Die ITSN, PI3K-C2β und Kontrolle Vektoren im Sinne dieses Protokolls sind von den Autoren auf Anfrage erhältlich, für nicht-kommerzielle Zwecke. Die Autoren möchten Dr. Chang-Deng Hu für die freundliche Beratung und die Reagenzien in die Gründung der BIFC Protokoll in der O&#39;Bryan Labor bestätigen. KAW wurde mit Mitteln der Stiftung Jerome Lejeune unterstützt. Die Arbeit in den O&#39;Bryan Labor ist durch Zuschüsse der NIH (HL090651), DOD (PR080428), die St. Baldrick Stiftung und der Stiftung Jerome Lejeune unterstützt.

A. BIFC Calibration <ol><li> Wählen Sie ein Fluorophor. Es gibt mehrere Fluorophore, wie YFP und Venus, die gut funktionieren, wie BIFC Fusionspartner (Tabelle 1). Amino-und Carboxy-terminalen Enden der Venus sind in der Lage, ein komplexes bei 37 ° C zu bilden, während die YFP BIFC Fragmente eine Vorinkubation erfordern bei 30 ° C, um Fluorophor Bildung 2 zu erleichtern. Diese Inkubation bei niedriger Temperatur verändern können einige zelluläre Prozesse und sollten berücksichtigt werden bei der Auswahl Fragmente. Vektoren für die Absicherung Venus zum Carboxy-Terminus von Proteinen aus Addgene (verfügbar <a href="http://www.addgene.org/pgvec1">http://www.addgene.org/pgvec1</a> ; seepBiFC-VN173 und pBiFC-VC155) zusammen mit weiteren Konstrukte zur Verwendung als Kontrollen, zB <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a> und pBiFC-bFosVC155 2. Weitere Vektoren, einschließlich Amino-terminalen Venus Vektoren (pFLAG-VN173 und PHA-VC155), sind auf der folgenden Website verfügbar: <a href="http://people.pnhs.purdue.edu/%7Ehu1/">http://people.pnhs.purdue.edu/ ~ hu1 /</a> . </li><li> Tag des Proteins von Interesse. Die BIFC Fragmente an den Amino-oder Carboxy-terminalen Enden der Kandidaten-Proteine ​​sind verschmolzen. Einige Proteine ​​können nicht für das Tagging erlauben an jedem Ende durch eine Störung der Funktion von Proteinen. Zum Beispiel sind viele Mitglieder der Ras-Superfamilie der GTPasen Lipid am Carboxy-terminus somit auch keine Befestigung der BIFC Fragmente an diesem Ende modifiziert. So ist es wichtig, eine Vorstellung davon, wie Befestigung der BIFC Fragmente können in Abhängigkeit von der Proteine ​​von Interesse auswirken. Wenn es unklar ist, wie Tagging ein Protein beeinflusst die Funktion mehrere Kombinationen getestet werden sollte. Zusätzlich zu den BIFC Fragment kann ein Peptid-Linker enthalten, um die Flexibilität zwischen den fragmentierten Fluorophor und der Kandidat Proteine ​​zu erhöhen. Während die multiple cloning sites (MCS) in der BIFC Vektoren kodieren kurzen Aminosäure Strecken, die eine ausreichende Flexibilität, die RSIAT, KQKVMNH und RPACKIPNDLKQKVMNH Linker bieten kann erfolgreich in BIFC Experimenten 3,9 verwendet </li><li> Bestimmen Sie Transfektionsbedingungen. Vor der Prüfung mehrerer Mutanten, ein paar Kontrolle Experimente durchgeführt werden. Die ersten beiden BIFC Kombinationen, die ausprobiert werden sollten zwei Wildtyp-Proteine, die bekanntermaßen in Wechselwirkung treten und eine Wildtyp und Mutante, die nicht interagieren. Mit diesen beiden Kombinationen, sollten unterschiedliche Mengen an DNA und Transfektion mal getestet, um optimale Bedingungen für die Erkennung eines BIFC Signal für die Kandidaten-Proteine ​​zu bestimmen. Wir empfehlen Tests 0.25ug, 0.5ug, 1.0ug jedes BIFC Konstrukt für eine einzelne Vertiefung einer 6-Well Schale. Der Tag nach der Transfektion Monitor Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie eine optimale Zeit für das Signal der Entwicklung zu bestimmen. Die <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a> und pBiFC-bFosVC155 2 Konstrukte sind nützliche positive Kontrollen für BIFC und werden von Addgene (siehe oben) zur Verfügung. Darüber hinaus sollten Western-Blot-Analyse durchgeführt, um gleich Ausdruck der Konstrukte zu bestätigen. Die Bedingungen sollten so gewählt, dass ein Fluoreszenzsignal zwischen den beiden Wildtyp-Proteine, aber wenig bis kein Signal beobachtet zwischen dem Wildtyp und mutierten Proteinen beobachtet werden. Schließlich ist es am besten, Proteinexpression so gering wie möglich zu halten, um alle nicht-spezifischen Wechselwirkungen zu verhindern. </li><li> Bestimmen Sie, ob die Zugabe des BIFC Fragmente verändert die Lokalisation der Proteine ​​von Interesse. Jeder BIFC Konstrukt enthält entweder eine HA oder FLAG-Epitop-Tag. Immunostain transefected Zellen sowohl für die HA oder FLAG-Epitop-Tag sowie auch das endogene Protein (wenn möglich), um festzustellen, ob die BIFC tag beeinflusst Lokalisation der Proteine ​​von Interesse. </li></ol> B. Plating und Transfektion von Zellen <ol><li> COS-Zellen (1.3x10 5) sind jeweils auf einen Glasboden Matek Platte und zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte pro Probe beschichtet. Lassen Zellen über Nacht absetzen bei 37 ° C. Alternative Zelltypen, die besser auf die Kandidaten-Proteine ​​von Interesse sind, können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Bereiten DNAs für die Transfektion. Wir nutzen typischerweise Lipofectamine (Invitrogen) für COS Transfektionen. Jedoch können auch andere Reagenzien besser geeignet sein für die Zell-Linie von Interesse. Da die Transfektion Mischung zwischen einem Glasboden Satellitenschüssel mit zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte aufgeteilt werden, verwenden Sie die entsprechende Menge an DNA zu berücksichtigen diesem Geschäftsbereich. Verdünnen DNA in 250uL von serumfreiem (SF) DMEM. Add CFP bei 1 / 5 der Höhe von insgesamt BIFC DNAs als Transfektion Kontrolle. Für BIFC Quantifizierung, werden nur Zellen, die positiv für GFP für die Anwesenheit eines BIFC Signal analysiert werden. Beachten Sie, dass die GFP-Spektren werden mit einigen der BIFC Paaren in Tabelle 1 überlappen, daher eine alternative Transfektion KontrolleVielleicht benötigt. Verdünnen Lipofectamine in 250uL SF DMEM (10uL Lipofectamine/1ug von DNA). Mischen Sie die DNA und Lipofectamine Verdünnungen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 20min. Hinweis: Die Lipofectamine: DNA-Verhältnis kann je nach Zelltyp. Verwenden Sie die geeignete Methode für die Transfektion der Zelllinie von Interesse. </li><li> Spülen Zellen 2x mit warmem SF DMEM. Add 2 ml SF DMEM jedem Glas Bodenplatte oder Vertiefung einer 6-well Schale. </li><li> Split jeder Transfektion Mischung gleichmäßig zwischen einem Glasboden Satellitenschüssel mit zwei Vertiefungen einer 6-well Schale. </li><li> Inkubieren Zellen bei 37 ° C für 5 Stunden. </li><li> Entfernen Sie die Transfektion Medien und ersetzen mit kompletter Medien (DMEM +10% FBS). </li><li> Inkubieren Zellen über Nacht bei 37 ° C. Die Länge der Inkubationszeit nach der Transfektion ist abhängig von der Expression der Proteine ​​von Interesse. Längerer Inkubation kann in nicht-spezifische Interaktion Ergebnis so wird dieser Schritt müssen empirisch ermittelt werden. </li></ol> C. Herstellung von Zellen für Imaging <ol><li> Die Zellen werden zunächst im Rahmen eines Epifluoreszenz-Mikroskop, um sicherzustellen, dass die positive Kontrolle fluoreszierenden untersucht. Wenn nicht, kann es notwendig sein, um Zellen zusätzliche Zeit bei 37 ° C ermöglichen, bis das Signal zu beobachten ist. </li><li> Spülen Zellen 3x mit PBS (pH 7,4). Um die Zellen in den Glasboden Schüssel mit 2% Paraformaldehyd (pH 7,4). Fix-Zellen für 10min auf Eis. Spülen Zellen 3x mit PBS (pH 7,4). Shop-Zellen bei 4 ° C bedeckt mit 1 ml PBS (pH 7,4). Cells müssen nicht für die Bildgebung fixiert werden, aber sobald die BIFC Fragmente Reform einer intakten Fluorophor es ist irreversibel und verhindert so Analyse von dynamischen Interaktionen 3. Auch im Auge behalten, dass nicht fixierten Zellen werden weiterhin Signal zu entwickeln. Lyse der Zellen in der 6-well Schüssel und bereitet Lysaten für Western-Blot-Analyse. Es ist wichtig, dass alle Zellen gleichzeitig bereit sind, so dass die lysierten Zellen Vertreter der abgebildeten Zellen sind. </li></ol> D. Imaging Cells <ol><li> Die Fluoreszenzintensität wird pro Zelle berechnet werden. Achten Sie darauf, um einzelne Zellen. </li><li> GFP wurde als tranfection Kontrolle eingeschlossen und nur GFP positive Zellen sind für die Analyse von BIFC Signale ausgewählt. Wir gehen davon aus, dass, wenn die Zelle mit GFP transfiziert wird, ist es auch mit dem BIFC Konstrukten transfiziert. Dieser Ansatz stellt sicher, dass die gesicherten Zellen, die eine BIFC Signal mangelnde negativ sind mangels einer Interaktion zwischen den Proteinen von Interesse und nicht wegen des Fehlens eines oder beider BIFC Expressionskonstrukte in die Zelle. </li><li> Wir verwenden ein Zeiss LSM 510 konfokalen Mikroskop für Zell-Bildgebung. Bei Verwendung dieses Mikroskop ist es wichtig, den Zoom, Blende, Detektor zu gewinnen, Verstärker-Offset, Baugröße, Scan-Geschwindigkeit, Scan Durchschnitt, und Laserleistung konsistent zu halten. Bei der Verwendung von bildgebenden Systems ist es wichtig, dass die Einstellungen konstant, so dass die Fluoreszenz ist vergleichbar zwischen den Proben. Auch bei der Quantifizierung Fluoreszenz ist es wichtig, dass Pixel nicht gesättigt sind. </li></ol> E. Quantifizierung Fluorescence <ol><li> Fluoreszenz kann quantifiziert mit jedem Bildbearbeitungs-Software werden. Wir nutzen ImageJ, die kostenlos über die NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/) ist. Bilddateien öffnen in ImageJ. Zum AnalyzeSet ​​Messungen. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen für die Fläche und mittlerer Grauwert in dem Maße ein. </li><li> Mit der &quot;freien Hand Auswahl&quot; Werkzeug, ziehen eine Umrisslinie um den Rand der gesamten Zelle in der GFP-Kanal. </li><li> Lassen Sie diesen Entwurf in Kraft, die YFP-Kanal zu verlagern. Zum AnalyzeMeasure. Die mittlerer Grauwert ist die Summe der Grauwerte aller Pixel in die Auswahl durch die Anzahl der Pixel (dh die durchschnittliche Fluoreszenzintensität pro Fläche der Zelle) unterteilt. </li><li> Für jedes Bild einen Kreis zeichnen in der YFP-Kanal in einem Bereich, der nicht enthält eine Zelle. Nehmen Sie eine Messung für diesen Bereich als Hintergrund. Subtrahieren dem Hintergrund von jedem Bild. </li><li> Durchschnittliche die mittlere Grauwert minus den Hintergrund für alle Zellen in einer Probe abgebildet. Dies wird die mittlere Fluoreszenzintensität für eine Population von Zellen sein. Wir würden vorschlagen, etwa 60 Zellen über drei Experimente quantifiziert werden. </li></ol> F. Repräsentative Ergebnisse: Unser Labor konzentriert sich auf die Multi-Domain-Gerüst-Protein, intersectin (ITSN), die mit zahlreichen Proteinen interagiert zu regulieren mehrere biochemische und Signalwege 10,11,12,13,14. ITSN enthält zwei Eps15 Homologie (EH)-Domänen, eine Coiled-coiled Region, und fünf Src Homologie 3 (SH3)-Domänen. Je länger Isoform ITSN enthält auch Dbl Homologie (DH) und Pleckstrin Homologie (PH)-Domänen, die an einem Strang als Guanin-Nukleotid-Austausch-Faktor für Cdc42 15. Dieser modulare Aufbau fördert Protein: Protein-Interaktionen und macht ITSN ein idealer Kandidat für BIFC Experimente. Die subzelluläre Lokalisation von ITSN verändern können ihre Bindungspartner und somit verändern die Pfade durch ITSN (unpublis geregelthed-Daten). Vor kurzem hat unser Labor nachgewiesen, dass ITSN neuronale Überleben regelt durch Verordnung einer neuen Klasse II PI3K, PI3K-C2β 11. Die Amino-terminalen Pro-reiche Domäne des PI3K-C2β enthält zwei Bindungsstellen für ITSN der SH3-Domänen. Mit Co-Immunopräzipitation mit ITSN und PI3K-C2β Abschneiden Mutanten haben wir gezeigt, dass ITSN ist SH3A und SH3C Domains mit der Amino-terminalen Region des PI3K-C2β interagieren. Als nächstes haben wir BIFC die subzelluläre Lokalisation dieses Komplexes zu visualisieren. ITSN war es, die Amino-Terminus von Venus (pFLAG-VN173) und PI3K-C2β Konstrukte, fusioniert mit dem Carboxy-terminus of Venus (PHA-VC155) fusioniert. Als weiteres Negativ-Kontrolle wurde ein nicht-spezifisches Peptid an PHA-VC155 verschmolzen. VN-ITSN und VC-PI3K-C2β bildeten eine BIFC Komplex mit einem punctuate Verteilung (Abb. 2A, obere Reihe). Mutationen in den Pro-reiche Domäne des PI3K-C2β, dass Co-Fällung von ITSN und PI3K-C2β stören sank die BIFC Signal (Abbildung 2A, untere Reihe) 11. Dieser Unterschied in BIFC Signal zwischen ITSN und die beiden PI3K-C2β Proteine ​​nicht aufgrund von Unterschieden in der Proteinexpression (Abbildung 2B). <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> . Abbildung 1 In BIFC wird ein Fluorophor (in diesem Fall Venus) in Aminosäuren (VN) split - und Carboxy-(VC)-terminalen Enden. Diese Enden sind zwei Proteine ​​von Interesse fusioniert. Als die beiden Proteine ​​interagieren, die VN und VC-Fragmenten re-assoziieren sich in den Wiederaufbau des Fluorophors und Fluoreszenz an den Standorten der Interaktion. BIFC ist ein konkretes Beispiel für das Protein-Fragment Komplementation Assay (PCA) verwendet, um Protein zu messen: Protein-Interaktionen 5. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. ITSN und PI3K-C2β bilden eine BIFC komplex. A. VN-tagged ITSN wurde mit VC-tagged PI3K-C3β WT oder eine Prolin-reiche Domäne co-transfiziert Mutante (PI3K-C2β-PA). ITSN und WT PI3K-C2β einen Komplex bilden (grün). CFP (rot) wurde als Kontrolle der Transfektion B. A Western-Blot durchgeführt, um gleich Ausdruck der Konstrukte zu demonstrieren verwendet wurde. Die VC-markierten Konstrukte HA getaggt. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643table1.jpg" alt="Tabelle 1" /> Tabelle 1. Es gibt mehrere Vektoren, die kompatibel mit BIFC sind. YN155: 1-155aa von YFP; YC155: 155-238aa von YFP; YN173: 1-172aa von YFP; YC173, 173-238aa von YFP; VN155: 1-154aa der Venus; VC155: 155-238 von Venus; VN173: 1-172aa der Venus; VC173: 173-238aa der Venus; CN155 1-154aa der GFP; CC155 155-238aa von CFP, GN173: 1-172aa von GFP, CitN155: 1-155aa von Citrin, CitC155: 155-238aa der Citrin, CitN173: 1-172aa von Citrin, CitC173: 173-238aa von Citrin, CerN173: 1-172aa von Cerulean 2,3,9.

<ol>
	<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+interactions+by+fluorescence+complementation.">Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40, 61-66 (2006).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+by+protein+fragment+complementation+strategies.">Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies.</a> Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).</li><li>Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+strategies+to+delineate+MAP+kinase+signaling+pathways+using+protein-fragment+complementation+assays+(PCA).">Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA).</a> Methods. 40, 287-293 (2006).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li><li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).</li><li>Martin, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+regulates+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis,+ubiquitylation,+and+signaling.">Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling.</a> Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).</li><li>Das, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuron+survival+through+an+intersectin-phosphoinositide+3'-kinase+C2beta-AKT+pathway.">Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3'-kinase C2beta-AKT pathway.</a> Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).</li><li>Mohney, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+activates+Ras+but+stimulates+transcription+through+an+independent+pathway+involving.">Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving.</a> JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).</li><li>Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+can+regulate+the+Ras/MAP+kinase+pathway+independent+of+its+role+in+endocytosis.">Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).</li><li>Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+an+adaptor+protein+involved+in+clathrin-mediated+endocytosis,+activates+mitogenic+signaling+pathways.">Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways.</a> J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).</li><li>O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogenesis+and+endocytosis:+What's+at+the+INTERSECTIoN?.">Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN?.</a> Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET.">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).</li></ol>

BIFC ist eine hervorragende Methode zur Visualisierung von Protein: Protein-Interaktionen in ganzen Zellen und die Bestimmung der subzellulären Lokalisation dieser Komplexe. Die Vorteile der BIFC sind, dass nur interagierende Proteine ​​fluoreszierend sind, sind vergänglich Wechselwirkungen stabilisiert, und Post-Processing der Bilddaten ist minimal. Zwei Nachteile dieser Methode sind die Reifezeit für den Fluorophor und die Unumkehrbarkeit des Fluorophor-Komplex. Unter bestimmten Anwendungen dieser Unumkehrbarke...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-013</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>35-011-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Matek</td>
<td>P35G-1.5-14C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>35-3846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18324020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>21-031-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>LSM510 META</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation

Definition der subzellulären Verteilung von Signalkomplexen ist zwingend notwendig, um das Verständnis der Ausgang aus diesem Komplex. Herkömmliche Methoden wie Immunpräzipitation liefern keine Informationen über die räumliche Lokalisierung der Komplexe. Im Gegensatz dazu überwacht BIFC das Zusammenspiel und die subzelluläre Kompartimentierung der Protein-Komplexen. In diesem Verfahren wird eine fluororescent Protein in Amino-und Carboxy-terminalen nicht-fluoreszierenden Fragmente, die dann auf zwei Proteine ​​von Interesse sind verschmolzen aufgeteilt. Die Wechselwirkung der Proteine ​​führt zu Wiederherstellung des Fluorophors (Abbildung 1) 1,2. Eine Einschränkung der BIFC ist, dass sobald die fragmentierte Fluorophor rekonstituierte die komplexen irreversible 3 ist. Diese Einschränkung ist von Vorteil bei der Erkennung vorübergehend oder schwachen Wechselwirkungen, sondern schließt eine kinetische Analyse der komplexen Dynamik. Eine weitere Einschränkung ist, dass die rekonstituierte flourophore 30min, um zu reifen und fluoreszieren erfordert, wieder ausschließt die Beobachtung von Echtzeit-Interaktionen 4. BIFC ist ein konkretes Beispiel für das Protein-Fragment Komplementation Assay (PCA), die Reporter-Proteine ​​wie grün fluoreszierende Protein-Varianten (BIFC), Dihydrofolatreduktase, b-Lactamase und Luciferase an Protein zu messen beschäftigt: Protein-Interaktionen 5,6. Alternative Methoden zur Protein-Studie: Protein-Interaktionen in Zellen gehören Fluoreszenz-Co-Lokalisation und Förster resonance energy transfer (FRET) 7. Für Co-Lokalisation, sind zwei Proteine ​​einzeln entweder direkt mit einem Fluorophor oder durch indirekte Immunfluoreszenz markiert. Allerdings führt dieser Ansatz zu hohen Hintergrund an nicht-interagierenden Proteinen macht es schwierig, Co-Lokalisation Daten zu interpretieren. Darüber hinaus aufgrund der Grenzen der Auflösung der konfokalen Mikroskopie können zwei Proteine ​​scheinen, ohne notwendigerweise interagierenden co-lokalisiert. Mit BIFC wird die Fluoreszenz nur beobachtet, wenn die beiden Proteine ​​von Interesse zu interagieren. FRET ist eine weitere hervorragende Methode zur Untersuchung von Protein: Protein-Interaktionen, kann aber technisch anspruchsvoll. FRET Experimente erfordern die Donor-und Akzeptor ähnlicher Helligkeit und Stöchiometrie in der Zelle. Darüber hinaus muss man für das Durchschlagen der Spender-Konto in die Akzeptor-Kanal und umgekehrt. Im Gegensatz zu FRET hat BIFC wenig Hintergrundfluoreszenz, wenig Nachbearbeitung der Bilddaten, erfordert keine hohen Überexpression und kann schwache oder transiente Wechselwirkungen zu erkennen. Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) ist eine Methode ähnlich, außer der Spender ist ein Enzym (zB Luciferase), dass ein Substrat katalysiert zu werden Biolumineszenz so spannend Akzeptor FRET. BRET fehlen die technischen Probleme der Durchscheinen und hohe Hintergrundfluoreszenz es fehlt jedoch die Fähigkeit, räumliche Informationen durch das Fehlen von Substrat-Lokalisierung auf bestimmte Fächer 8 bereitzustellen. Insgesamt ist BIFC eine hervorragende Methode zur Visualisierung von subzelluläre Lokalisation von Protein-Komplexe, um Einblick in compartmentalized Signalisierung zu gewinnen.

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Bimolecular Fluorescence Complementation

Die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen ist bei der Bestimmung der räumlich-zeitliche Regulation der zellulären Signalübertragung wichtig. Hier beschreiben wir bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) als eine einfache Methode zur Überwachung der räumlichen Wechselwirkungen von Proteinen in der Zelle.

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Research

JoVE Journal

Biology

27.7K Aufrufe.  University of Illinois at Chicago. Die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen ist bei der Bestimmung der räumlich-zeitliche Regulation der zellulären Signalübertragung wichtig. Hier beschreiben wir bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) als eine einfache Methode zur Überwachung der räumlichen Wechselwirkungen von Proteinen in der Zelle.

Serie: Bimolecular Fluorescence Complementation

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Forschung

Biologie

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen in Onion Zellen unter Verwendung des Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Microbes typically live in communities. The spatial organization of cells within a community is believed to impact the survival and function of the community1. Optical sectioning techniques, including confocal and two-photon microscopy, have proven useful for observing spatial organization of bacterial and archaeal communities2,3. A combination of confocal imaging and physical sectioning of yeast colonies has revealed internal organization of cells4. However, direct optical sectioning using confocal or two-photon microscopy has been only able to reach a few cell layers deep into yeast colonies. This limitation is likely because of strong scattering of light from yeast cells4.
Here, we present a method based on fixing and cryosectioning to obtain spatial distribution of fluorescent cells within Saccharomyces cerevisiae communities. We use methanol as the fixative agent to preserve the spatial distribution of cells. Fixed communities are infiltrated with OCT compound, frozen, and cryosectioned in a cryostat. Fluorescence imaging of the sections reveals the internal organization of fluorescent cells within the community.
Examples of yeast communities consisting of strains expressing red and green fluorescent proteins demonstrate the potentials of the cryosectioning method to reveal the spatial distribution of fluorescent cells as well as that of gene expression within yeast colonies2,3. Even though our focus has been on Saccharomyces cerevisiae communities, the same method can potentially be applied to examine other microbial communities.

We present a protocol for freezing and cryosectioning yeast communities to observe internal patterns of fluorescent cells. The method relies on methanol-fixing and OCT-embedding to preserve the spatial distribution of cells without inactivating fluorescent proteins within a community.

Kryoschneiden Hefe Gemeinschaften für die Prüfung Fluoreszenzmuster

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluorescence Komplementierung: A High Throughput Quantitative Methode zur Protein-Protein Interaction Study

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Schnelle Analyse und Exploration von Fluoreszenzmikroskopie Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genomweite Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Screening Protein-Fragment Komplementierungsassay (PKA) in lebenden Zellen

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...