Dieses Labor wurde von der kanadischen Institutes of Health Research, dem Natural Sciences and Engineering Research Council in Kanada, und die Multiple Sclerosis Society of Kanada (MSSC) unterstützt. GSTS war der Empfänger einer Doctoral Studentship aus dem MSSC. Wir danken Dr. Joan Boggs (Hospital for Sick Children, Toronto) für viele hilfreiche Diskussionen und Kommentare zu diesem Manuskript. Wir sind dankbar, dass Biotium für ihre großzügige Geschenk von zusätzlichen NucView 488 Caspase-3.

1. Auftauen und Kultivieren von Zellen <ol><li> Erhalten Lager von gefrorenem verewigt N19-Oligodendrozyten aus langfristigen flüssigem Stickstoff speichert. </li><li> Tauchen Fläschchen mit Zellen bei 37 ° C Wasserbad, bis die Zellsuspension vollständig aufgetaut. </li><li> 7 ml DMEM (Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium) mit High-Glucose mit 10% FBS (Fetal Bovine Serum) und 1% Penicillin / Streptomycin zu einer 10 cm Kulturschale ergänzt. </li><li> Fügen Sie die Zell-Suspension auf die Platte tropfenweise, und vorsichtig geschwenkt und Rock der Petrischale, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. </li><li> Kultur-Zellen bei 34 ° C / 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Nach 4 Stunden absaugen Medien aus Platten, um alle verbleibenden DMSO (Dimethylsulfoxid), das als Frostschutzmittel verwendet worden zu entfernen, und ersetzen Sie sie durch frische Medien (7 ml DMEM High-glucose Medien ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin) . </li></ol> 2. Die Passage Cells <ol><li> Bei 70-80%Zusammenfluss (4-7 Tage Wachstum), absaugen Medien von Zellen. </li><li> 1 ml 0,25% Trypsin-to-Plate. Pipette Trypsin zu lösen Zellen (ca. 5 Minuten). </li><li> Nehmen Sie die entsprechenden Verdünnungen für experimentellen Bedingungen und Passage eine zusätzliche 10 cm Teller für zukünftige Experimente mit einer Zelldichte nicht weniger als 0,1 x 10 6 Zellen / ml. </li></ol> Hinweis: Sie sollten Durchgang Ihre Zellen mindestens zweimal nach dem Auftauen, bevor Sie sie für Experimente. 3. Zählen und Plating Cells <ol><li> Um Platte Zellen für live-cell imaging, trypsinize wie zuvor beschrieben. </li><li> Entfernen Sie ca. 30 ul der Zellen und zählen mit einem Hämocytometer. </li><li> Legen Sie eine unbeschichtete Deckglas in einer 6-Well-Platte. Hinzufügen von Zellen, die auch bei einer Dichte von 0,1 x 10 6 Zellen / ml in 2 ml Phenol-freiem DMEM High-glucose Medien, mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin bei 34 ° C / 5% CO 2 ergänzt. </li><li> ErlaubenZellen wachsen über Nacht (16-20 h) bei 34 ° C / 5% CO 2 vor der Transfektion. </li></ol> 4. Transfektion <ol><li> Kombinieren Sie 100 ul Serum-freien Medien, 0,5-4 pg gereinigte Plasmid-DNA, und 4 ul FuGENE HD (Roche). Vortex vorsichtig mischen. </li><li> Vortex noch einmal kurz und lassen Sie die DNA zu komplex für 5 min bei Raumtemperatur, und fügen Sie dann FuGENE HD DNA-Gemisch direkt in den kultivierten Zellen. Kippen Sie die Platte vorsichtig mischen. </li><li> Kultur der Zellen für weitere 48 h bei 34 ° C / 5% CO 2 vor der Behandlung oder Experimentieren. </li></ol> 5. Vorbereitung Cells für Live-Cell Imaging (LCI) <ol><li> Schalten Sie die LCI Chamlide Live-cell Instrument Schaltkasten mindestens 1 h, bevor Sie zu Ihrem Experiment starten wollen. Der Schaltkasten regelt auch die Temperatur und Luftfeuchtigkeit innerhalb des LCI Chamlide und reguliert den Fluss des vorgemischten 5% CO 2. </li></ol> Hinweis: Es ist ratsam,Schalten Sie das Kontrollkästchen bis zu 3 h vor Beginn der Experimente, um sicherzustellen, dass die gesamte Stufe 34 ° C erreicht Dieser Schritt reduziert Schwerpunkt Drift, die durch fluxulation und die thermische Ausdehnung des Metalls der Bühne verursacht wird, wie es wärmt, während der Bildgebung. <ol start="2"><li> Die Arbeit in einem Flow-Haube, sprühen Chamlide magnetisch-Type Culture Kammer und Pinzette, mit 70% Ethanol und ihnen erlauben, für 5 Minuten trocknen lassen. </li><li> Entfernen Zellen aus Inkubator und bestätigen, dass sie gesund sind. Sie sollten erscheinen Anhänger und auf dem Deckglas mit zahlreichen Membranverfahren gut verteilt. Zellen, die aus der Transfektion betont werden, sind nicht geeignet für Experimente und eine reduzierte Anzahl von Prozess-Erweiterungen haben, und haben oft eine unregelmäßig geformte Kern. </li><li> Neigen Sie den 6-Well-Platte und entfernen Sie das Deckglas mit einer Pinzette. Raschen Platzierung der Deckglas-Zelle nach oben in die Bodenplatte der Kultur Kammer. Nicht in das Deckglas, um zu trocknen. </li><li> Befestigen Sie den Magnetstreifen wichtigstenKörper der Kultur Kammer und fügen 500 ul der Medien von der ursprünglichen 6-Well-Platte auf der Oberseite des Deckglases. Re-using dieses Medium verringert die Menge der Stress auf die Zellen, die durch Veränderungen der Umwelt verursacht gelegt, und kann auch nützlich sein für die Beurteilung der extrazellulären sekretierten Faktoren. </li><li> Setzen Sie die Glasabdeckung auf die Kultur Kammer. </li><li> Verwenden Sie ein Kimwipe mit 70% Ethanol besprüht, um restliche Material von der Unterseite des Deckglases zu entfernen, die sich mit Mikroskopie stören würde. </li><li> Legen Sie die Kultur Kammer in der 34 ° C / 5% CO 2-Inkubator für 30 min. Dieser Schritt stellt sicher, dass die Kammer selbst zu 34 ° C erwärmt zu reduzieren Verschiebung des Deckglases als das Metall erwärmt. </li></ol> 6. Mikroskop-Einstellungen Die Bilder wurden hier mit einem Leica DMIRE2 inversen Mikroskop mit einer benutzerdefinierten Relais-Linse und Emission Filterrad Gehäuse für Kartusche Laden von mehreren Rädern (Quorum Technologies Inc., G erworbenuelph, ON). <ol><li> Hellfeld - Lampe bis 2,5 V und Belichtungszeit auf 240 ms eingestellt. </li><li> Red Fluorescent Protein (RFP) - Verstärkung bei 140 für 200 ms eingestellt. </li><li> Green Fluorescent Protein (GFP) - Verstärkung bei 140 für 500 ms eingestellt. </li><li> Unser Mikroskop hat eine dimmbare Lampe anstatt einer rotierenden Scheibe, um die Menge an Licht zur Verfügung, um Zellen zu steuern. Wir führen unsere Experimente mit dem Licht bei 90% der maximalen Intensität Lampe. </li></ol> 7. Behandlung der Zellen mit Apoptose-Induktoren und NucView 488 Caspase-3 Substrat <ol><li> Es ist wichtig, um große Bestände von Apoptose induzieren im Voraus vorbereiten und einfrieren in Portionen, so dass die Konzentrationen werden sich im Einklang zwischen den Experimenten. </li><li> Die NucView 488 Substrat ist lichtempfindlich. Bereiten Aliquots von 15 ul auf Einfrieren / Auftauen, und speichern Röhrchen bei -20 ° C in Aluminiumfolie abgedeckt reduzieren. Die Arbeit mit der Umgebungsluft Raumbeleuchtung so gering wie möglich, um die Exposition der NucV reduziereniew 488 Substrat, Licht, vor dessen Verwendung. </li><li> Rufen Sie die Kultur Kammer schnell aus dem Inkubator, so dass die Zellen nicht zu einer Verringerung der Temperatur ausgesetzt sind. Legen Sie die Kultur Kammer auf die Klimakammer des Mikroskops, und verwenden Sie Klammern, um die Kultur Kammer nicht bewegen kann. An dieser Stelle sollten Sie auch dim die Raumbeleuchtung. </li><li> Schalten Sie die 5% vorgemischte CO 2-Tank mit zwei Regler. </li><li> Mit dem 10fach Objektiv, Fokus auf Zellen, die auf dem Computer-Monitor mit Hellfeld-Mikroskopie finden. Hinweis: Sie möchten, um die größte numerische Apertur des Objektivs mit der gewünschten Vergrößerung zu verwenden, um die Belichtungszeit zu reduzieren. </li><li> Deliver Induktoren der Apoptose der Zellen (in unserem Fall 80 mM Kalium oder 100 mM Glutamat), kann eine der folgenden Methoden verwendet werden. Wir werden Anlieferung von 80 mM Kalium als Beispiel nehmen, mit KCl als 10x-Konzentrat in unserem typischen Kulturmedien aufgelöst. <ol><li> Medien Austausch by langsam und lokale Perfusion: - Verwenden Sie eine Schlauchpumpe zum Austausch von Medien in der Kultur Kammer mit den neuen Medien mit 80 mM Kalium. - Ein Ende des Schlauches liefert 10 mL eines Bestandes von 80 mM Kalium in Phenol-freiem DMEM gelöst, und das andere Ende des Schlauchs wird Medien aus der Kammer entfernen. - Sie wollen mindestens einen 10-fach Austausch von Medien, um sicherzustellen, dass die Medien in die Kammer verließ die richtige Konzentration von Kalium hat. - Nach Medien ausgetauscht wird, fügen Sie 3 ul der NucView 488 Substrat für die Medien in der Kammer. Pipette zu mischen. </li><li> Direkte Zugabe von 80 mM K + und NucView 488 Substrat zu Medien in der Kultur Kammer: - Bereiten Sie eine 10x Stammlösung von 80 mM Kalium in Phenol-freiem DMEM aufgelöst. - Add 3 ul der NucView 488 Substrat 50 uL 10x 80 mM Kalium. Pipette zu mischen. In den 500 ul Phenol-freiem DMEM in Kultur Kammer. Hinweis: Diese Methode istbevorzugt, wenn Sie Interesse an der Aufrechterhaltung oder der Beurteilung Wachstum oder andere Faktoren, die abgesondert werden in der Original-Datenträger können, sind. Wir haben festgestellt, dass die NucView 488 Substrat stabil ist in der Zellkultur für Experimente dauerhaft bis zu 36 h. </li></ol></li></ol> 8. Live-Cell Imaging <ol><li> Klicken Sie auf den roten Kanal zu transfizierten Zellen anzuzeigen. </li><li> Wählen und speichern Sie etwa ein Dutzend Bilder, wo gibt es mehrere transfizierten Zellen, und speichern Sie diese &quot;XY-Punkte&quot;. Je nach der Menge des Arbeitsspeichers, können Sie die Anzahl der Bühne Punkte, die Sie in der Lage sein zu erwerben ist begrenzt. </li><li> Haben die Lupe nehmen Bilder (in Hellfeld-, Rot-Kanal und grünen Kanal) auf diese gespeicherten Etappe Punkte alle 6 Minuten. </li><li> Jede grüne Färbung, die sichtbar ist während der frühen Stadien der Experimente zeigt wahrscheinlich Zellen, die bereits Gegenstand Apoptose aufgrund der Regel der Transfektion und / oder Umweltbelastungen. Apoptosis aufgrund der experimentellen Behandlungen werden zu einem späteren Zeitpunkt in das Experiment nachgewiesen werden. </li></ol> 9. Statistische Analyse <ol><li> Für jedes Experiment, programmieren wir das Mikroskop, um mehrere XY-Punkte zu erwerben, um eine große Datenmenge effizient zu sammeln. Jedes Experiment ist in doppelter oder dreifacher Ausführung durchgeführt und die Daten werden aus verschiedenen Experimenten an verschiedenen Tagen durchgeführt zusammengestellt. Aus jedem Datensatz, analysieren wir bis zu 15 Felder anzeigen und vergleichen das Verhältnis von Caspase-negative Zellen Caspase-positive Zellen (Gesamtzahl der Zellen im Sichtfeld / Gesamtzahl der Caspase-positive Zellen). </li><li> Die aufgezeichneten Messwerte von jedem Datensatz werden in einem größeren Sample-Set zusammengefasst und sind dann miteinander über eine ANOVA-Tabelle (p = 0,05). Wir zeigen die Standardfehler des Mittelwerts (SEM) von jedem Versuch, und vergleichen Sie die Differenz der Mittelwerte durch Ausführen eines Tukey bedeutet Vergleichstest (p = 0,05), um festzustellen, which Behandlungen unterscheiden sich deutlich voneinander. </li></ol> 10. Repräsentative Ergebnisse Wir haben ein Experiment zu zeigen, wie die NucView 488 Substrat kann eine erhöhte Rate von Apoptose von N19-OLG-Zellkulturen nach einer Behandlung mit einer hohen extrazellulären Kaliumkonzentration zeigen beschrieben. Die N19-Zellen wurden mit RFP transfiziert und wurden entweder mit 3 ul NucView 488 Substrat (Kontrolle) oder 3 ul NucView 488 Substrat und 80 mM behandelt [K +] (Behandlung). Die Zellen wurden überwacht und die Bilder wurden über einen 12-Stunden-Kurs, der ausreichend für Studien mit neurologischen Beleidigungen (Abbildung 1A) erworben wird. In Kontrollbedingungen, haben wir nicht beobachten, erhebliche Mengen von Apoptose im Vergleich zu den 80 mM [K +] behandelten Kulturen (Hash-Kasten), die ca. 45% Zelltod nach 12 h (Abbildung 1B) zeigte. Der Hintergrund grünes Signal zu beobachtend in der Kontrollgruppe Bedingungen zeigt die Zellen, die Apoptose sind ohne die Zugabe von extrazellulärem Kalium. Praktisch keine der Zellen in der Kontrollgruppe Experiment weisen Apoptose durch den 12 h Zeitpunkt, obwohl in anderen Situationen die Experimente erforderlich sein, um mehr ausgeführt werden. Die Bilder wurden mit einem 10x-Objektiv. Bar = 100 um. <img alt="Abbildung 1a" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg" /> <img alt="Abbildung 1b" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1b.jpg" /> Abbildung 1. (A) A 12 h Zeitverlauf Experiment N19 OLG Kulturen 48 h nach der Transfektion Ausdruck RFP-MBP (roter Kanal) zusammen mit 3 ul der NucView 488 Substrat (grüner Kanal). Die Kulturen wurden entweder mit einer Endkonzentration von 80 mM behandelt [K +] (linkes Bild) oder keine Behandlung als Kontrolle (rechte Bilder). Die Bilder wurden bei 6 min Intervallen erfasst und deutliche Aktivierung von Caspase gespalten-3 (grün) kann beobachten,d in Kulturen mit 80 mM behandelt [K +] innerhalb der Zellkerne (Hash-Box) im Vergleich zur Kontrollgruppe zu experimentieren. (B) Anteil der gespaltenen Caspase-3-Zellen (berechnet durch Division der Gesamtzahl der Zellen in das Blickfeld von die Gesamtzahl der Caspase-positive Zellen). Im Vergleich zu Bedingungen zu kontrollieren, beobachten wir rund 45% Zelltod nach K +-Behandlung um 12 h. SVideo 1. A 12 h Zeitverlauf Experiment N19-OLG Kulturen 48 h nach der Transfektion Ausdruck RFP-MBP (roter Kanal) mit 3 ul der NucView 488 Substrat (grüner Kanal), zusammen mit Hellfeld-Bilder und ein Drei-Wege- zusammengefügte Bild, nach Behandlung mit 80 mM [K +]. SVideo 2. A 12 h Zeitverlauf Experiment N19-OLG Kulturen 48 h nach der Transfektion Ausdruck RFP-MBP (roter Kanal) mit 3 ul der NucView 488 Substrat (grüner Kanal), zusammen mit Hellfeld-images und ein Drei-Wege-zusammengefügte Bild. Keine Behandlung war es, die Kulturen angelegt und N19-OLGs sehen die Migration durch das Mikroskop Bereich im Gegensatz zu Zellkulturen, die mit 80 mM behandelt werden [K +] (mit S-Video 1 zu vergleichen).

<ol>
	<li>Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C. N., Radu, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+caspase+activation+for+high-content+screening.">Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening.</a> J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).</li><li>Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R. J., Firestone, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEVD-NucView488:+a+novel+class+of+enzyme+substrates+for+real-time+detection+of+caspase-3+activity+in+live+cells.">DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells.</a> FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).</li><li>de Calignon, A., Fox, L. M., Pitstick, R., Carlson, G. A., Bacskai, B. J., Spires-Jones, T. L., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+precedes+and+leads+to+tangles.">Caspase activation precedes and leads to tangles.</a> Nature. 464, 1201-1204 (2010).</li><li>Eldadah, B. A., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+pathways,+neuronal+apoptosis,+and+CNS+injury.">Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury.</a> J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).</li><li>Foster, L. M., Phan, T., Verity, A. N., Bredesen, D., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+analysis+of+normal+and+shiverer+temperature-sensitive+immortalized+cell+lines+exhibiting+phenotypic+characteristics+of+oligodendrocytes+at+several+stages+of+differentiation.">Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation.</a> Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).</li><li>Fulton, D., Paez, P. M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C. S., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+L-type+Ca(++)+currents+and+process+morphology+in+white+matter+oligodendrocyte+precursor+cells+by+golli-myelin+proteins.">Regulation of L-type Ca(++) currents and process morphology in white matter oligodendrocyte precursor cells by golli-myelin proteins.</a> Glia. 58, 1292-1303 (2010).</li><li>Hisahara, S., Okano, H., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-mediated+oligodendrocyte+cell+death+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+demyelination.">Caspase-mediated oligodendrocyte cell death in the pathogenesis of autoimmune demyelination.</a> Neurosci. Res. 46, 387-397 (2003).</li><li>Lau, A., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptors,+neurotoxicity+and+neurodegeneration.">Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration.</a> Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).</li><li>Lawrence, M. S., Ho, D. Y., Sun, G. H., Steinberg, G. K., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Bcl-2+with+herpes+simplex+virus+vectors+protects+CNS+neurons+against+neurological+insults+in+vitro+and+in+vivo.">Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo.</a> J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).</li><li>Paez, P. M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J. M., Campagnoni, C., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+golli+myelin+basic+proteins+enhances+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells.">Increased expression of golli myelin basic proteins enhances calcium influx into oligodendroglial cells.</a> J. Neurosci. 27, 12690-12699 (2007).</li><li>Sanchez Mejia, R. O., Friedlander, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+in+Huntington's+disease.">Caspases in Huntington's disease.</a> Neuroscientist. 7, 480-489 (2001).</li><li>Smith, G. S. T., De Avila, M., Paez, P., Spreuer, V., Wills, M. K. B., Jones, N., Boggs, J. M., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+substitutions+and+threonine+pseudo-phosphorylation+of+the+SH3-ligand+of+18.5+kDa+myelin+basic+protein+decrease+affinity+for+the+Fyn-SH3-domain+and+alter+process+development+and+protein+localization+in+oligodendrocytes.">Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes.</a> J. Neurosci. Res. , (2011).</li><li>Smith, G. S. T., Paez, P. M., Spreuer, V., Campagnoni, C. W., Boggs, J. M., Campagnoni, A. T., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+18.5-and+21.5-kDa+isoforms+of+myelin+basic+protein+inhibit+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells,+in+contrast+to+golli+isoforms.">Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms.</a> J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).</li><li>Springer, J. E., Azbill, R. D., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+caspase-3+apoptotic+cascade+in+traumatic+spinal+cord+injury.">Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury.</a> Nat. Med. 5, 943-946 (1999).</li><li>Verity, A. N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V. W., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+myelin+protein+genes+and+other+myelin+components+in+an+oligodendrocytic+cell+line+conditionally+immortalized+with+a+temperature-sensitive+retrovirus.">Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus.</a> J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).</li><li>Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+critical+role+of+potassium+homeostasis+in+apoptosis.">Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis.</a> Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Obwohl dies nicht die einzige fluorogenen Produkt für die Apoptose-Erkennung gibt es mehrere signifikante Vorteile bei der Verwendung der NucView 488 Substrat. Einer der wichtigsten Vorteile ist die Fähigkeit, Apoptose in lebenden Zellen in Echtzeit zu verfolgen, während die meisten alternativen Produkten entweder Zelllyse benötigen oder haben schlechte Zellpermeabilität. Weitere Vorteile sind die hohe Empfindlichkeit für Caspase-3-Erkennung, hohe Zellpermeabilität, geringe Zytotoxizität und keine Interferenzen mit dem Fortschreiten der Apoptose. Der Untergrund hat auch geringe Hintergrundfluoreszenz, bis es gespalten und gelangt in den Zellkern, die Hintergrund-Fluoreszenz eliminiert. Die Caspase-3-Erkennungssequenz enthält 3 negative Ladungen und der DNA-bindenden Farbstoff hat eine positive Ladung 2. Die DEVD-NucView 488-Molekül hat also eine negative Ladung, welche die Aktivierung und Bindung des Farbstoffs verhindert, um DNA in Zellen, in denen Caspase ist nicht aktiv. Maintaining Konsistenz zwischen den Experimenten ist erforderlich, um der Lage sein, sinnvolle Vergleiche zwischen den Wiederholungen zu ziehen. Einer der wichtigsten Parameter zu halten konsistent ist Zelldichte, als es die Rate der Transfektion beeinflusst. Die Realisierung hoher Transfektionsraten in verewigt N19-OLG Zellkulturen ist schwieriger als mit anderen gängigen Zelllinien wie HeLa-oder HEK293, und ist stark abhängig von Dichte, in unserer Erfahrung 12, 13. Unsere beste Transfektionseffizienz für diese Zellen mit Fugene HD (Roche) wurden erhalten und sind in der Regel etwa 15%, kann aber über 30% zu erreichen, je nach zu bauen. Sorgfältige Zellzählung wird in eine kohärente Transfektionsraten Hilfe. Es ist auch wichtig, um Zellen aus verschiedenen Behandlungen, um das gleiche Maß an Umwelt-Stress aussetzen, insbesondere bei der Messung Raten von Apoptose. Insbesondere sind die Länge der Zeit, über die die Zellen Transfektionsreagenzien, oder die Höhe der Belichtung ausgesetzt sind, wichtige ökologische VariablenAbles zu prüfen, und sollte konstant bleiben über Experimente. Für unsere Anwendungen haben wir festgestellt, dass die Sammlung einer großen Anzahl von Feldern-of-view bietet eine ausreichend große Stichprobe, um statistisch signifikante Vergleiche make [ebd.].

Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte <table border="1"><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> NucView 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells </td><td> Biotium </td><td> 30029 </td></tr><tr><td> FuGENE HD Transfektionsreagenz </td><td> Roche </td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td> Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium </td><td> Gibco </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> 0,25% Trypsin </td><td> Gibco </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Gibco </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> # 1,5-25 mm Deckglas </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0715 </td></tr><tr><td> Chamlide CMB magnetische Kultur Kammer für 25 mm Deckglas </td&gt; <td> Quorum Technologies </td><td> CM-B-40 </td></tr><tr><td> Cellstart Gewebekultur 10 cm Teller </td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> BD Falcon 6-Well-Platten </td><td> VWR </td><td> CA62406-161 </td></tr></table>

monitoring cleaved caspase-3 activity and apoptosis of immortalized oligodendroglial cells using live-cell imaging and cleaveable fluorogenic-dye substrates following potassium-induced membrane depolarization

Das zentrale Nervensystem erleben können eine Reihe von Belastungen und neurologischen Beleidigungen, die zahlreiche negative Auswirkungen, die letztendlich zu einer Verringerung der neuronalen Population und Funktion führen haben kann. Verletzte Axone Freisetzung erregenden Moleküle wie Kalium-oder Glutamat in die extrazelluläre Matrix, die wiederum weitere Beleidigung und Verletzung der Unterstützung Gliazellen einschließlich Astrozyten und Oligodendrozyten 8, 16 produzieren kann. Wenn die Beleidigung besteht, werden die Zellen durchlaufen den programmierten Zelltod (Apoptose), die geregelt und wird durch eine Reihe von etablierten Signaltransduktionskaskaden 14 aktiviert. Apoptose und Nekrose Gewebe kann nach Schädel-Hirn-Verletzungen, zerebrale Ischämie und Krampfanfälle auftreten. Ein klassisches Beispiel für apoptotische Regulation ist die Familie der Cystein-abhängige Aspartat-Proteasen gerichtet, oder Caspasen. Aktivierte Proteasen einschließlich Caspasen wurden auch in den Zelltod als Reaktion auf chronische neuro verwickeltdegenerative Krankheiten wie Alzheimer, Huntington und Multiple-Sklerose-4, 14, 3, 11, 7. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung des NucView 488 Caspase-3-Substrat, um die Rate der Caspase-3-vermittelte Apoptose in verewigt N19-Oligodendrozyten (OLG) Zellkulturen 15, 5 zu messen, nach Exposition mit verschiedenen extrazellulären Belastungen wie hohe Konzentrationen von Kalium-oder Glutamat. Das bedingt, verewigt N19-OLG-Zelllinie (als Vertreter der O2A Vorläuferzellen) wurde von Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5 erhalten und wurde bereits verwendet, um molekulare Mechanismen der Myelin-Genexpression und Signaltransduktion führenden Studie zu OLG Differenzierung (z. B. 6, 10). Wir haben diese Zelllinie gefunden werden im Hinblick auf die Transfektion mit exogenen Myelin basisches Protein (MBP) robust konstruiert fusioniert entweder RFP oder GFP (rot oder grün fluoreszierendes Protein) 13,12. Hier wurden die N19-OLG Zellkulturen entweder mit 80 mM Kaliumchlorid oder 100 mM Natrium-Glutamat zu axonalen Leckage in der extrazellulären Matrix zu imitieren, um Apoptose zu induzieren 9 behandelt. Wir verwendeten eine bi-funktionale Caspase-3-Substrat mit einer DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) Caspase-3 Anerkennung Untereinheit und einer DNA-bindenden Farbstoff 2. Der Untergrund schnell geht das Zytoplasma, wo sie von intrazellulären Caspase-3 gespalten wird. Der Farbstoff, NucView 488 ist freigegeben und gelangt in den Zellkern, wo sie DNA und fluoresziert grün bindet bei 488 nm, Apoptose zu signalisieren. Die Nutzung der NucView 488 Caspase-3-Substrat ermöglicht live-cell imaging in real-time 1, 10. In diesem Video beschreiben wir auch die Kultivierung und Transfektion von immortalisierten N19-OLG-Zellen, sowie Live-Cell-Imaging-Techniken.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates F

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-Cell-Imaging von Caspase-3-vermittelte Apoptose in verewigt N19-Oligodendrozyten-Zellkulturen unter Verwendung des<em&gt; NucView</em&gt; 488 Caspase-3-Substrat. Diese Technik ist für den programmierten Zelltod-Assays in Echtzeit in einer Vielzahl von Zelltypen und Geweben.

Überwachung Cleaved Caspase-3 Aktivität und Apoptose von Immortalized Oligodendrozyten mit Live-cell Imaging und Cleaveable Fluorogenic-Farbstoff-Substrate Nach Kalium-induzierten Membrandepolarisation

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

monitoring-cleaved-caspase-3-activity-apoptosis-immortalized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

15.8K Aufrufe.  University of Guelph. Live-Cell-Imaging von Caspase-3-vermittelte Apoptose in verewigt N19-Oligodendrozyten-Zellkulturen unter Verwendung des NucView 488 Caspase-3-Substrat. Diese Technik ist für den programmierten Zelltod-Assays in Echtzeit in einer Vielzahl von Zelltypen und Geweben.

Serie: Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Forschung

Neurowissenschaften

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still unclear. Our laboratory has developed a rat model of post-MI syndrome that displays impaired cardiac functions, neuronal loss in the limbic system, cognitive deficits and behavioral signs of depression. At the neuronal level, caspase-3 activation mediates post-MI apoptosis in different limbic regions, such as the amygdala &#8211; peaking at 3 days post-MI. Cognitive and behavioral impairments appear 2-3 weeks post-MI and these correlate statistically with measures of caspase-3 activity. The protocol described here is used to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity using spectrofluorometry. To induce MI, the descending coronary artery is occluded for 40 min. The protocol for evaluation of caspase-3 activation starts 3 days after MI: the rats are sacrificed and the amygdala isolated rapidly from the brain. Samples are quickly frozen in liquid nitrogen and kept at -80 &#176;C until actual analysis. The technique performed to assess caspase-3 activation is based on cleavage of a substrate (DEVD-AMC) by caspase-3, which releases a fluorogenic compound that can be measured by spectrofluorometry. The methodology is quantitative and reproducible but the equipment required is expensive and the procedure for quantifying the samples is time-consuming. This technique can be applied to other tissues, such as the heart and kidneys. DEVD-AMC can be replaced by other substrates to measure the activity of other caspases.

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Caspase-3-Aktivität in der Ratte Amygdala spektrofluorometrisch Gemessen nach Myokardinfarkt

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

Leben-Zelle Messung der Geruchsstoff Rezeptor Aktivierung mit einem Echtzeit-cAMP-Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

Analyse der neuronalen Aktivität und Konnektivität mit intrakraniellen EEG-Daten mit SPM-Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

ROS Live Cell Imaging während der neuronalen Entwicklung

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many neurodegenerative diseases. Given some axons' elaborate architecture and extreme length, it is not surprising that mitochondria in axons can experience different environments compared to their cell body counterparts. Interestingly, dysfunction of axonal mitochondria often precedes effects on the cell body. To model axonal mitochondrial dysfunction in vitro, microfluidic devices allow treatment of axonal mitochondria without affecting the somal mitochondria. The fluidic pressure gradient in these chambers prevents diffusion of molecules against the gradient, thus allowing for analysis of mitochondrial properties in response to local pharmacological challenges within axons. The current protocol describes the seeding of dissociated hippocampal neurons in microfluidic devices, staining with a membrane-potential sensitive dye, treatment with a mitochondrial toxin, and the subsequent microscopic analysis. This versatile method to study axonal biology can be applied to many pharmacological perturbations and imaging readouts, and is suitable for several neuronal subtypes.

The present protocol describes the seeding and staining of neuronal mitochondria in microfluidic chambers. The fluidic pressure gradient in these chambers allows for the selective treatment of mitochondria in axons to analyze their properties in response to pharmacological challenges without affecting the cell body compartment.

Mikrofluidik-unterstützte selektive Depolarisation axonaler Mitochondrien

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

Humane Mikroglia-ähnliche Zellen: Differenzierung aus induzierten pluripotenten Stammzellen und In-vitro-Lebendzell-Phagozytose-Assay mit humanen Synaptosomen

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

Enthüllung der mitochondrialen Ultrastruktur in Neuronen mit STED-Mikroskopie

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of reactive oxygen species (ROS). These mitochondria-mediated processes take on specialized roles in neurons, coordinating aerobic metabolism to meet the high energy demands of these cells, modulating Ca2+ signaling, providing lipids for axon growth and regeneration, and tuning ROS production for neuronal development and function. Mitochondrial dysfunction is therefore a central driver in neurodegenerative diseases. Mitochondrial structure and function are inextricably linked. The morphologically complex inner membrane with structural infolds called cristae harbors many molecular systems that perform the signature processes of the mitochondrion. The architectural features of the inner membrane are ultrastructural and therefore, too small to be visualized by traditional diffraction-limited resolved microscopy. Thus, most insights on mitochondrial ultrastructure have come from electron microscopy on fixed samples. However, emerging technologies in super-resolution fluorescence microscopy now provide resolution down to tens of nanometers, allowing visualization of ultrastructural features in live cells. Super-resolution imaging therefore offers an unprecedented ability to directly image fine details of mitochondrial structure, nanoscale protein distributions, and cristae dynamics, providing fundamental new insights that link mitochondria to human health and disease. This protocol presents the use of stimulated emission depletion (STED) super-resolution microscopy to visualize the mitochondrial ultrastructure of live human neuroblastoma cells and primary rat neurons. This procedure is organized into five sections: (1) growth and differentiation of the SH-SY5Y cell line, (2) isolation, plating, and growth of primary rat hippocampal neurons, (3) procedures for staining cells for live STED imaging, (4) procedures for live cell STED experiments using a STED microscope&#160;for reference, and (5) guidance for segmentation and image processing using examples to measure and quantify morphological features of the inner membrane.

Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der mitochondrialen Alterung 

This protocol presents a workflow for the propagation, differentiation, and staining of cultured SH-SY5Y cells and primary rat hippocampal neurons for mitochondrial ultrastructure visualization and analysis using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

Verwendung von Lebendzell-STED-Bildgebung zur Visualisierung der mitochondrialen Innenmembran-Ultrastruktur in neuronalen Zellmodellen

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...