Das funktionierte wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Health und Medical Research Council (GNT1125033 und GNT1140187) und Australian Research Council (DP170103790), I.K.H.P.

1. Induktion der Apoptose
<ol><li>Zentrifuge Zellprobe bei 300 X g für 5 min und verwerfen überstand, alle bereits bestehenden Zelle Ablagerungen zu entfernen. Hinweis: Bei der Verwendung von adhärenten Zellen Zellen im Voraus Samen und Waschen mit 1 x Phosphat-gepufferte Lösung (PBS) vor der Apoptose-Induktion.</li>
	<li>Bestimmen Sie Anzahl von Zellen und sammeln Sie Zellen zu. Hinweis: Je nach Test Post-Isolierung empfehlen wir eine Zelle Anfangszahl von mindestens 1 x 107 Zellen.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie in komplette Medien (jeweils 10 % (Vol/Vol) fetalen Kälberserum, 50 IU/mL Penicillin, 50 µg/mL Streptomycin Mischung-haltigem Medium) für eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/mL.</li>
	<li>Aliquoten ~ 2 x 106 Zellen pro Bohrloch eine 6-well-Platte.</li>
	<li>Um Apoptose induzieren, die Platte Deckel abnehmen und Zellen bei 150 mJ/cm2 mit einem UV-Strahler zu bestrahlen. Dies dauert ca. 30-60 s. Hinweis: Vor der Bestrahlung, sicherzustellen Sie, dass ~0.5 X 106 Zellen für die "Unbehandelt" zellkontrolle aufbewahrt werden. Hinweis: Apoptose kann auch über andere Methoden wie Anti-Fas oder Serum Hunger6induziert werden.</li>
	<li>Inkubation bei 37° C, 5 % CO2 für 2 bis 8 Stunden, abhängig von der Zell-Linie.</li>
	<li>Mit einem Bench Top Lichtmikroskop, visualisieren Sie Zellen, um das Vorhandensein des apoptotischen Morphologien, z. B. Blebbing Apoptopodia Bildung und ApoBD Bildung zu bestätigen. Hinweis: 40 X Vergrößerung ist ausreichend</li>
	<li>Mit einer Pipette P1000, pipette und Apoptotic Proben sammeln.</li>
	<li>Waschen Sie die Platte mit 1 X PBS und kombinieren Sie mit restlichen Probe um maximalen Ertrag zu gewährleisten.</li>
	<li>Sammle ~1/10th für die "gesamte Apoptotic Probe" (WAS) steuern.</li>
	<li>Die "Unbehandelte" Probe zu sammeln.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die WS und unbehandelt Proben bei 3.000 x g für 6 min.</li>
	<li>In 1 mL 1 X PBS aufschwemmen und beiseite auf Eis.</li>
	<li>ApoBD Isolierung weiterhin entweder Schritt 2 oder 3 mit der restlichen Apoptotic Probe.</li>
</ol>2. ApoBD Isolation über FACS
<ol><li>Zentrifugieren Sie die gesamte Probe bei 3.000 x g für 6 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den Großteil der Überstand ohne Unterbrechung das Pellet.</li>
	<li>In einer Färbelösung enthält 1 mL 1 x A5 Bindung Puffer, 75 µL A5-FITC und 2 µL des TO-PRO-3 pro 1 x 107 Zellen aufzuwirbeln.</li>
	<li>Inkubieren Sie Probe im Dunkeln bei Raumtemperatur für 10 min.</li>
	<li>Fügen Sie 1-2 mL 1 x A5 Bindung Puffer und Zentrifugieren Sie Probe bei 3.000 x g für 6 min um überschüssige Fleck zu entfernen. Hinweis: Für gemischte Zellpopulationen oder Gewebeproben, führen Sie einen Antikörper Färbung Schritt mit einer Kombination aus Zelle Typ-spezifische Marker in 1 x A5 Bindung Puffer und inkubieren Sie auf Eis für 20 min (oder entsprechend des Herstellers Protokoll) vor Zentrifugation bei 3.000 x g für 6 Min.</li>
	<li>Aufschwemmen Probe Pellet in 3 mL FACS-Puffer (1 X PBS, 1 x A5 Bindung Puffer, 10 % FSC, 2 mM EDTA) pro 1 x 107 Zellen.</li>
	<li>In einem Rundboden, Polypropylen (Durchflusszytometrie) Rohr durch ein 70 µm Zelle Sieb Filtern und Proben auf Eis und im Dunkeln halten.</li>
	<li>FACS Maschine schalten Sie ein und durchführen Sie Standardsatz mit einer Düse 100 µm, führen Sie die Drop-Verzögerung und gewährleisten Sie einen stabilen Strom.</li>
	<li>Laden Sie die Probe und Geschwindigkeit auf ~ 1000 Ereignisse/s festgelegt.</li>
	<li>Einstellen Sie FSC, SSC, APC (TO-PRO-3) und FITC (A5) Spannungen und positionieren Sie Ereignisse innerhalb der FACS Plots, um sicherzustellen, dass Populationen klar getrennt werden können.</li>
	<li>20.000 Ereignisse aufzeichnen.</li>
	<li>Richten Sie eine gating Strategie wie in Teil 4.</li>
	<li>Fügen Sie in der Art-Layout das letzte ApoBD Tor als die gewünschte Sortierung Bevölkerung hinzu.</li>
	<li>Beginnen Sie Erwerb der Probenmaterials und führen Sie eine Test-Art durch das Sammeln von 5.000-10.000 ApoBDs in einen neuen Schlauch, ~ 250 µL FACS Puffer enthält.</li>
	<li>Führen Sie ein System wieder bündig und laden Sie sortierte ApoBDs zu.</li>
	<li>Erwerben Sie und notieren Sie Test-Art ApoBDs.</li>
	<li>Überprüfen Sie, ob die ApoBD Reinheit ~ 99 % ist durch Vergleich FSC (y-Achse) Vs A5 (x-Achse Veranstaltungen). Hinweis: A5 Färbung kann leicht reduzieren bei der Analyse der Proben durch Laser-bleaching wieder.</li>
	<li>Hoher Reinheit erreicht, Originalmuster zu laden und weiter sortieren, bis die gewünschte Anzahl an ApoBDs gewonnen wurde. Hinweis: Falls erforderlich, kann doppelte Sortierung durchgeführt werden um ApoCells und ApoBDs gleichzeitig zu isolieren. Hinweis: Beim Sortieren über einen langen Zeitraum hinweg empfehlen wir dem Sammelrohr bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Sobald die Sortierung abgeschlossen ist, sammeln Sie einen kleinen Teil des Post-Art ApoBDs, Post-sortieren Sie ApoCells, unbehandelt und WAS Apoptose zu überprüfen und bestätigen nach Art Reinheit. Hinweis: Obwohl die Test-Sortierung und Post-Art Reinheit nicht erheblich abweichen sollte, basiert diese auf die Stream-Einstellungen und Stabilität.</li>
</ol>3. ApoBD Isolation über Differentielle Zentrifugation
<ol><li>Zentrifugieren Sie die restlichen Apoptotic Probe bei 300 X g für 10 min.</li>
	<li>Erfassen des Überstands, ~ 500 µL um nicht zu stören das Pellet Zelle zu verlassen und in ein neues 15 mL konische Röhrchen hinzufügen.</li>
	<li>Entfernen Sie die restlichen 500 µL und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL 1 X PBS (Dies entspricht die ApoCell angereicherte Fraktion.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die gesammelten überstand für 20 min bei 3.000 g.</li>
	<li>Überprüfen Sie, ob ein Pellet und entfernen Sie vorsichtig den überstand (Überstand kann kleine extrazelluläre Vesikel einschließlich Microvesicles und exosomen enthalten).</li>
	<li>Aufschwemmen Sie das Pellet in 1 mL 1 X PBS (Dies entspricht den 'ApoBD-angereichert' Bruch)</li>
	<li>Sammeln Sie 100 µL der einzelnen lebensfähig, WS, ApoCell bereichert, und ApoBD angereicherte Proben in einer neuen Rundboden, Polystyrol (Durchflusszytometrie) Rohr.</li>
	<li>Hinzufügen von 100 µL der Fleck mit 2 x A5-Bindung Puffer, 1: 100 A5-FITC und 1:1,000 TO-PRO-3</li>
	<li>Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min in der Dunkelheit.</li>
	<li>Analysieren Sie Proben von Durchflusszytometrie, mit der gating-Strategie wie oben beschrieben, um die erfolgreiche Induktion der Apoptose und Reinheit der ApoBD angereicherte Fraktion zu validieren.</li>
</ol>4. die Durchflusszytometrie Anspritzung Strategie
<ol><li>Plot-TO-PRO-3 (y-Achse) gegen FSC (x-Achse), nekrotische Zellen (TO-PRO-3hoch) von allen anderen nicht-permeabilized Veranstaltungen (TO-PRO-3Low/Mittelstufe) zu trennen.</li>
	<li>Wählen Sie alle nicht-permeabilized Ereignisse und plot-SSC gegen A5. Tor, zwei Populationen einschließlich Bevölkerung 1 (P1), SSCmittleren/hohen,niedrigen/mittleren Zellen A5 und 2 (P2), alle anderen Ereignisse.</li>
	<li>P2 plot TO-PRO-3 gegen A5 und wählen Sie A5mittleren/hohen Veranstaltungen alle zellenrückstand auszuschließen.</li>
	<li>Wählen Sie alle A5 positive Ereignisse und Plotten Sie FSC gegen A5. ApoCells (FSCMittelstufe/hohe) ApoBDs (FSCniedrig) trennen. Hinweis: Bei ApoBDs für ApoBD Isolierung über der FACS basierenden Ansatz gating, empfehlen wir einen endgültigen Schritt durch ApoBDs und TO-PRO-3 bis A5 vergleichen und auswählen alle Ereignisse. Dies sorgt dafür, dass die endgültige sortierschleuse Fluoreszenz anstelle von FSC/SSC-Parameter verwendet.</li>
	<li>Wählen Sie P1 für tragfähige Zellanalyse und führen Sie einen der beiden gating Strategien. Plotten Sie für allgemeine tragfähige Zellanalyse FSC gegen A5 und markieren Sie alle FSCmittleren/hohen Zellen, daher entfernen verbleibenden zellenrückstand. Alternativ für eingehende Analyse, lebensfähige Zellen trennbar von A5– frühen ApoCells von TO-PRO-3 gegen FSC Plotten. Wählen Sie TO-PRO-3niedrige, FSCmittleren/hohen lebensfähige Zellen und TO-PRO-3intermediate, FSCmittleren/hohen A5– frühe ApoCells.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+clearance:+basic+biology+and+therapeutic+potential.">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).</li><li>Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+the+Dying:+Mechanisms+and+Functions.">Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions.</a> Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).</li><li>Tixeira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+morphologic+features+and+products+of+cell+disassembly+during+apoptosis.">Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis.</a> Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).</li><li>Sebbagh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-3-mediated+cleavage+of+ROCK+I+induces+MLC+phosphorylation+and+apoptotic+membrane+blebbing.">Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing.</a> Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).</li><li>Coleman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+blebbing+during+apoptosis+results+from+caspase-mediated+activation+of+ROCK+I.">Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I.</a> Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).</li><li>Atkin-Smith, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+generating+extracellular+vesicles+during+apoptosis+via+a+beads-on-a-string+membrane+structure.">A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure.</a> Nature Communications. 6, 7439 (2015).</li><li>Poon, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+link+between+an+antibiotic,+pannexin+channels+and+apoptosis.">Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis.</a> Nature. 507, 329-334 (2014).</li><li>Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+microtubules+in+apoptotic+chromatin+dynamics+and+cellular+fragmentation.">A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation.</a> Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).</li><li>Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+a+basic+biological+phenomenon+with+wide-ranging+implications+in+tissue+kinetics.">Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.</a> British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).</li><li>Witasp, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridge+over+troubled+water:+milk+fat+globule+epidermal+growth+factor+8+promotes+human+monocyte-derived+macrophage+clearance+of+non-blebbing+phosphatidylserine-positive+target+cells.">Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells.</a> Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).</li><li>Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+kinase+regulates+fragmentation+and+phagocytosis+of+apoptotic+cells.">Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells.</a> Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).</li><li>Holmgren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+transfer+of+DNA+by+the+uptake+of+apoptotic+bodies.">Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies.</a> Blood. 93, 3956-3963 (1999).</li><li>Zernecke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+microRNA-126+by+apoptotic+bodies+induces+CXCL12-dependent+vascular+protection.">Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection.</a> Science Signaling. 2, ra81 (2009).</li><li>Schiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantigens+are+translocated+into+small+apoptotic+bodies+during+early+stages+of+apoptosis.">Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis.</a> Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).</li><li>Elamin, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+inhibits+the+Sonic+Hedgehog+signaling+pathway+and+triggers+apoptosis+in+medulloblastoma+cells.">Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells.</a> Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).</li><li>Sagulenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIM2+and+NLRP3+inflammasomes+activate+both+apoptotic+and+pyroptotic+death+pathways+via+ASC.">AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).</li><li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+RNA+profiles+in+subpopulations+of+extracellular+vesicles:+apoptotic+bodies,+microvesicles+and+exosomes.">Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Turiak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+thymocyte-derived+microvesicles+and+apoptotic+bodies+in+BALB/c+mice.">Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice.</a> Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+progression+of+cell+death+and+the+disassembly+of+dying+cells+by+flow+cytometry.">Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry.</a> Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).</li><li>Berda-Haddad, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation+of+endothelial+cell-derived+apoptotic+bodies+is+mediated+by+interleukin-1alpha.">Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).</li><li>Lleo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomics:+identification+of+unique+protein+profiles+of+apoptotic+bodies+from+biliary+epithelial+cells.">Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells.</a> Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).</li><li>Atkin-Smith, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cell+type-specific+apoptotic+bodies+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting.</a> Scientific Reports. 7, 39846 (2017).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+contents+and+cell+origins+of+apoptotic+bodies+by+flow+cytometry.">Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7, 14444 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Seit seiner frühen Beschreibung in den 1950er Jahren avancierte das Feld der Apoptose deutlich, immer ein prominenter Forschungsgebiet. Trotz der breiten Interesse und umfangreiche Bemühungen sind bestimmte Aspekte der Apoptose, insbesondere die Bildung von ApoBDs, aufgrund des Fehlens geeigneter Methoden nicht gut untersucht worden. Dazu gehören vor allem die Einschränkung bei der Verfolgung von Apoptose Progression und ApoBD Bildung gleichzeitig mit der traditionellen Durchflusszytometrie A5/PI-Analyse und die Veru...

Apoptose, eine gut untersuchte Form des programmierten Zelltods, ist erforderlich, um die physiologischen Homöostase aufrechtzuerhalten und potenziell schädliche Zellen im menschlichen Körper1zu entfernen. Nach der Induktion der Apoptose können apoptotische Zellen (ApoCells) durchlaufen eine Reihe von morphologischen Veränderungen und Zerlegen in kleinen Membrane-springen Vesikel bezeichnet ApoBDs. Insgesamt ist dieser Prozess ist bekannt als apoptotische Zelle Demontage und kann in 3 verschiedene Schritte anhand der Morphologie2,3geteilt werden. Schritt 1 (Plasmamembran Blebbing) zeichnet sich durch die Bildung von Ballon-ähnliche Strukturen auf der Zelloberfläche, bekannt als Blebs4,5. Schritt 2 (Apoptotic Vorsprung Bildung) umfasst die Bildung von langen Membran Vorsprünge z. B. Apoptopodia, Perlen-Apoptopodia und Mikrotubuli Spitzen6,7,8. Schritt 3 (ApoBD Bildung) umfasst schließlich die Fragmentierung des apoptotischen Vorsprünge und/oder ApoCells ApoBDs6,9erzeugen. Bisherigen Erkenntnisse haben eine Rolle von ApoBDs in Beihilfe apoptotische Zelle Abstand und Vermittlung interzelluläre Kommunikation vorgeschlagen. Zum Beispiel wird vorgeschlagen, dass die Zersplitterung der ein ApoCell in ApoBDs kleine "mundgerechte" Stücke generieren kann, die durch Phagozyten2,10,11Umgebung leicht entfernt werden konnte. Darüber hinaus können ApoBDs beherbergen eine Reihe von Biomoleküle wie DNA, RNA und Proteine, die zu den umliegenden Zellen Zellezelle Kommunikation12,13,14zu erleichtern gehandelt werden können. Um diese Prozesse funktional zu untersuchen, ist es wichtig, die drei wichtigsten Parameter einschließlich (i) Validierung der Apoptose-Induktion und ApoBD Bildung, (Ii) Isolierung von ApoBDs und (Iii) die Bestätigung der ApoBD Reinheit zu bestätigen.
Bisher wurden eine Reihe von Methoden, einschließlich der Durchflusszytometrie und Elektronenmikroskopie zur Apoptose und ApoBDs15,16,17,18zu studieren. Allerdings sind ApoBD Erkennung und Quantifizierung oft schwierig oder übersehen. Zum Beispiel routinemäßig verwendet Flow Cytometry-basierte Apoptose assay beschäftigt annexin V (A5, ein Protein, das die externalisierte bindet "Essen-mich" Signal Phosphatidylserin (PtdSer)) und Nukleinsäure Flecken Propidium Jodid (PI)19. Jedoch mithilfe dieses universelle Fleck Kombination Analyse setzt voraus, dass es nur drei Arten der Zelle Teilmengen (lebensfähige Zellen, ApoCells und nekrotische Zellen) in der Probe gibt. Darüber hinaus obwohl von vielen Forschern für die Apoptose als "Goldstandard" betrachtet, Durchflusszytometrie assays und anschließende Datenanalyse schließt oft ApoBDs durch gating zunächst FSC/SSCZwischenprodukt hoher Ereignisse auswählen. Also, vor kurzem haben wir einen neuartige Flow Cytometry Assay mit A5 und TO-PRO-3, ein weiteres Nuclein-Fleck, der selektiv durch Caspase 3/7-aktivierte Pannexin 1 (PANX1) aufgenommen werden kann Kanäle7,20. Wie Caspase 3-induzierte PANX1 Aktivierung PtdSer Exposition in der Frühphase der Apoptose vorausgeht, Flecken TO-PRO-3 differentiell apoptotische und nekrotischen Zellen. Darüber hinaus enthält dieser Ansatz kombiniert mit unserem Roman Anspritzung Strategie alle erworbenen Ereignisse während der Datenanalyse und infolgedessen sechs Zelle/Partikel Teilmengen werden identifiziert, einschließlich: (i) lebensfähige Zellen (FSC/SSCMittelstufe/hohe, A5niedrig , TO-PRO-3niedrige), (Ii) A5– frühe ApoCells (FSC/SSCMittelstufe/hohe, A5niedrig, TO-PRO-3Mittelstufe), (Iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCMittelstufe/hohe, A5hoch , TO-PRO-3Mittelstufe), (iv) nekrotische Zellen oder späten ApoCells (FSC/SSCMittelstufe/hohe, A5hoch, TO-PRO-3hohe), (V) ApoBDs (FSC/SSCniedrig, A5zwischen-, TO-PRO-3niedrig / Fortgeschrittene), und (vi) Schutt (FSC/SSCniedrig, A5niedrig, TO-PRO-3niedrige)20. Unser Ansatz betont die Bedeutung der Analyse alle Zellen/Partikel Teilmengen und noch wichtiger ist, die Trennung der ApoBDs von Zellen und Schutt20. So zeigt dieser Ansatz eine effiziente Technik um die Induktion der Apoptose und ApoBD Bildung gleichzeitig zu überprüfen.
ApoBDs traditionell durch eine Vielzahl von Ansätzen Differentielle Zentrifugation isoliert wobei ApoBDs von Zellen oder anderen extrazellulären Vesikel anhand der Dichte getrennt werden können. Allerdings sind solche Zentrifugation Methoden oft durch niedrige ApoBD Reinheit, Mangel an eine Quantifizierung Schritt zur Probe Reinheit und/oder Unfähigkeit, Zelle typspezifischen ApoBDs17,21,22trennen bestätigen begrenzt. Daher entwickelten wir vor kurzem zwei Ansätze, ein FACS-basierten und einen neuen Differentielle Zentrifugation basierenden Ansatz, welche mit unserer vorher festgelegten Flow-zytometrie-Methode, die Induktion der Apoptose und Probe Reinheit23validieren gekoppelt werden kann. ApoBD Isolierung über unsere FACS basierenden Ansatz kann ApoBDs bis zu 99 % Reinheit bereichern und koppelbar mit einer Vielzahl von Zelle-spezifischen Antikörper gegen ApoBDs von gemischten Zellpopulationen, Gewebeproben und Körperflüssigkeiten23zu isolieren. Darüber hinaus zeigt unsere überarbeitete Differentielle Zentrifugation Ansatz eine effiziente Methode, um ApoBDs zu isolieren > 90 % Reinheit23.
In diesem Papier beschreiben wir ausführlich unsere Versuchsanordnung um Apoptose-Induktion, zu validieren und zu erkennen und ApoBD Bildung zu quantifizieren. Auch die ApoBD Isolierung Workflows mit FACS-basierte und Differentielle Zentrifugation basierenden Methoden ausgearbeitet und im Vergleich. Die repräsentativen Daten zeigen, dass die beschriebene Methodik ein effektives modernstes Werkzeug für zukünftige ApoBD Studien bietet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1309px;" width="1309">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202)</td>
			<td style="width:149px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:513px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:149px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Penicillin-streptomycin mixture</td>
			<td style="width:149px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">FSC</td>
			<td style="width:149px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x PBS</td>
			<td style="width:149px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Annexin V FITC</td>
			<td style="width:149px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TO-PRO-3 iodide</td>
			<td style="width:149px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T3605</td>
			<td>TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x Annexin V binding buffer</td>
			<td style="width:149px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">556454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">1001710526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Centrifuge tube (15 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Cellstar</td>
			<td style="width:119px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Tissue culture incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td style="width:149px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:149px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection</td>
			<td style="width:149px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection</td>
			<td style="width:149px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">FACS Diva 6.1.1 software</td>
			<td style="width:149px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">FlowJo 8.8.6 software</td>
			<td style="width:149px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;UV Stratalinker 1800</td>
			<td style="width:149px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and isolation of apoptotic bodies to high purity

Apoptotic Bodies (ApoBDs), Microvesicles und exosomen gehören die extrazelluläre Vesikel-Familie, mit ApoBDs als eines der größten Art aus. Es wurde vorgeschlagen, dass ApoBDs Zelle sowie interzellulären Kommunikation durch Menschenhandel Biomolekülen unterstützen kann. Herkömmliche Ansätze zur Identifizierung und Isolierung von ApoBDs sind häufig durch das Fehlen der genaue Quantifizierung und niedrigen Probe Reinheit beschränkt. Hier beschreiben wir einen Workflow zur bestätigen die Induktion der Apoptose, ApoBD Bildung zu überprüfen und ApoBDs zu hoher Reinheit zu isolieren. Wir werden auch zu skizzieren und vergleichen Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) und Differentielle Zentrifugation basierte Ansätze, ApoBDs zu isolieren. Darüber hinaus wird die Reinheit der isolierten ApoBDs bestätigt werden, mit einer zuvor Flow Cytometry-basierte Färbung und analytische Methode zu etablieren. Zusammengenommen mit dem beschriebenen Ansatz wurde THP-1 Monocyte Apoptose und apoptotische Zelle Demontage induzierte validiert und ApoBD generiert aus Monozyten THP-1 wurden isoliert zu einer Reinheit von 97-99 %.

Hier beschriebene Verfahren verwenden, THP-1 Monocyte Apoptose induziert wurde und ApoBDs wurden erkannt und isoliert entweder über eine FACS-basierte oder eine Differentielle Zentrifugation Ansatz (Abbildung 1). Erstens Apoptose induziert wurde durch UV-Bestrahlung und Proben wurden nach 2-3 h Inkubation gesammelt, wenn Zellen Apoptose Morphologien, einschließlich Blebbing, apoptotischen Membran Vorsprung Bildung und die Generation der ApoBDs<sup class="xr...

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Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

Ein Workflow mit Flow Cytometry oder Differential Zentrifugation wurde entwickelt, um erkennen, zu quantifizieren und isolieren Apoptotic Körper aus einem Apoptotic Probe zu hoher Reinheit.

Nachweis und Isolierung von apoptotischen stellen hohe Reinheit

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.5K Aufrufe.  La Trobe University. Ein Workflow mit Flow Cytometry oder Differential Zentrifugation wurde entwickelt, um erkennen, zu quantifizieren und isolieren Apoptotic Körper aus einem Apoptotic Probe zu hoher Reinheit.

Serie: Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most interestingly, sRNAs are also found outside of cells and are stably present in all biological fluids. As such, extracellular sRNAs represent a novel class of disease biomarkers and are likely involved in cell signaling and intercellular communication networks. To assess their potential as biomarkers, sRNAs can be quantified in plasma, urine, and other fluids. Nevertheless, to fully understand the impact of extracellular sRNAs as endocrine signals, it is important to determine which carriers are transporting and protecting them in biological fluids (e.g., plasma), which cells and tissues contribute to extracellular sRNA pools, and cells and tissues capable of accepting and utilizing extracellular sRNA. To accomplish these goals, it is critical to isolate highly pure populations of extracellular carriers for sRNA profiling and quantification. We have previously demonstrated that lipoproteins, particularly high-density lipoproteins (HDL), transport functional microRNAs (miRNA) between cells and HDL-miRNAs are significantly altered in disease. Here, we detail a new protocol that utilizes tandem HDL isolation with density-gradient ultracentrifugation (DGUC) and fast-protein-liquid chromatography (FPLC) to obtain highly pure HDL for downstream profiling and quantification of all sRNAs, including miRNAs, using both high-throughput sequencing and real-time PCR approaches. This protocol will be a valuable resource for the investigation of sRNAs on HDL.

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte für Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Forschung

Biochemie

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (A&#946;42) and amyloid beta 40 (A&#946;40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase - styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (&gt;95%) A&#946;42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the A&#946;40 peptide with identical success and without the need to alter the method.

Herein we report a tailored HPLC purification protocol that yields high-purity amyloid beta 42 (A&#946;42) and amyloid beta 40 (A&#946;40) peptides, capable of oligomer formation. Amyloid beta is a highly aggregation prone, hydrophobic peptide implicated in Alzheimer&#39;s disease. The amyloidogenic nature of the peptide makes its purification a challenge.

Ein Tailored HPLC Reinigungsprotokoll, dass die Renditen hochreine Amyloid Beta 42 und Amyloid Beta 40 Peptides, Fähig zur Oligomerbildung

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, consequently, cardiovascular disease. Although PCSK9 proteolysis is required for its full hypercholesterolemic effect, the evaluation of its proteolytic function is challenging: PCSK9 is only known to cleave itself, undergoes only a single turnover, and after proteolysis, retains its substrate in its active site as an auto-inhibitor. The methods presented here describe an assay which overcomes these challenges. The assay focuses on intermolecular proteolysis in a cell-based context and links successful cleavage to the secreted luciferase activity, which can be easily read out in the conditioned medium. Via sequential steps of mutagenesis, transient transfection, and a luciferase readout, the assay can probe PCSK9 proteolysis under conditions of either genetic or molecular perturbation in a high-throughput manner. This system is well suited for both the biochemical evaluation of clinically discovered missense single-nucleotide polymorphisms (SNPs), as well as for the screening of small-molecule inhibitors of PCSK9 proteolysis.

This protocol presents a method to evaluate the proteolytic activity of an intrinsically low-activity, single turnover protease in a cellular context. Specifically, this method is applied to evaluate the proteolytic activity of PCSK9, a key driver of lipid metabolism whose proteolytic activity is required for its ultimate hypercholesterolemic function.

Ein High-Throughput Luciferase Assay Proteolyse von Single-Umsatz Protease PCSK9 bewerten

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR and sensitivity-enhanced DNP experiments. The sample processing procedure of plant biomass is also detailed. This method allows the measurement of a series of 1D and 2D 13C-13C/15N correlations spectra, which enables high-resolution structural elucidation of complex biomaterials in their native state, with minimal perturbation. The isotope-labeling can be examined by quantifying the intensity in 1D spectra and the polarization transfer efficiency in 2D correlation spectra. The success of dynamic nuclear polarization (DNP) sample preparation can be evaluated by the sensitivity enhancement factor. Further experiments examining the structural aspects of the polysaccharides and proteins will lead to a model of the three-dimensional architecture. These methods can be modified and adapted to investigate a wide range of carbohydrate-rich materials, including the natural cell walls of plants, fungi, algae and bacteria, as well as synthesized or designed carbohydrate polymers and their complex with other molecules.

A protocol for preparing 13C,15N-labeled fungal and plant samples for multidimensional solid-state NMR spectroscopy and dynamic nuclear polarization (DNP) investigations is presented.

Vorbereitung von Pilz und Pflanze-Materialien für strukturelle Aufklärung mittels dynamischen atomare Polarisation Festkörper-NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form loose callus on Murashige and Skoog (MS) basal media with the plant hormones 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D, 1.0 mg L-1) and kinetin (KT, 0.1 mg L-1). Callus formed after 3 or 4 rounds of subculturing, each lasting 28 days. Loose callus (about 3 g) was then inoculated into B5 liquid media containing the same plant hormones and was cultured in a shaking incubator (120 rpm) in the dark at 25 &#177; 1 &#176;C. After 3&#8722;4 subcultures, a cell suspension derived from tea leaf was established at a subculture ratio ranging between 1:1 and 1:2 (suspension mother liquid: fresh medium). Using this platform, six insecticides (5 &#181;g mL-1 each thiamethoxam, imidacloprid, acetamiprid, imidaclothiz, dimethoate, and omethoate) were added into the tea leaf-derived cell suspension culture. The metabolism of the insecticides was tracked using liquid chromatography and gas chromatography. To validate the usefulness of the tea cell suspension culture, the metabolites of thiamethoxan and dimethoate present in treated cell cultures and intact plants were compared using mass spectrometry. In treated tea cell cultures, seven metabolites of thiamethoxan and two metabolites of dimethoate were found, while in treated intact plants, only two metabolites of thiamethoxam and one of dimethoate were found. The use of a cell suspension simplified the metabolic analysis compared to the use of intact tea plants, especially for a difficult matrix such as tea.

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

This work presents a protocol for establishing a cell suspension culture derived from tea (Camellia sinensis L.) leaves that can be used to study the metabolism of external compounds that can be taken up by the whole plant, such as insecticides.

Studie über den Stoffwechsel von sechs systemischen Insektiziden in einer neu etablierten Zellsuspensionskultur abgeleitet aus Tee (Camellia Sinensis L.) Blätter

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the homeostasis of adult tissues. Interestingly, oxidative stress can alter these processes, thus contributing to the pathophysiology of diseases such as metastatic cancer. Therefore, understanding the mechanism(s) of how cells attach and spread on the ECM during perturbations in redox status can provide insight into normal and disease states. Described below is a step-wise protocol that utilizes an immunofluorescence-based assay to specifically quantify cell adhesion and spreading of immortalized fibroblast cells on fibronectin (FN) in vitro. Briefly, anchorage-dependent cells are held in suspension and exposed to the ATM kinase inhibitor Ku55933 to induce oxidative stress. Cells are then plated on FN-coated surface and allowed to attach for predetermined periods of time. Cells that remain attached are fixed and labeled with fluorescence-based antibody markers of adhesion (e.g., paxillin) and spreading (e.g., F-actin). Data acquisition and analysis are performed using commonly available laboratory equipment, including an epifluorescence microscope and freely available Fiji software. This procedure is highly versatile and can be modified for a variety of cell lines, ECM proteins, or inhibitors in order to examine a broad range of biological questions.

This method is useful for quantifying the early dynamics of cellular adhesion and spreading of anchorage-dependent cells onto the fibronectin. Furthermore, this assay can be used to investigate the effects of altered redox homeostasis on cell spreading and/or cell adhesion-related intracellular signaling pathways.

Untersuchung der Dynamik der zellulären Adhäsion und Ausbreitung von Epithelzellen auf Fibronectin während oxidativen Stresses

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they contain various parental cell-derived biomolecules such as DNA, mRNA, miRNA, proteins, and lipids, their enrichment and isolation are critical steps for their exploitation as potential biomarkers for clinical applications. However, conventional isolation methods (e.g., ultracentrifugation) cause significant loss and damage to microvesicles and exosomes. These methods also require multiple repetitive steps &#160;of ultracentrifugation, loading, and wasting of reagents. This article describes a detailed method to fabricate an origami-paper-based device (Exo-PAD) designed for the effective enrichment and isolation of microvesicles and exosomes in a simple manner. The unique design of the Exo-PAD, consisting of accordion-like multifolded layers with convergent sample areas, is integrated with the ion concentration polarization technique, thereby enabling fivefold enrichment of the microvesicles and exosomes on specific layers. In addition, the enriched microvesicles and exosomes are isolated by simply unfolding the Exo-PAD.

Presented is a protocol to fabricate a paper-based device for the effective enrichment and isolation of microvesicles and exosomes.

Papierbasierte Vorkonzentration und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without labeling other than deuterium. In particular, neutron backscattering spectroscopy records the scattering signals at multiple scattering angles simultaneously and is well suited to study the dynamics of biological systems on the ps-ns timescale. By employing D2O-and possibly deuterated buffer components-the method allows monitoring of both center-of-mass diffusion and backbone and side-chain motions (internal dynamics) of proteins in liquid state.
Additionally, hydration water dynamics can be studied by employing powders of perdeuterated proteins hydrated with H2O. This paper presents the workflow employed on the instrument IN16B at the Institut Laue-Langevin (ILL) to investigate protein and hydration water dynamics. The preparation of solution samples and hydrated protein powder samples using vapor exchange is explained. The data analysis procedure for both protein and hydration water dynamics is described for different types of datasets (quasielastic spectra or fixed-window scans) that can be obtained on a neutron backscattering spectrometer.
The method is illustrated with two studies involving amyloid proteins. The aggregation of lysozyme into &#181;m sized spherical aggregates-denoted particulates-is shown to occur in a one-step process on the space and time range probed on IN16B, while the internal dynamics remains unchanged. Further, the dynamics of hydration water of tau was studied on hydrated powders of perdeuterated protein. It is shown that translational motions of water are activated upon the formation of amyloid fibers. Finally, critical steps in the protocol are discussed as to how neutron scattering is positioned regarding the study of dynamics with respect to other experimental biophysical methods.

Neutron backscattering spectroscopy offers a nondestructive and label-free access to the ps-ns dynamics of proteins and their hydration water. The workflow is presented with two studies on amyloid proteins: on the time-resolved dynamics of lysozyme during aggregation and on the hydration water dynamics of tau upon fiber formation.

Hochauflösende Neutronenspektroskopie zur Untersuchung der Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the physiological and pathological state of a cell. However, there is no standard method for sEV isolation, which prevents downstream biomarker identification and drug intervention studies. In this article, we provide a detailed protocol for the isolation and purification of 50-200 nm sEV by a flow cell sorter. For this, a 50 &#181;m nozzle and 80 psi sheath fluid pressure were selected to obtain a good sorting rate and stable side stream. Standard sized polystyrene microspheres were used to locate populations of 100, 200, and 300 nm particles. With additional optimization of the voltage, gain, and forward scatter (FSC) triggering threshold, the sEV signal could be separated from the background noise. These optimizations provide a panel of critical sort settings that enables one to obtain a representative population of sEV using FSC vs. side scatter (SSC) only. The flow cytometry-based isolation method not only allows for high-throughput analysis but also allows for synchronous classification or proteome analysis of sEV based on the biomarker expression, opening numerous downstream research applications.

This protocol provides a rapid and size-specific isolation method for small extracellular vesicles by optimizing the size of the air spray nozzle, sheath fluid pressure, sample flow pressure, voltage, gain, and triggering threshold parameters.

Optimierung der durchflusszytometrischen Sortierparameter für die Hochdurchsatzisolierung und Aufreinigung kleiner extrazellulärer Vesikel

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...