Wir möchten Jürgen Soll für hilfreiche Diskussionen und Chris Carrie für kritische Durchsicht des Manuskripts danken. Dieses Projekt wurde von der DFG und dem Fonds der chemischen Industrie (Zuschüsse Zahlen SFB 1035, Projekt A04 zu SS und Do 187/22 RS) finanziert.

1. Transformation von Agrobakterien in BIFC Konstruiert <ol><li> Klonierung der Konstrukte BIFC <ol><li> Amplify das Gen von Interesse aus einer entsprechenden Vorlage mit Oligonukleotiden, die flankierenden attB-Websites. Führen Sie eine PCR unter Verwendung eines Korrekturlesen-Polymerase. Anpassung der Länge der Wärmebehandlungsschritt, um die Primer-Kombination ausgebildet und die Länge des Verlängerungsschritt gemäß der Fragmentgröße. Überprüfen Sie die PCR-Produkts durch Agarose-Gelelektrophorese und Reinigung durch Verwendung eines PCR Clean-up Kit. </li><li> Führen Sie die BP-Reaktion mit dem erhaltenen Fragment und den Eintrag mit einem Vektor-BP-Rekombinase. Mischen Sie 15 bis 150 ng der attB-PCR-Produkt mit 150 ng des Eintrags Vektor, fügen Sie 2 ul der BP-Rekombinase und füllen sich mit TE-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 8 ul. Inkubieren der Reaktion für 1 h bei RT und Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 2 &amp;mgr; l Proteinase K für 10 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Transformieren Sie die gesamte Reaktions in kompetente E. coli DH5a; Zellen und Screening der erhaltenen Kolonien durch Kolonie-PCR für die korrekte Insertion des DNA-Fragments in den Vektor. DNA-Sequenzierung der positiven Plasmiden durchgeführt, um die Abwesenheit von Mutationen zu überprüfen. </li><li> Verwenden Sie die erhaltenen Entry-Klon für LR Rekombination mit dem entsprechenden Ziel-Vektor mit einem LR-Rekombinase. Mischen Sie 50 bis 150 ng des Eintrags Vektor mit 150 ng des Zielvektor, fügen 1 ul LR-Rekombinase und füllen sich mit TE-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 5 ul. Inkubieren der Reaktion für 1 h bei RT und Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 1 &amp;mgr; l Proteinase K für 10 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Transformieren Sie die gesamte Reaktions in kompetente E. coli DH5a Zellen und Bildschirm durch Kolonie-PCR für die korrekte Einführung des DNA-Fragments in den Vektor erhaltenen Kolonien. DNA-Sequenzierung ist in diesem Schritt nicht erforderlich. </li><li> Isolierung von Plasmid-DNA mit einem Plasmid Mini Kit, um eine hohe Reinheit zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Herstellung von chemisch kompetente Agrobakterien (Stamm AGL1, Rifampicin und Carbenicillin-Resistenz) <ol><li> Streak aus Agrobakterien aus einer Stammkultur wachsen und für 24 Stunden bei 28 ° C. </li><li> Impfen 5 ml LB-Medium mit einer Einzelkolonie beimpft und über Nacht bei 28 ° C </li><li> Beimpfen von 50 ml LB-Medium mit 2 ml der Übernacht-Kultur wachsen und für etwa 4 h bei 28 ° C bis zu einer OD 600 von 1,0. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 3000 × g für 15 min bei 4 ° C und das Pellet in 1 ml sterilisiertem eiskaltem CaCl 2 (10 mM). Halten Zellen auf Eis nach diesem Schritt. </li><li> Aliquots (100 ul) der Zellen, sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 ° C </li></ol></li><li> Transformation von chemisch kompetente Agrobakterien <ol><li> Tauwetter ein Aliquot der zuständigen AGL1 Zellen auf Eis. Hinzufügen 1-2 ug Plasmid-DNA in die Zellen. Inkubation für 5 Minuten auf Eis, 5 min in flüssigem Stickstoff und 5 min bei 37 ° C. Add 600 ul LB-Medium zu den Zellen und sSeehecht bei 650 Upm für 4 Stunden bei 28 ° C. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen für 1 min bei 8.000 xg und den Überstand verwerfen. Das Pellet in 50 &amp;mgr; l der verbleibenden LB-Medium und Platte auf LB-Platten mit den entsprechenden Antibiotika. Verschließen Sie die Platten und Inkubation für 2 Tage bei 28 ° C. Bildschirm Kolonien auf das Vorhandensein des Plasmids durch Kolonie-PCR. </li><li> Impfen eine positive Kolonie in 5 ml LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika und Inkubation bei 28 ° C über Nacht. Mischungs 500 ul der Übernacht-Kultur mit 500 &amp;mgr; l 50% Glycerin sterilisiert und gefrier bei -80 ° C. </li><li> Impfen die Agrobakterien in LB-Medium die entsprechenden Antibiotika enthaltend direkt aus dem Glycerin Lager für transiente Transformation von Tabakblättern. </li></ol></li></ol> 2. Transient Transformation von Tabakblättern <ol><li> Agrobakterien Wachstum <ol><li> Die folgenden Stammlösungen: Acetosyringon (150 mM, lösen sich in 70% EtOH), speichern als Aliquots bei -20 ° C. MES / KOH (0,1 M) pH 5,7, Lagerung bei 4 ° C (Sterilfilter durch einen 0,2 um Filter, um das Bakterienwachstum bei längerer Lagerung zu verhindern), MgCl 2 (1 M) Lager, Lagerung bei RT. </li><li> Beimpfen von 10 ml LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika mit 50 ul der AGL1 Glycerin-Stammkultur, die das Plasmid von Interesse in einer sterilen 50 ml-Röhrchen und Inkubation bei 28 ° C für mindestens 24 Stunden unter Schütteln bei 190 rpm, bis eine OD 600 zwischen 1,0 -2.0 erreicht. </li><li> Zentrifuge Bakterien bei 3.000 × g für 15 min. Das Pellet in frisch gemacht Infiltrationsmedium [MgCl 2 (10 mM), MES / KOH (10 mM) pH 5,7, Acetosyringon (150 uM)] und stellen Sie die Suspension bis zu einer OD 600 von 1,0. </li><li> Die Agrobakterien-Zellen Inkubation in einem Überkopfschüttler für 2 Stunden in der Dunkelheit. Die Zellen können dann zur Infiltration verwendet werden. </li></ol></li><li> Infiltration von Tabakblättern <ol><li> Verwenden Sie dreiWochen alten Tabak (Nicotiana benthamiana) Pflanzen. Wählen Sie mehrere ältere Blätter für Infiltration. </li><li> Mix gleiche Volumina der Agrobakterien Durchführung der Konstrukte von Interesse (jeweils 3 ml). Nehmen Sie eine 5-ml-Spritze ohne Nadel zur Infiltration. Infiltrieren die Zellsuspension vorsichtig in den Tabakblättern durch Betätigen der Spritze auf der Unterseite der Blätter in mehreren Stellen. </li><li> Gießen Sie die Pflanzen und lassen sie in der Dunkelheit für zwei Tage. </li></ol></li></ol> 3. Protoplasten Vorbereitung Protoplasten Herstellung von Tabakblättern wurde von Koop et al. 16 angepasst und leicht modifiziert. <ol><li> Buffer Vorbereitung <ol><li> Vorbereitung F-PCN Medium: Macro-Salze [KNO 3 (1012 &amp;mgr; g / ml), CaCl 2 • 2H 2 O (440 &amp;mgr; g / ml), MgSO 4 • 7H 2 O (370 &amp;mgr; g / ml), KH 2 PO 4 ( 170 pg / ml), NH 4-Succinat [(20 mM, bereiten eine 2 M Lager Solution (Succinat (236 ug / ml) und NH 4 Cl (106 &amp;mgr; g / ml) auf pH 5,8 einstellen zu lösen)], Mikro-Salzen [EDTA-Fe (III) x Na-Salz (40 ug / ml), KJ (0,75 ug / ml), H 3 BO 3 (3 &amp;mgr; g / ml), MnSO 4 • H 2 O (10 &amp;mgr; g / ml), ZnSO 4 • 7 H 2 O (2 ug / ml), Na 2 MoO 4 • 7H 2 O (0,25 g / ml), CuSO 4 • 5 H 2 O (0,025 g / ml), CoCl 2 • 6H 2 O (0,025 g / ml)], MES (390 &amp;mgr; g / ml), Glukose (etwa 80 ug / ml) Osmolarität 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Shop bei -20 ° C </li><li> Vorbereitung F-PIN Medium: Alle Inhaltsstoffe wie F-PCN aber anstelle von Glucose Verwendung Saccharose (etwa 110 ug / ml), Osmolarität 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Shop bei -20 ° C </li><li> Vorbereitung W5-Medium: 150 mM NaCl, 125 mM CaCl 2, 5 mM KCl, 2 mM MES, Osmolarität 550-580 mOsm, pH 5,7 (KOH). Lagerung bei 4 °, C (steril durch einen 0,2 &amp;mgr; m-Filter, um das Bakterienwachstum bei längerer Lagerung zu verhindern). </li><li> Bereiten frischer Enzymlösung für Protoplastenisolierung (0,1 g Cellulase, 0,03 g macerozym in 10 ml F-PIN). Inkubation der Lösung bei 55 ° C für 10 min und Abkühlen auf RT. Füge 100 &amp;mgr; l 10% BSA auf 10 ml Lösung. </li></ol></li><li> Isolation von Protoplasten <ol><li> Legen Sie ein Blatt infiltriert in eine Petrischale, und fügen Sie die frische Enzymlösung. Verwenden Sie eine neue Rasierklinge, das Blatt in ca. 0,5 cm 2 große Stücke geschnitten. Übertragen Sie die Blattstücke mit der Enzymlösung in ein Vakuum-Infiltration-Kolben-und Vakuum infiltrieren für ca. 20 Sekunden, bis die Luftblasen entstehen aus den Blättern (Release-Vakuum sehr vorsichtig). </li><li> Der Kolben wird 90 min bei 40 UpM im Dunkeln. </li><li> Lassen Protoplasten durch Schütteln für 1 min bei 90 Umdrehungen pro Minute. Die Lösung wird durch Gaze (100 uM) in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen (Rundboden). </li&gt; <li> Lagern die Protoplastenlösung mit 2 ml F-PCN-Puffer und Zentrifuge für 10 min bei 70 · g (langsame Beschleunigung und Verlangsamung) bei RT. </li><li> Intakten Protoplasten sammeln sich an der Grenzfläche der Enzymlösung und F-PCN. Nehmen Sie eine große Öffnung 1 ml Pipettenspitze auf die intakten Protoplasten in ein frisches Zentrifugenröhrchen übertragen und füllen sich mit W5-Puffer. Zentrifugieren für 2 min bei 100 xg (langsame Beschleunigung und Verzögerung), um die Protoplasten zu pelletieren. </li><li> Den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und Pellet in ungefähr 200 &amp;mgr; l W5-Puffer, je nach der Menge von Protoplasten. </li><li> Immer breite Öffnung Tipps, Aufbrechen der intakten Protoplasten zu verhindern. </li></ol></li></ol> 4. Laser-Scanning-Mikroskopie <ol><li> Probenvorbereitung <ol><li> Fügen Sie zwei kleine Streifen von Dichtungsmasse um einen Objektträger (2 cm Abstand). Zeigen 20 ul der Protoplastenlösung zwischen den Streifen und vorsichtig ein Deckglasan der Spitze. Die Dichtstreifen um sicherzustellen, dass die Protoplasten nicht durch das Deckglas gequetscht. </li><li> Für Gesamtblattproben schneiden Sie ein Stück von 1 cm aus dem Blatt und legen Sie es auf einen Objektträger mit der unteren Seite des Blattes nach oben. In etwa 30 ul H 2 O, ein Deckglas auf und befestigen Sie sie fest mit Klebeband auf beiden Seiten. </li></ol></li><li> Die konfokale Bildgebung und Mikroskopeinstellungen <ol><li> TCS SP5: Imaging mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop von Leica, Typ durchgeführt. Zur Vergrößerung verwendet eine Objektivlinse (HCX PL APO CS) mit einer Stärke von 63X mit Glycerin als Abbildungsmedium. Stellen Sie die numerische Apertur bis 1,3. Verwenden Sie die Leica Application Suite / Advanced Fluoreszenz-Software für die Auswertung (siehe Zusatzdaten S1). </li><li> Stellen Sie den Argon-Laser bis 30% und die Laserleistung bei 488 nm auf eine Intensität von 18%, um die wiederhergestellten BIFC Signal bei 515 nm zu überwachen und setzen ein PMT-Detektor Emissionsbandbreite von 495 bis 550. </li&gt; <li> Um Chlorophyll Autofluoreszenz überwachen eine zweite PMT-Detektor Emissionsbandbreite von 650 bis 705. </li><li> Zur Überwachung mCherry Signal zu verwenden, die He-Ne-Laser 561, stellen Sie die Intensität des Laser 561-18% und der Emissionsbandbreite eines dritten PMT-Detektor 587-610. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Bilder aller PMT Detektorkanäle sind mit den gleichen Verstärkungseinstellungen (Gewinn sollte zwischen 800-900 sein, um Hintergrundsignale ausschließen) übernommen. </li><li> Nehmen Sie Bilder in einem Format Breite / Höhe von 1024 x 1024 Pixel mit einer Scangeschwindigkeit von 100 Hz. </li><li> Für Z-Tape verwenden einen maximalen Abstand von 0,5 um zwischen jedem Stapel. </li></ol></li></ol>

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	<li>Citovsky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li><li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods Mol. 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U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation.">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199, 193-201 (1996).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Bei der Planung einer BIFC Experiment mehrere Punkte berücksichtigt werden. Obwohl keine strukturelle Informationen über die Proteine ​​von Interesse erforderlich ist, hat der Topologie bekannt sein, wenn mit der Membran überspannenden Proteinen. Die fluoreszierenden Proteine ​​in der gleichen subzellulären Kompartiment befinden oder in die gleiche Seite einer Membran, um die Interaktion zu ermöglichen. Natürlich, wenn die Analyse-Proteine, die eine N-terminale Targeting-Sequenz erforderlich ist, kann nur ...

Studieren die Bildung von Proteinkomplexen und ihre Lokalisation in Pflanzenzellen in vivo ist wichtig, Mobilfunknetze zu untersuchen, Signal-und Stoffwechselprozesse. BIFC ermöglicht die Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen in ihrer natürlichen Umgebung direkt in der lebenden Pflanzenzelle 5.1. Im BiFC Ansatz der Komplementierung von zwei nicht-fluoreszierenden N-und C-terminale Fragmente eines fluoreszierenden Proteins führen zu einem fluoreszierenden Protein rekonstituiert. Fragmente von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen verwendet worden, um Protein-Wechselwirkungen zu detektieren, z. B. das grün fluoreszierende Protein (GFP), von denen das Chromophor chemisch durch drei unterschiedliche Reste 6 gebildet. Fluoreszierende Proteine ​​können in einer Schleife oder ß-Strang in den beiden nicht-fluoreszierenden Fragmente, die beiden Proteine ​​von Interesse fusioniert werden kann führen zu halbieren. Der Test kann verwendet werden, um Wechselwirkungen in jedem Fach vier subzellulärer erkennennt in jedem aerob wachsenden Organismus oder Zellen, die genetisch modifiziert werden können, um die Fusionsproteine ​​zu exprimieren. Wenn die beiden Proteine ​​in enge Nähe innerhalb der Zelle zu kommen, wird die Fluoreszenz wieder hergestellt und kann durch Mikroskopie ohne Zugabe von exogenen Fluorophoren oder Farbstoffe 3 überwacht werden. Tabak (Nicotiana benthamiana) hat sich als praktisch Modellorganismus, um die Wechselwirkung von Pflanzenproteinen zu visualisieren, da Proteine ​​kann leicht durch die Verwendung von Agrobacterium-vermittelten Transformation von Tabakblättern mit den generierten Konstrukte exprimiert werden. Agrobakterien mit einem sogenannten Ti-Plasmid (Tumor-induzierend) für Enzyme, die die Transduktion des Gens in Pflanzenzellen vermitteln Codierung. BiFC ist auch anwendbar für lösliche als auch für Membranproteine ​​in allen zellulären Kompartimenten und wurde erfolgreich in den letzten Jahren verwendet, um interagierende Proteine ​​identifizieren, die in vivo als auch Interaktionsstellen zu analysiereninnerhalb der Proteine ​​7-9. Nach der Expression der eingeführten Gene, kann die Wechselwirkung der fluoreszierenden Proteine ​​direkt in den Blättern sichtbar gemacht werden, was für größere Zellstrukturen, wie dem endoplasmatischen Retikulum (ER), die Plasmamembran oder Chloroplasten. Um aber die Lokalisation in feiner Strukturen zu überwachen, zum Beispiel die Chloroplasten-Umschlag, ist es ratsam, die Fluoreszenz-in-Protoplasten aus transformierten Tabakblättern getrennt visualisieren. Eine Reihe von Vektoren, die BiFC entweder eine C-terminale oder N-terminale fluoreszierende Markierung hat, um die Pflanzen in BiFC Ansatz 10 verwendet werden. Die im Folgenden beschriebenen Protokoll wurde verwendet, um die Interaktion von cytosolischen Hitzeschockprotein 90 (HSP90) mit der Tetratricopeptid repeat (TPR)-Domäne Docking Proteine ​​Toc64 und AtTPR7 Wohnsitz in der Chloroplasten-Außenhülle und dem endoplasmatischen Retikulum, jeweils von 11 bis 13 enthält, zu studieren. Zu diesem Zweck wurde auf die HSP90 Ct verschmolzenerminal Teil SCFP (SCFP C). Das Tag war N-terminal an das Chaperon fusioniert, um die Zugänglichkeit von der C-terminalen MEEVD Bindungsmotiv von HSP90 TPR-Domänen-Klemme zu gewährleisten. Parallel dazu ist der N-terminale Teil von Venus (Venus N) an die zytosolische Domäne des TPR-Domäne Andocken Proteine ​​Toc64 und AtTPR7 jeweils enthaltend fusioniert wurde. Als Negativkontrolle klonierten wir das lösliche C-terminalen Teil des C SCFP ausschließlich die im Cytosol befindet, und ist daher eine geeignete Steuerung. Die fluoreszierenden Markierungen der untersuchten Proteine ​​haben den gleichen Zellabteil zugewandt Nähe und dadurch Auflösen des Fluoreszenzsignals zu ermöglichen. Um die Lokalisierung des rekonstituierten Fluoreszenzsignal ein Markerprotein an eine andere fluoreszierende Markierung fusioniert ist cotransformiert die subzelluläre Lokalisation der Wechselwirkung nachzuweisen bestimmen. Ein ER-Markerproteins fusioniert mCherrry wurde gleichzeitig in den transformiertenBei der ER AtTPR7 14 angeordnet. Die Autofluoreszenz des Chlorophylls diente als Chloroplasten-Marker bei Toc64. Dadurch nicht nur die in vivo Interaktion von Toc64 AtTPR7 und jeweils mit der cytosolischen Chaperone HSP90 in den Tabakblättern direkt überwacht werden, sondern auch die subzelluläre Lokalisation der Wechselwirkung untersucht werden. BIFC ist als Ergänzung zu den anderen Methoden Studium von Protein-Protein-Interaktionen geeignet. Im Vergleich zu Coimmunpräzipitation oder in vitro Pull-down-Experimente, zum Beispiel, haben keine spezifischen Antikörper gegen die Proteine ​​von Interesse vorhanden sein, und die Proteine ​​müssen nicht rekombinant in vitro exprimiert werden, was schwierig sein kann, insbesondere für Membranproteine. Außerdem können auch transiente Interaktionen mit BiFC überwacht werden, da die Proteine ​​durch die Wechselwirkung der kondensierten Fluoreszenzmarkierungen 15 eingefangen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">3&#39;,5&#39;-Dimethoxy-4&#39;-hydroxyacetophenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">D134406</td>
			<td style="width:195px;">Acetosyringone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Cellulase, Onozuka-R10</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">16419</td>
			<td>from Trichoderma viridae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Macerozyme R-10&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">28302</td>
			<td>from Rhizopus sp</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:293px;">GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11789-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11791-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:255px;">27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td>
			<td style="width:147px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:255px;">740609-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-GWVYNE</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-VYNE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:293px;">pDEST-SCYCE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
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protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves

Viele Proteine ​​interagieren transient mit anderen Proteinen oder in Multiproteinkomplexe integriert, um ihre biologische Funktion ausüben. Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC) ist eine in vivo-Methode, um solche Interaktionen in Pflanzenzellen zu überwachen. Im dargestellten Protokoll untersuchten Kandidatenproteine ​​sind, um komplementäre Hälften der fluoreszierenden Proteinen fusioniert und die jeweiligen Konstrukte sind über Agrobacterium-vermittelte Transformation in die Pflanzenzellen eingeführt. Anschließend werden die Proteine ​​in Tabakblättern transient exprimiert und die restaurierten Fluoreszenzsignale können mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop in den intakten Zellen nachgewiesen werden. Dies ermöglicht nicht nur die Visualisierung der Interaktion selbst, sondern auch die subzelluläre Lokalisation der Proteinkomplexe bestimmt werden. Zu diesem Zweck kann Markergene, die eine fluoreszierende Markierung zusammen mit den Konstrukten BiFC koexprimiert werden, wodurch die Visualisierung Zellstrukturen wie ter endoplasmatischen Retikulum, Mitochondrien, dem Golgi-Apparat oder der Plasmamembran. Das Fluoreszenzsignal kann entweder direkt in Blatt-Epidermiszellen oder in einzelnen Protoplasten, die sich leicht aus den transformierten Tabakblättern isoliert werden, können überwacht werden. BIFC ist ideal geeignet, um Protein-Protein-Interaktionen in ihrer natürlichen Umgebung in der lebenden Zelle zu untersuchen. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass der Ausdruck von starken Promotoren gesteuert werden, und dass die Interaktionspartner werden durch Fusion der relativ großen Fluoreszenz-Tags, die mit der Wechselwirkungsmechanismus stören könnte modifiziert werden. Dennoch ist eine ausgezeichnete BIFC ergänzenden Ansatz zu anderen häufig angewendeten Methoden der Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen, wie Coimmunpräzipitation, in vitro Pulldown-Assays oder Hefe-Zwei-Hybrid-Experimenten.

In diesem Beispiel verwendeten wir die BiFC Methode, um die Interaktion des zytosolischen Chaperon Hsp90 mit den Membranproteinen Docking AtTPR7 und Toc64 überwachen. AtTPR7 ist Teil der Sec Translokons und interagiert mit zytosolischen Chaperone, die möglicherweise liefern sekretorischen Präproteinen für post-translationalen Translokation an der ER-Membran. Ebenso Toc64 an der Außenhülle wirkt Chloroplasten in post-translationalen Import durch den Empfang HSP90 assoziiert Chloroplasten Präproteinen. Beide Protei...

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Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Bildung von Protein-Komplexen in vivo kann durch bimolekulare Fluoreszenzkomplementation visualisiert werden. Interaktionspartnern sind, um komplementäre Teile Fluoreszenz-Markierungen geschmolzen und transient in Tabakblättern exprimiert, was zu einem wiederFluoreszenzSignal auf enger Nähe der beiden Proteine.

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

protein-protein-interactions-visualized-bimolecular-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K Aufrufe.  Ludwig-Maximilians-Universität, München.  Bildung von Protein-Komplexen in vivo kann durch bimolekulare Fluoreszenzkomplementation visualisiert werden. Interaktionspartnern sind, um komplementäre Teile Fluoreszenz-Markierungen geschmolzen und transient in Tabakblättern exprimiert, was zu einem wiederFluoreszenzSignal auf enger Nähe der beiden Proteine. 

Serie: Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Forschung

Biologie

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen in Onion Zellen unter Verwendung des Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

In-vivo-Detektion von Protein-Protein-Interaktionen auf Micro-gemusterten Oberflächen

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Zell Elektroschweißmuffe Visualisierte mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluorescence Komplementierung: A High Throughput Quantitative Methode zur Protein-Protein Interaction Study

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...