteten Co-Lokalisation zwischen PI und DRAQ5 innerhalb der nuklearen Fach (gelbe Flächen zeigen Kolokalisation zwischen PI und DRAQ5). DRAQ5 ist sehr membrane durchlässiger Farbstoff, der genau Flecken nuklearen Fach sowohl in lebenden und toten Zellen 10,11,12. Zur leichteren visuellen Bestimmung der Kolokalisation DRAQ5 Fleck war eine grüne pseudocolour gegeben. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Verbesserung der Genauigkeit der PI Kernfärbung. (A) Wir untersuchten die Genauigkeit der PI Kernfärbung auf Grad der Ähnlichkeit einer Reihe von gut charakterisierten Kernfärbemittel (BrdU, 7-AAD und DAPI) zu DRAQ5 basiert. BrdU ist ein synthetisches Nukleosid, die in die DNA proliferierender Zellen eingebaut wird, und als solche wird nur innerhalb der nuklearen Fach Fleck. 7-AAD hat eine hohe Affinität für DNA und, ähnlich wie bei PI, sie können nicht über eine intakte Plasmamembran. DAPI hat auch eine starke Affinität zu DNA und ist die am häufigsten verwendeten nuklearen in Fluoreszenzmikroskopie Fleck. Der Grad der Ähnlichkeit war&gt; 99% zwischen BrdU, 7-AAD, DAPI und DRAQ5, Hervorhebung ihrer Fähigkeit, genau zu färben den Zellkern in RAW 264.7 Makrophagen. Im Gegensatz dazu führt zytoplasmatische PI-Färbung auf herkömmlichen Protokollen zu einer deutlichen Abnahme in Prozent Ähnlichkeit der Färbung gegenüber DRAQ5. Knochenmark der Maus Makrophagen (BMM) und Goldfische primären Nieren-Makrophagen (PKM): (B) Ähnliche Ergebnisse werden in zwei primäre Zellen getestet beobachtet. Der Einbau von 50 ug / mL RNase A bei bestimmten Stufe innerhalb der Färbung entfernt nicht-nuklearen PI-Färbung und erhöht Grad der Ähnlichkeit in Bezug auf DRAQ5 Färbung. (C) Repräsentative Bilder von primären Nieren-Makrophagen zeigen den Grad der Ähnlichkeit für Zellen mit und ohne RNase-Behandlung. Zur leichteren visuellen Bestimmung der Unterschiede zwischen den Behandlungen war DRAQ5 einen grünen gegeben. Yellow Bereichen zeigen Kolokalisation zwischen BrdU und DRAQ5 und PI und DRAQ5. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Geändert Annexin V / PI reduziert falsche Apoptose / Nekrose Veranstaltungen. Primäre Goldfisch Nieren Makrophagen (PKM) wurden mit herkömmlichen und modifizierten Annexin V / PI-Protokolle gefärbt. Streudiagramme zeigen die Annexin V / PI in Goldfische PKM Fleck. Das Streudiagramm auf der linken Seite zeigt konventionellen Annexin V / PI-Färbung (keine RNase) von PKM-Zellen. Das Streudiagramm auf der rechten Seite zeigt PKM-Zellen mit dem modifizierten Annexin V / PI-Protokoll (mit RNase) gefärbt. Die Zugabe von RNase führt zu einer deutlichen Reduzierung der PI-Färbung durch das Entfernen von falsch-positiven Flecken. PKM Zellen wurden dann auf unterschiedliche Populationen innerhalb der Kulturen und frühen Vorläuferzellen (EP), Monozyten (Mono) und reifen Makrophagen (Mat mac) analysiert wurden. Der Rückgang in der Anzahl der positiven PI Ereignisse, aufgrund der Entfernung von falsch-positiven Ereignisse ist ausgeprägter in großen reifen Makrophagen als in kleineren frühen Vorläuferzellen. Schlussfolgerungen zu herkömmlichen Protokollen basieren würden fälschlicherweise vorgeschlagen haben eine positive Korrelation in zellulären Tod für die reifere Makrophagen Teilmengen.

<ol>
	<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+apoptotic+cell+death.">Flow cytometry of apoptotic cell death.</a> J Immunol Methods. 243, 167-190 (2000).</li><li>Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., De Ridder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+V+expression+in+apoptotic+peripheral+blood+lymphocytes:+An+electron+microscopic+evaluation.">Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation.</a> Apoptosis. 7, 41-47 (2002).</li><li>Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytofluorometric+analysis+of+cell+cycle+distributions+using+propidium+iodide.+Properties+of+the+method+and+mathematical+analysis+of+the+data.">Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data.</a> J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).</li><li>Bacso, Z., Everson, R. B., Eliason, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+of+Annexin+V-binding+apoptotic+cells+is+highly+fragmented.">The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented.</a> Cancer Res. 60, 4623-4628 (2000).</li><li>Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P., Traganos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+apoptotic+cells+measured+by+flow+cytometry.">Features of apoptotic cells measured by flow cytometry.</a> Cytometry. 13, 795-808 (1992).</li><li>Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+death/life+regulator+in+apoptosis+and+necrosis.">The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis.</a> Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).</li><li>Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+and+necrotic+cell+death+induced+by+death+domain+receptors.">Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors.</a> Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).</li><li>Faleiro, L., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+disrupt+the+nuclear-cytoplasmic+barrier.">Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier.</a> J Cell Biol. 151, 951-959 (2000).</li><li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Luong, L. T., Schang, L. M., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+apoptosis+assays+using+propidium+iodide+generate+a+significant+number+of+false+positives+that+prevent+accurate+assessment+of+cell+death.">Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death.</a> J Immunol Methods. 358, 81-92 (2010).</li><li>Edward, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Use+of+DNA-specific+anthraquinone+dyes+to+directly+reveal+cytoplasmic+and+nuclear+boundaries+in+live+and+fixed+cells.">Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells.</a> Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).</li><li>Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+analysis+of+the+DNA+targeting+bisalkylaminoanthraquinone+DRAQ5+in+intact+living+cells.">Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells.</a> Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).</li></ol>

Die Annexin V / PI-Protokoll hier vorgestellte ist eine modifizierte Version der herkömmlichen Protokollen und berücksichtigt das Vorhandensein von RNA in das Zytoplasma, die auch eine hohe Affinität für PI. Einführung von RNase A (50 pg / mL) bei einer 1% Formaldehyd Fixierung Schritt spät in der Färbung deutlich verbessert die Genauigkeit der nuklearen PI-Färbung. Keine negativen Auswirkungen sind in der nuklearen PI-Färbung oder Plasmamembran Annexin V-Färbung beobachtet. Ohne RNase A-Behandlung können bis zu 40% der PI-Färbung Ergebnisse zu falsch positiven Ereignisse, die zu einer potenziell signifikante und negative Auswirkungen auf die nachgelagerten Schlussfolgerungen 10 führt zu führen. Unsere modifizierte Annexin V / PI-Färbung Protokoll ist einfach und wurde effektiv in einem breiten Spektrum von Zelltypen (primäre Zellen verwendet: Knochenmark der Maus Makrophagen und Splenozyten; Schweinegrippe Lunge residenten Zellen, Lunge Alveolarmakrophagen, Mesenteriallymphknoten Isolate, Leukozyten des peripheren Blutes , Splenozyten; Huhn Blastoderm Zellen; Goldfische primären Nieren-Makrophagen; Karpfen Leukozyten des peripheren Blutes; Zelllinien: RAW 264.7 Makrophagen, Jurkat T-Zellen, Schweine 3D4/31 Makrophagen, CCL-71 Goldfischen fin Fibroblasten, 3B11 Wels B-Zellen 10). Es ist wichtig zu beachten, dass die Zellen differentiell durch falsche positive PI-Färbung, mit primären Zellen in der Regel mit einer größeren Anzahl von falsch positiven Ereignissen 10 betroffen. Die Unterschiede falsch positiven PI-Färbung bei diesen Zellpopulationen können teilweise auf Unterschiede in der Zellgröße zugeschrieben werden, kann aber auch aus Unterschieden in RNA-Gehalt führen. Als solche Einbindung dieses Verfahrens ist besonders relevant für die experimentelle Systeme, die zu nutzen, unter anderem, Zellen, die eine genotoxischen Stress, Zellen mit Zellzyklusarrest Drogen wie Thymidin oder Hydroxyurea, viral infizierte Zellen, und Studien an embryonalen Zellen, in denen Entwicklungsfortschritt behandelt wird durch diskrete Veränderungen in der zellulären RNA-Synthese aus.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1 x PBS-/-</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 x Annexin V Binding Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>556454</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Annexin V-Alexa Fluor 488</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes (Invitrogen)</td>
<td>A13201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Propidium iodide (PI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P4864</td>
<td>1 mg/mL in H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>2% Formaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F1268</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A from bovine pancreas</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R4642</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DRAQ5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biostatus</td>
<td>DR50050</td>
<td>Dilute 1:60 in 1 x PBS-/-</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

modified annexin v/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death

Studium der Apoptose haben sich seit der Einführung der Durchflusszytometrie-basierte Methoden beeinflusst. Propidiumiodid (PI) ist weit verbreitet in Verbindung mit Annexin V verwendet werden, um festzustellen, ob Zellen lebensfähig, apoptotischen oder nekrotischen werden durch Unterschiede in der Plasmamembran Integrität und Permeabilität 1,2. Die Annexin V / PI-Protokoll ist ein häufig verwendeter Ansatz zur Untersuchung von apoptotischen Zellen 3. PI ist häufiger als andere Kernfärbemittel, weil es wirtschaftlich, stabil und ein guter Indikator für die Lebensfähigkeit der Zellen ist, basierend auf ihrer Fähigkeit, Farbstoff in lebenden Zellen 4,5 ausgeschlossen werden. Die Fähigkeit von PI in eine Zelle ist abhängig von der Durchlässigkeit der Membran; PI keine Flecken zu leben oder frühen apoptotischen Zellen durch das Vorhandensein einer intakten Plasmamembran 1,2,6. In späten apoptotischen und nekrotischen Zellen, verringert sich die Integrität der Plasma-und Kernmembran 7,8, so dass PI durch die Membranen passieren, interkalieren in Nukleinsäuren und zeigen rote Fluoreszenz 1,2,9. Leider finden wir, dass herkömmliche Annexin V / PI-Protokolle führen zu einer erheblichen Zahl von falsch positiven Ereignissen (bis zu 40%), die mit PI-Färbung von RNA im Zytoplasma Fach 10 verbunden sind. Primärzellen und Zelllinien in einer breiten Palette von Tiermodellen betroffen sind, mit großen Zellen (nuclear: zytoplasmatische Verhältnisse &lt;0,5) mit dem höchsten Vorkommen 10. Wir zeigen hier, eine modifizierte Annexin V / PI-Methode, die eine deutliche Verbesserung für die Beurteilung des Zelltods im Vergleich zu herkömmlichen Methoden bietet. Dieses Protokoll nutzt Veränderungen in zellulären Permeabilität während Zellfixierung um das Eindringen von RNase A in Zellen nach Färbung zu fördern. Sowohl das Timing und die Konzentration von RNase A wurden zum Entfernen von cytoplasmatischen RNA optimiert. Das Ergebnis ist eine deutliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Annexin V / PI-Protokolle (&lt;5% events mit zytoplasmatischen PI-Färbung).

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Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Eine genaue Methode für die Beurteilung der Zelltod beschrieben. Das Protokoll verbessert die auf konventionellen Annexin V / Propidiumiodid (PI)-Protokolle, die up-Display zu 40% falsch-positive Ereignisse in Zelllinien und Primärzellen aus einer breiten Palette von Tiermodellen.

Geändert Annexin V / Propidiumiodid Apoptose Assay für eine genaue Beurteilung des Zelltods

Studies of cellular apoptosis have been significantly impacted since the introduction of flow cytometry-based methods. Propidium iodide (PI) is widely ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

102.7K Aufrufe.  University of Alberta. Eine genaue Methode für die Beurteilung der Zelltod beschrieben. Das Protokoll verbessert die auf konventionellen Annexin V / Propidiumiodid (PI)-Protokolle, die up-Display zu 40% falsch-positive Ereignisse in Zelllinien und Primärzellen aus einer breiten Palette von Tiermodellen.

Serie: Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

Geändert Maus embryonalen Stammzellen basierte Assay zur Quantifizierung von Kardiogener Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Forschung

Biologie

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative positive or negative regulators of cell death. In this system, N. benthamiana leaves are co-infiltrated with a 35S driven expression cassette containing the gene to be analyzed, and the GUS vector pCAMBIA 2301 using Agrobacterium strain LBA4404 as a vehicle. Because live cells are required for GUS expression to occur, loss of GUS activity is expected when this marker gene is co-expressed with positive regulators of cell death. Equally, increased GUS activity is observed when anti-apoptotic genes are used compared to the vector control. As shown below, we have successfully used this system in our lab to analyze both pro- and anti-death players. These include the plant anti-apoptotic Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) family, as well as, known mammalian inducers of cell death, such as BAX. Additionally, we have used this system to analyze the death function of specific truncations within proteins, which could provide clues on the possible post-translational modification/activation of these proteins. Here, we present a rapid and sensitive plant based method, as an initial step in investigating the death function of specific genes.

A &amp;#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Programmed cell death assays commonly used in mammalian systems such as DNA laddering or TUNEL assays, are often difficult to reproduce in plants. In combination with a GUS reporter system, we propose a rapid, plant based transient assay to analyze the potential death properties of specific genes.

Eine β-Glucuronidase (GUS) Basierend Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

Verwendung LysoTracker zum programmierten Zelltod in Embryonen Erkennen und Differenzieren embryonalen Stammzellen

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Die Tomate / GFP-FLP / FRT Verfahren zur Live-Imaging von Mosaic Erwachsene<em&gt; Drosophila</em&gt; Sehzellen

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Strategien für die Spurhaltung Anastasis, einer Zelle Überleben Phänomen, das Apoptose Kehrt

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Bewertung der Selective mRNA Translation in Säugerzellen durch Polysomen Profilieren

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and pathological roles, there is need of high-throughput screening (HTS) assays to identify GJ modulators in drug discovery and toxicology assays. A novel iodide-yellow fluorescent protein-gap junction-intercellular communication (I-YFP-GJIC) assay fulfills this need. It is a cell-based assay including acceptor and donor cells that are engineered to stably express a yellow fluorescent protein (YFP) variant, whose fluorescence is sensitively quenched by iodide, or SLC26A4, an iodide transporter, respectively. When iodide is added to a mixed culture of the two cell types, they enter the donor cells via the SLC26A4 transporter and diffuse to the adjacent acceptor cells via GJs where they quench the YFP fluorescence. YFP fluorescence is measured well by well in a kinetic mode. The YFP quenching rate reflects GJ activity. The assay is reliable and rapid enough to be used for HTS. The protocol for the I-YFP-GJIC assay using the LN215 cells, human glioma cells, is described.

Here, we present a protocol for a novel gap junction intercellular communication assay designed for the high-throughput screening of gap junction-modulating chemicals for drug discovery and toxicological assessment.

Ein Jodid-gelb fluoreszierende Protein-Gap Junction-interzelluläre Kommunikation Assay

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

Single Myofiber Culture Assay zur Beurteilung der Funktionalität adulter Muskelstammzellen ex vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous research indicated that multiple pathways could mediate the spontaneous death of neutrophils. A cocktail was developed by simultaneously targeting these pathways, caspases-lysosomal membrane permeabilization-oxidant-necroptosis inhibition plus granulocyte colony-stimulating factor (CLON-G), which prolonged the neutrophil lifespan to greater than 5 days without significantly compromising the neutrophil function. Concurrently, a reliable and stable protocol for assessing and evaluating neutrophil death was also developed. In this work, we show that CLON-G can prolong the neutrophil lifespan in vitro to more than 5 days, and we exhibit the lengthening of the neutrophil lifespan with FACS and confocal fluorescence microscopy. This report introduces procedures for the preparation of CLON-G and showcases an in vitro spontaneous death assay of neutrophils, which can be used for the study of neutrophils and for subsequently interrogating neutrophil death, thus providing a reliable resource for the neutrophil community.

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

This protocol details the preparation of CLON-G to extend the neutrophil lifespan to greater than 5 days and provides a reliable procedure for evaluating neutrophil death with flow cytometry and confocal fluorescence microscopy.

Verlängerung der Lebensdauer von Neutrophilen mit CLON-G und einem In-vitro-Spontantod-Assay

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous ...