Wir danken Drs. Steve Berg und Xiaoning Zhang für die 35S:: GFP pGlowbug konstruieren und die Hokensen Promotionsstipendium für CH Research in Z. L&#39;s Labor ist von der US National Science Foundation (IOB0616096 und MCB0744752) unterstützt. ZL wird teilweise durch die University of Maryland Agricultural Experiment Station unterstützt.

I. Plasmidpräparation Die Plasmid-DNA für die Bombardierung verwendet werden, müssen von hoher Reinheit und in einer Konzentration von 500ng/μl oder größer sein. Für BIFC mit zwei Plasmid-Konstrukte, 25 ug jedes Plasmid benötigt. In anderen Worten, sollte molaren Verhältnis von 1:1 der beiden Plasmiden gemischt steigen auf 50 ug Gesamt-Plasmid-DNA zu geben für die Herstellung von Patronen werden. Seien Sie aufmerksam, dass das Hinzufügen mehr DNA als 50 ug kann die Agglomeration der Goldpartikel verursachen und sollten vermieden werden. Kommerziell erhältliche Plasmid-DNA-Extraktion Kits für die Isolierung von Plasmid-DNA zu empfehlen. Plasmid-Vektoren sollte relativ klein wie pUC19. Wir geklont SEU-und LUH-cDNA in pUC19-Spyne und pUC19-SPYCE bzw. 3. Binäre Vektoren für Agrobacterium-vermittelte Transformation sind zu groß und ungeeignet für die Bombardierung. II. Cartridge Vorbereitung Cartridge Vorbereitung beinhaltet das Beschichten Goldpartikel mit Plasmid-DNA und Einlegen in Kunststoffrohren, die anschließend in Zentimeter lange Stücke, die in die Gen-Kanone Patrone Inhaber geladen werden können, wird geschnitten. Cartridge Vorbereitung ist sehr detailiert in einem separaten Jove Artikel 4 beschrieben und ist somit hier nicht beschrieben. Für Bombardierung von Zwiebel-Zellen, empfehlen wir Mischen 50 ug von Plasmid-DNA mit 12,5 mg Goldpartikel pro Präparat, das über Erträge von bis zu 50 Kartuschen mit 1 ug DNA/0.25 mg Gold / Patrone. Jede Patrone ist für einen Schuss. Die Goldpartikel können entweder 0,6 um bzw. 1,0 um Durchmesser (; Biorad Cat # 1652262 oder Cat # 1652263) werden. Wir empfehlen außerdem die Verwendung von 0,5 mg / ml PVP-Lösung für die Patrone Vorbereitung. Für BIFC, kombinieren die beiden Plasmid-DNA eines jeden vermeintlichen Interaktionspartner in der gleichen Patrone Vorbereitung. Nach Patrone Vorbereitung, ist es wichtig, die Patronen durch das Brennen der neu gemacht Patronen in einem Helium-Druck zwischen 150 bis 200 psi in ein Quadrat Parafilm, dass rund eine Petrischale gewickelt ist zu testen. Hiermit wird geprüft, ob die Goldpartikel können effizient aus den Kartuschen angetrieben werden; Sie sollten schwache Goldpartikel auf der Parafilm zu sehen. Dies gibt Ihnen eine Vorstellung von dem Gebiet, dass jeder Schuss deckt. Sie werden feststellen, unterschiedliche Mengen an Gold-Partikel auf den Parafilm an verschiedenen Helium Drücke (bei 150-200 psi Bereich) angetrieben. Wenn es keinen signifikanten Unterschied, wählen Sie den niedrigeren Druck für Bombardement. III. Vorbereitung Zwiebel Gewebe Am Tag der Dreharbeiten, schälen Außenhaut aus einem großen gelben Zwiebeln. Mit einem sauberen und scharfen Rasierklinge geschnitten 4-5 Lagen tief eine rechteckige Fläche von ca. 2 x 8 cm. Nehmen Sie die rechteckige Zwiebel Gewebe, entsorgen Sie die beiden äußeren Schichten, schneiden Sie die restlichen Schichten der Zwiebel in ca. 2x1.5 cm lange Stücke schneiden. Legen Sie die Zwiebel Stücke in einer Petrischale mit Filterpapier (Whatman 3MM Papier in Kreisen geschnitten) angefeuchtet mit sterilem Wasser. Deckel der Petrischale und sie sind bereit zu gehen. IV. Beschuss <ol><li> Legen Sie die Patronen in die weißen runden Patrone Inhaber. Patronen mit verschiedenen Plasmid-Konstrukte sollten in verschiedene Patrone Inhaber geladen werden. Jede Patrone Halter kann bis zu 12 Patronen für 12 Aufnahmen. </li><li> Legen Sie den Akku und die frischen Fass-Liner in der Helios Gene Gun. Stellen Sie sicher, dass sowohl der Lauf-Liner und die Pistole jeweiligen O-Ringe befestigt sind. </li><li> Legen Sie zuerst eine leere Patronenhalterung in die Gen-Kanone, mit der Markierung Nr. 12 auf der Patronenhalterung vor der Spitze der Waffe. Advance-Patronenhalter ein-oder zweimal, um sicherzustellen, dass es richtig eingelegt ist. </li><li> Bringen Pistole an den Heliumtank und passen Druck zwischen 150 bis 200 psi. </li><li> Gehörschutz tragen und Feuer Gewehr ein paar Mal mit den leeren Patronenhalter zu reinigen, die Kammer der Waffe und dafür zu sorgen, dass der Druck stabil ist. </li><li> Entfernen Sie die leere Patrone auf und setzen Sie einen geladenen Patronenhalterung. Schieben Sie die Patronenhalterung, so dass die gewünschte Kassette, Feuer unten positioniert ist (6 Uhr) von den Patronenhalter. Shooting ein Stück Zwiebel hier eine Form von Negativ-Kontrolle für Hintergrundfluoreszenz. </li><li> Legen Sie Zwiebelstücke in der Mitte eines leeren Petrischale mit der inneren Schicht der Zwiebel nach oben zeigt. Rest der Gen-Kanone ist Barrel Liner auf Petrischale und Feuer die Kanone, indem Sie die seitliche Taste, während Sie den Auslöser. Übertragen Sie die bombardiert Zwiebel in eine Petrischale mit feuchtem 3MM Filterpapier. </li><li> Vorschuss an die nächste Patrone und Feuer eine andere Zwiebel Stück. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis vier Minuten vor fünf Stücke von Zwiebeln geschossen werden. Jede Zwiebel Stück ist sofort erschossen. </li><li> Wechseln zu einem anderen Patronenhalter mit Kartuschen mit einem anderen Plasmid oder anderen Plasmid Kombination geladen. Denken Sie daran, den Lauf Liner änderns gut Verunreinigung zu verhindern. Schießen vier vor fünf Zwiebelstücke. </li><li> Nach der Bombardierung wieder alle Zwiebeln Perti Gerichte. Decken Sie die Petrischalen mit Deckel. Wickeln Sie sie mit Parafilm Austrocknen zu verhindern. Inkubieren Sie die Zwiebel Stücke bei Raumtemperatur im Dunkeln für 16-48 Stunden. </li><li> Schalten Sie Gas-und Lösedruck vor dem Abnehmen der Gen-Kanone aus dem Helium-Tank. Lösen Sie den Lauf-Liner, und entfernen Sie den Patronenhalter und der verwendeten (oder neu) Patronen. </li><li> Reinigungskassette Inhaber und Lauf-Liner durch Eintauchen in ein Becherglas mit Seifenwasser. Das Becherglas in einem Ultraschallbad und beschallen für 20 Minuten. Danach gut mit Wasser ausspülen, um alle Seifenreste zu entfernen. Genießen sie in 70% Ethanol für eine Stunde und dann trocknen Sie sie auf Küchenpapier. </li></ol> V. Observation <ol><li> Nach Inkubation bombardiert Zwiebel Stücke für 16-20 Stunden bei Raumtemperatur, können wir beobachten, GFP oder YFP-Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop wie die Zeiss Axio Observer.Z1 in dieser Studie verwendet. </li><li> Verwenden einer Pinzette mit flachen Enden langsam schälen einer einzigen Zellschicht von der inneren Epidermis der Zwiebel (die Schicht, die direkt gegenüber der Pistole während der Bombardierung). Legen Sie die Schale auf einen Tropfen Wasser auf einer Folie. Add Deckglas aber vorsichtig sein, um Blasen zu minimieren. </li><li> Unter Hellfeld des Mikroskops, zunächst für Plasmaströmung überprüfen, um sicherzustellen, dass die Zellen am Leben sind. Dazu setzen die Folie, um das Hellfeld Licht für ein paar Minuten zum Aufwärmen der Zwiebel Gewebe und suchen Sie dann nach bewegten Plastiden. Plasmaströmung ist nicht immer leicht zu sehen, also nicht entmutigen, wenn Sie nicht sehen können erhalten. </li><li> Für Fluoreszenz-Detektion geeignete Anregung und Detektion Filter für GFP oder YFP. Es ist wichtig, negativen Kontrollen, wie Zwiebel Stücke mit einem nicht-fluoreszierenden Plasmid erschossen gehören. Faint gelben Signale können von verwundeten Zellen, Luftblasen oder Verunreinigungen auftreten. Es ist auch wichtig, um positive Kontrollen beinhalten. Ein Plasmid, das konstitutiv exprimierte fluoreszierende Reporter wie 35S:: GFP ist eine ausgezeichnete positive Kontrolle. Visible GFP-Signale von Zwiebel Epidermiszellen (Abbildung 1A, D) zeigte, dass die Patronen, die Zwiebel Gewebe, und die Gen-Kanone feuern richtig vorbereitet und ausgeführt. Anschließend beobachteten wir Wechselwirkungen zwischen SEU-pSPYNE und LUH-pSPYCE in Zwiebelstücke mit Patronen, die eine Mischung von 35S bombardiert: SEU-pSPYNE und 35S:: LUH-pSPYCE DNAs. Faint YFP-Fluoreszenz wurde in Kern nur beobachtet (Abbildung 1 B, E), Angabe der direkten physischen Interaktion zwischen SEU-und LUH, dass die Spaltung YFP-Fragmente zusammengeführt in den Zellkern. Beachten Sie, dass die YFP-Signal von BIFC deutlich schwächer als die GFP-Signal von 35S ist:: GFP. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse In unserer Studie berichteten hier, der 35S:: GFP positive Kontroll-Plasmid abgibt starke Fluoreszenz, die die gesamte Zelle, einschließlich sowohl der Zellkern und Cytoplasma (Abbildung 1A, D) füllt. GFP-Protein ist klein genug, um in den Kern ohne Kernlokalisierungssignal diffundieren. Im Gegensatz dazu sind SEU-und LUH Zwei Arabidopsis Transkriptionsfaktoren zuvor gezeigt, dass in einem Hefe-Zwei-Hybrid-2 wechselwirken. SEU-pSPYNE (SEU, die N-terminale Fragment von YFP fusioniert) und LUH-pSPYCE (SEU, die N-terminale Fragment von YFP fusioniert), die beide zu groß, um in den Zellkern diffundieren, enthalten Kernlokalisierungssignale 2,5. Die YFP Fluoreszenz-Signal in die Zwiebel Zellkern (Abbildung 1 B, E) erkannt an, dass SEU-pSPYNE und LUH-pSPYCE kann in Zwiebel Kerne zu interagieren. Kein Fluoreszenzsignal ist in Zwiebeln mit Plasmid-Mischung aus Vektorplasmid pSPYNE mit der N-terminale Fragment von YFP und LUH-pSPYCE (Abbildung 1C, F) bombardiert erkannt. Die BIFC-vermittelte YFP-Fluoreszenz ist deutlich schwächer als die GFP-vermittelte Fluoreszenz von der 35S:: GFP-Plasmid. In unserer Studie zeigten auch unterschiedliche subzelluläre Lokalisation (vgl. Abbildung 1A mit B). Darüber hinaus ist die Anzahl der fluoreszierenden Zellen signifikant niedriger BIFC, wie BIFC funktioniert nur, wenn beide Partner Plasmide erfolgreich und geben Sie in der gleichen Zwiebel-Zellen exprimiert. <img src="/files/ftp_upload/1963/1963fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Fluorescent (A, B, C) ​​und Hellfeld (D, E, F) Bilder von Zwiebel-Zellen bombardiert mit verschiedenen Plasmid-Konstrukte. (A) und (D), bombardiert Onion Zellen mit 35S:: GFP. GFP diffundiert durch die Cytoplasma und Kern. (B) und (E), Zwiebel-Zellen mit gleichen molaren Mischungen von 35S bombardiert: SEU-pSPYNE (SEU, die N-terminale Fragment von YFP fusioniert) und 35S:: LUH-pSPYCE (LUH fusioniert mit dem C-terminalen Fragment ) Plasmid-DNA. Eine Wechselwirkung zwischen SEU-pSPYNE und LUH-pSPYCE wird von einem fluoreszierenden Kern dargestellt. (C) und (F), bombardiert Eine negative Kontrolle zeigt Zwiebel-Zellen mit Mischungen von Vektor pUC19-Spyne und LUH-pSPYCE plasmids. Keine Fluoreszenz-Signal erkannt wird.

<ol>
	<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).</li><li>Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LEUNIG_HOMOLOG+and+LEUNIG+perform+partially+redundant+functions+during+Arabidopsis+embryo+and+floral+development.">LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development.</a> Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).</li><li>Walter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).</li><li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture.">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEUSS+and+AINTEGUMENTA+mediate+patterning+and+ovule+initiation+during+gynoecium+medial+domain+development.">SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).</li><li>Zhang, X. N., Mount, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+alternatively+spliced+isoforms+of+the+Arabidopsis+SR45+protein+have+distinct+roles+during+normal+plant+development.">Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).</li></ol>

<ol><li> Bei erstmaliger Benutzung, empfehlen wir üben das gesamte Verfahren von Cartridge Vorbereitung auf Beobachtung, mit einem einzigen Plasmid konstitutiv Reporter wie 35S:: GFP oder 35S:: GUS. Wir verwendeten einen 35S:: GFP-Plasmid von Drs. erhalten. Steve Berg und Xiaoning Zhang 6 (Abbildung 1A, D). Das Gen Schuss Patronen, bei RioRad (Cat 165-2244) verkauft werden, sind nicht geeignet für Pflanzen. </li><li> Für BIFC, wird eine zweite positive Kontrolle erforderlich, die sich von zwei bekannten Interaktionspartner, fusion...

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Yellow onion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any supermarket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios Gene Gun</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss, Nikon, Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation (bifc) assay for protein-protein interaction in onion cells using the helios gene gun

Untersuchung von Genfunktionen in verschiedenen Organismen beruht auf Wissen, wie die Genprodukte miteinander interagieren in ihren normalen zellulären Umgebung. Die bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay<sup&gt; 1</sup&gt; Ermöglicht es den Forschern, um Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen sichtbar zu machen und ist zu einem wesentlichen Recherche-Tool. Dieser Test basiert auf der erleichterte Vereinigung von zwei Fragmente eines fluoreszierenden Proteins (GFP), die jeweils um eine mögliche interagierende Protein Partner verschmolzen basiert. Die Interaktion der beiden Proteine ​​Partnern erleichtern würde die Assoziation der N-terminalen und C-terminale Fragment von GFP, was zu Fluoreszenz. Für das Werk Forscher sind Zwiebel Epidermiszellen ein ideales experimentelles System für die Durchführung der BIFC Test wegen der Leichtigkeit, bei der Beschaffung und Vorbereitung Zwiebel Gewebe und die direkte Visualisierung der Fluoreszenz bei minimaler Hintergrundfluoreszenz. Die Helios Gene Gun (BioRad) wird häufig für bombardiert Plasmid-DNA in Zwiebel-Zellen verwendet. Wir demonstrieren den Einsatz von Helios Gene Gun, um Plasmid-Konstrukte für zwei interagierende einführen<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Transkriptionsfaktoren, Seuss (SEU) und LEUNIG Homolog (LUH)<sup&gt; 2</sup&gt; Und die Visualisierung ihrer Interaktionen durch BIFC in Zwiebel epidermalen Zellen vermittelt.

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Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Dieser Artikel veranschaulicht, wie man richtig mit dem BioRad Helios Gene Gun, um Plasmid-DNA in Zwiebel Epidermiszellen einzuführen und wie man für Protein-Protein-Interaktionen in Zwiebel-Zellen auf dem Prinzip der bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) basierter Test

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen in Onion Zellen unter Verwendung des Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

bimolecular-fluorescence-complementation-bifc-assay-for-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

19.5K Aufrufe.  University of Maryland. Dieser Artikel veranschaulicht, wie man richtig mit dem BioRad Helios Gene Gun, um Plasmid-DNA in Zwiebel Epidermiszellen einzuführen und wie man für Protein-Protein-Interaktionen in Zwiebel-Zellen auf dem Prinzip der bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) basierter Test

Serie: Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfektion von Neuronen im Hippocampus

Forschung

Biologie

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed protocol for biolistic transfection of rat hippocampal slices, from the initial preparation of DNA coated bullets to the final shooting of the organotypic slice cultures using a gene gun. Gene gun transfection is an efficient and easy means of transfecting neurons and is especially useful for fluorescently labeling a small subset of cells in tissue slice. In this video, we first outline the steps required to coat gold particles with DNA. We next demonstrate how to line the inside of plastic tubing with the gold/DNA bullets, and how to cut this tubing to obtain the plastic cartridges for loading into the gene gun. Finally, we perform biolistic transfection of rat hippocampal slice cultures, demonstrating handling of the Bio-Rad Helios gene gun, and offering trouble shooting advice to obtain healthy and optimally transfected tissue slices.  

We describe a method for preparing DNA coated gold bullets and demonstrate the use of such bullets to biolistically transfect neurons in cultured hippocampal slices.

Vorbereitung der Gene Gun und Aufzählungszeichen Biolistic Transfektion von Neuronen in Scheiben Kultur

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Eine flüssige Phase Affinity Capture Assay Verwendung von magnetischen Kügelchen, um Protein-Protein Interaktion Studie: Das Poliovirus-Nanobody Beispiel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluorescence Komplementierung: A High Throughput Quantitative Methode zur Protein-Protein Interaction Study

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...