Dieses Protokoll schließt eine technische Lücke in unserer Fähigkeit, ultralange Sequenz-Arrays zu generieren. Es ermöglicht uns, die Genomkomplexität zu untersuchen, die durch aktuelle Kurzleseansätze in der Genomik begrenzt wird. Die Methode ist einzigartig in Leistung, Robustheit, Vielseitigkeit und Integrationspotenzial in vielversprechenden neuen Anwendungen.
Es ist auf verschiedene Materialien anwendbar und kann für verschiedene Instant-Größen moduliert werden. Diese Technik hat begonnen, die klinische Landschaft zu revolutionieren. Sein Diagnose-Nutzen bei wiederholten Expansionsstörungen hat viele aktuelle Mängel überwunden.
Einige Transplantationsregister haben hochauflösende HLA-Typisierung für ein besseres klinisches Ergebnis verwendet. Diese Methoden bieten bisher unzugängliche Langzeitinformationen wie Phasing und komplexe strukturelle Varianz. Gekoppelt mit epigenetischer Auslesung in einem einzigen Test, wird es Präzisionsmedizin ermöglichen.
Es ist ein langes Protokoll mit vielen neuen Techniken und es ist schwer zu wissen, ob es bis zur endgültigen Sequenzierung funktioniert. Ich empfehle, das Laden auf alten Durchflusszellen vor dem Ausführen von Proben zu üben. Mitarbeiter haben gesagt, dass einige Techniken im Vergleich zu kurzgelesenen Ansätzen verwirrend sind.
Insbesondere ist die Extraktion durch die hochwertige, hochmolekulare DNA schonender. Um mit der Extraktion von HMW-DNA zu beginnen, fügen Sie zunächst 200 Mikroliter der Zellsuspension zu 10 MilliliterLysepuffer in einem 50 Milliliter-Rohr hinzu. Dann Wirbel mit der höchsten Geschwindigkeit für drei Sekunden.
Und die Lösung bei 37 Grad Celsius für eine Stunde inkubieren. Am Ende der Inkubation zwei Mikroliter RNS-A in das Lysat geben. Drehen Sie das 50-Milliliter-Rohr vorsichtig, um die Probe zu mischen und bei 37 Grad Celsius für eine Stunde zu brüten.
Nach der Inkubation 10 Milliliter der Phenolschicht phenol-chlor-isoamyl-Alkoholgemischs in das Lysat geben. Und legen Sie das Rohr auf einen Rotator bei 20 U/min für 10 Minuten unter einer Dunstabzugshaube. Nach der Zentrifugation mit Gelröhren den Überstand vorsichtig in ein neues 50-Milliliter-Rohr gießen.
Dann fügen Sie 25 Milliliter eiskaltes 100%Ethanol hinzu und drehen Sie das Rohr vorsichtig von Hand, bis die DNA ausscheidt. Biegen Sie eine 20-Mikroliter-Spitze, um einen Haken zu machen. Mit dem Haken, vorsichtig nehmen Sie die HMW DNA und lassen Sie die Flüssigkeit ab.
Legen Sie die DNA dann in eine 50-Milliliter-Röhre mit 40 Millilitern 70% Ethanol und invertieren Sie die Tube dreimal, um die DNA zu waschen. Um die mechanische Scherbibliothek vorzubereiten, verwenden Sie zunächst eine 100 Milliliter nadelfreie Spritze, um die gesamte DNA anzustreben. Legen Sie dann eine 27-Meter-Nadel auf die Spritze und werfen Sie die gesamte DNA sanft und langsam in die Schale.
Wiederholen Sie dies 29 Mal. Als nächstes fügen Sie 143 Mikroliter der wieder aufgehängten Magnetperlen und 143 Mikroliter des DNA-Reparatur-Reaktionsgemisches zu einem Rohr hinzu. Streichen Sie das Rohr sechsmal, um sanft zu mischen, und legen Sie das Rohr auf einen Rotator bei 20 U/min für 30 Minuten.
Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1000G für zwei Sekunden bei Raumtemperatur, um die Probe zu drehen, und legen Sie das Rohr dann für 10 Minuten auf ein magnetisches Rack. Als nächstes entsorgen Sie den Überstand, während sich das Rohr noch auf dem Rack befindet. 400 Mikroliter des frisch zubereiteten 70%Ethanol hinzufügen.
Warten Sie 30 Sekunden. Und dann entfernen Sie das Ethanol. Zentrifugieren Sie dann das Rohr bei 1000G für zwei Sekunden bei Raumtemperatur, um die Probe herunterzudrehen.
Legen Sie das Rohr wieder auf das Magnetische Rack und entfernen Sie jegliches Restethanol. Das Pellet 30 Sekunden lang lufttrocknen. Als nächstes entfernen Sie das Rohr aus dem magnetischen Rack und fügen Sie 103 Mikroliter T-E Puffer hinzu.
Dann streichen Sie das Rohr sanft, um sicherzustellen, dass Perlen im Puffer bedeckt sind, und legen Sie das Rohr 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf den Rotator. Schließlich legen Sie das Rohr wieder auf das magnetische Rack für 10 Minuten, um die Perlen zu pellet. Verwenden Sie eine P200 Breite Bohrung Spitze, um 100 Mikroliter des Eluats auf ein 0,2 Milliliter Rohr zu übertragen, und fahren Sie mit End-Reparatur dA-Tailing und Adapter Ligation Reaktionen.
Um die Transposase-Fragmentierungs-basierte Bibliothek vorzubereiten, machen Sie zunächst eine DNA-Tagmentierungsreaktion, indem Sie 22 Mikroliter der HMW-DNA, einen Mikroliter von 10 Millimolar Triss, pH 8, mit 0,02%Triton X-100 und 1 Mikroliter der Fragmentierungsmischung zu einem 0,2 Milliliter-Rohr hinzufügen. Als nächstes verwenden Sie eine P200 breite Bohrung Spitze, um die Reaktion sechs Mal zu mischen, und inkubieren bei 30 Grad Celsius für eine Minute, gefolgt von 80 Grad Celsius für eine Minute. Halten Sie bei vier Grad Celsius.
Schließlich verwenden Sie eine P200 Breite Bohrung Spitze, um die Reaktion auf eine 1,5 Milliliter-Rohr übertragen und schnell 1 Mikroliter Rapid-Adapter-Mix hinzufügen. Verwenden Sie eine P200 Breite Bohrung Spitze, um die Reaktion sechs mal zu mischen. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für eine Stunde, und fahren Sie mit der Sequenzierung fort.
Um mit der Sequenzierung zu beginnen, fügen Sie zunächst eine neue Durchflusszelle in einen der Kanäle des Nanopore-Geräts ein. Aktivieren Sie dann in der begleitenden Sequenzierungssteuerungssoftware das Positionsfeld der Durchflusszelle. Wählen Sie den richtigen Durchflusszellentyp aus, und klicken Sie auf den Workflow der Prüfflusszelle.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Test starten, um die QC-Analyse der Durchflusszelle zu starten. Als nächstes, mit einer P1000 Pipette auf 100 Mikroliter eingestellt, ziehen Sie weniger als 30 Mikroliter Puffer zurück, um Blasen aus der Durchflusszelle zu entfernen. Fügen Sie 30 Mikroliter der Grundierungsmischung hinzu, um die Oberseite des Grundierungsports zu bedecken, um Blasen zu vermeiden.
Dann, Pipette 800 Mikroliter der Grundierung mischen in den Grundierungsanschluss, um die Durchflusszelle zu laden. Nehmen Sie die Spitze heraus, wenn es etwa 50 Mikroliter der Grundierungsmischung links, und fügen Sie den Rest der Grundierung Mischung auf der Oberseite des Grundierungsports. Mit einer P1000 Pipette 200 Mikroliter der Grundierungsmischung in die Durchflusszelle geben.
Verwenden Sie dann kurz vor dem Laden eine P200-Pipette, die auf 80 Mikroliter eingestellt ist, um die DNA-Bibliothek sechsmal auf und ab zu pipette. Laden Sie schließlich den Bibliotheksmix drop-weise in die Durchflusszelle durch den Beispielport, und fahren Sie mit der Sequenzierung und der Datenanalyse fort. Die QC-Analyse der DNA, die für den mechanischen Scherenbau bereit war, ergab ein Reinheitsverhältnis von etwa 1,9 von 260 bis 280 und ein Verhältnis von 260 zu 230 von etwa 2,3, was eine gute DNA-Probe zeigte.
Das gleiche Ergebnis wurde mit DNA-ready-for-transposase Fragmentierung-basierte BibliothekKonstruktion gesehen. Die Größenqualitätskontrolle der nadelgeschorenen HMW-DNA durch Pulsfeld-Gelelektrophorese ergab, dass der Großteil der HMW-DNA größer als 50 Kilobasen war. Die Ergebnisse von vier Durchläufen mit der HG00733-Zelle zeigten, dass der N50 einer mechanischen Scherbibliothek kürzer war als eine transposase Fragmentierungsbibliothek.
Außerdem hatten alle vier Läufe über 2300 Lesevorgänge mit einer Länge von mehr als 100 Kilobasen. Die maximale Länge war in den transposase fragmentierungsbasierten Bibliotheken mit ihrer kürzeren Vorbereitungszeit länger als in den mechanischen Scherbibliotheken. Die mechanischen Scherbibliotheken erzeugten mehr Gesamtlesevorgänge im Vergleich zu den transposase fragmentierungsbasierten Bibliotheken, was auf eine höhere Ausbeute hindeutet.
Beide Bibliotheken zeigten eine gleichbleibend hohe Qualität und mehr als 97 % ihrer Gesamtbasen wurden mit dem menschlichen Referenzgenom in Einklang stehen. Die erwarteten Größenverteilungen zeigten, dass alle vier Durchläufe einen großen Anteil an Daten über 50 Kilobasen hatten, während transposase fragmentierungsbasierte Bibliotheken ein höheres Verhältnis von ultralangen Lesevorgängen aufwiesen. Das übergeordnete Ziel ist es, die DNA intakt zu halten, daher ist es wichtig, jeden harten Umgang mit der DNA zu vermeiden.
Ein Schlüsselfaktor, der den Wert der Methode maximieren kann, ist die Berechnungsanalyse. Unser Team hat eine lang gelesene Analysepipeline namens PICKY entwickelt, die eine vollständige Palette von SVs mit hoher Empfindlichkeit erkennen kann. Es wird neue Wege für spannende Bereiche wie die Erkennung komplexer SVs und die schrittweise Umlagerung endes und Modifikationen auf der Ebene einzelner Moleküle eröffnen.
Dies wird unser Verständnis der Genomarchitektur erheblich verbessern. Phenol ist sehr ätzend. Sie müssen damit in einer Dunstabzugshaube mit persönlicher Schutzausrüstung arbeiten, einschließlich Handschuhen, Schutzbrille, Labormantel, lange Hose und Schuhe.
