Die Pyrosequenzierung ist eine Sequenzierungstechnik durch Synthese, die zur Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen in der mitochondrialen DNA verwendet werden kann. Diese Methode zeichnet sich durch ihre einfache Implementierung und Kosteneffizienz im Vergleich zu anderen Sequenzierungsmethoden aus. Es kann leicht als diagnostische Methode für bestimmte mitochondriale Erkrankungen verwendet werden, indem Heteroplasmiewerte pathogener Varianten in der mitochondrialen DNA bestimmt werden.
Besorgen Sie sich zunächst eine mitochondriale DNA-Sequenzdatei für die zu genotypisierende Spezies und bestimmen Sie die Position des Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP). Stellen Sie sicher, dass die verwendete Referenzsequenz die entsprechende Basisnummerierung für die untersuchte Mutation verwendet, damit die Position des SNP leicht identifiziert werden kann. Kopieren Sie 1.000 Basenpaare stromaufwärts und stromabwärts der SNP-Stelle und fügen Sie die abgeschnittene Sequenz in die Primer-Design-Software für die Pyrosequenzierung ein.
Markieren Sie die polymorphe Basis, klicken Sie mit der rechten Maustaste darauf und wählen Sie dann Zielregion festlegen, um die analysierte SNP-Basis als Ziel für den Pyrosequenzierungsassay festzulegen. Klicken Sie auf das Play-Symbol in der oberen rechten Ecke der Benutzeroberfläche, um die Primerauswahl zu starten, und warten Sie, bis die Software automatisch die Primer-Trios, zwei Primer für die Voramplifikation der Template-DNA und den dritten Primer für die Sequenzierung durch die Synthese in der Pyrosequenziermaschine generiert. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Alle Primer-Sets kopieren aus, um alle Primer-Sets beizubehalten.
Öffnen Sie die mit dem Pyrosequenzierer gelieferte Laufsoftware, wählen Sie Neuer Assay und dann die Assay-Vorlage für die Allelquantifizierung aus. Geben Sie die zu analysierende Sequenz in das entsprechende Feld ein, indem Sie die Nukleotide direkt hinter dem Sequenzierungsprimer eingeben. Bezeichnen Sie für die variable Position die beiden möglichen Basen, die durch einen Schrägstrich getrennt sind.
Klicken Sie auf Generate Dispensation Order, und lassen Sie die Software automatisch eine geeignete Reihenfolge für die Nukleotide bestimmen, die in der Sequenzierung durch Synthesereaktion abgegeben werden sollen. Speichern Sie und geben Sie einen Namen für den Assay an. Führen Sie anschließend den Lauf durch, indem Sie die zu analysierende DNA auf 5 Nanogramm pro Mikroliter verdünnen.
Stellen Sie im ersten Durchlauf sicher, dass Sie Proben bekannter Heteroplasmie als Referenz und Wildtypproben einbeziehen. Führen Sie dann eine präsequenzierende PCR von 5 Mikrolitern verdünnter DNA und 25 Mikroliter-Reaktionen unter Verwendung der Amplifikationsprimer und -parameter durch. Um das Datei-Setup auszuführen, wählen Sie New Run in der Pyrosequencer-Software.
Der Pyrosequenzer kann gleichzeitig 48 separate vorverstärkte Reaktionen sequenzieren, wobei ein leeres Quadrat eine einzelne Sequenzierungsvertiefung auf einer Pyrosequenzierungsscheibe darstellt. Laden Sie die Assays, indem Sie mit der rechten Maustaste auf ein Quadrat klicken und Assay laden auswählen. Sequenzieren Sie bei Bedarf bis zu vier separate Assays mit unterschiedlichen Sequenzierungsprimern.
Stellen Sie den Primer-Dosiermodus auf "Automatisch" ein, um jedem für den Lauf verwendeten Sequenzier-Primer automatisch eine Injektionskammer zuzuweisen. Setzen Sie den Laufmodus auf Standard, es sei denn, Sie führen vier verschiedene Arten von Assays auf einer Sequenzierungsscheibe aus. Stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Assays in der Laufvorlagendatei mit der Anzahl der zu amplifizierenden PCR-Reaktionen übereinstimmt.
Speichern Sie dann die Ausführungsdateien auf einem USB-Laufwerk. Um den Pyrosequenzer zu entlüften, drücken Sie die Reinigungstaste auf dem Haupt-Touchscreen des Geräts und reinigen Sie alle Injektoren mit hochreinem Wasser, indem Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm befolgen. Achten Sie beim Einsetzen des Absorberstreifens in die Maschine darauf, dass sich die Enden in der 9-Uhr-Position treffen.
Drücken Sie nach dem Einstecken des USB-Sticks die Sequenztaste, um die zuvor vorbereiteten Ausführungsdateien zu laden. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Gerät, um die Reagenzien bei Bedarf in die entsprechenden Injektoren des Geräts zu laden und zu entlüften. Laden Sie 3 Mikroliter Beads in die Vertiefungen und laden Sie dann 10 Mikroliter jeder zu sequenzierenden PCR-Reaktion in die entsprechende Probe.
Pipettieren Sie auf und ab, um die Probe mit den magnetischen Kügelchen zu vermischen. Achten Sie auf die Anzeige im vorbereiteten Pyrosequenzer, dass die Disc in die Maschine eingelegt werden kann. Schrauben Sie die Plattenhaltemutter ab und richten Sie die eingelegte Probenplatte mit dem Metallstift im Disc-Fach aus.
Sobald die Platte fest in das Plattenfach eingeschraubt ist, starten Sie den Sequenzierlauf, indem Sie die Starttaste auf der Touchscreen-Oberfläche drücken. Sobald der Lauf abgeschlossen ist, entfernen Sie das USB-Laufwerk aus dem Gerät und schließen Sie es wieder an den Computer an, auf dem die Pyrosequenzer-Software ausgeführt wird. Nachdem die neu generierte Ausführungsdatei auf dem USB-Laufwerk angezeigt wurde, doppelklicken Sie auf die Ausführungsergebnisdatei.
Dabei wird automatisch der Luciferase-Output jedes Wells beim Einbau von Nukleotiden analysiert und das interessierende mitochondriale Allel quantifiziert. Suchen Sie nach den Farbwerten, die von der Software basierend auf der Qualität der Lesevorgänge angezeigt werden. Um die Ergebnisse zu speichern, wählen Sie im oberen Fenster Berichte und anschließend Vollständiger Bericht aus, um eine PDF-Datei mit den Pyrogrammen und Ergebnissen aus jedem Bohrloch des Laufs zu erstellen.
Alternativ können Sie die Ergebnisse auch in anderen Formaten auf der Registerkarte Berichte herunterladen. Agarose-Gelelektrophorese einer PCR-Amplifikation unter Verwendung der Amplifikationsprimer aus beiden Sets, die für die m. 3243A>G-Mutation ausgewählt wurden, wie in dieser Abbildung gezeigt.
Het bezeichnet hier die nahezu homoplasmatische m. 3243A>G-Probe, die analysiert werden soll. Ein Vergleich der Leistung beider Primersätze unter Verwendung von Molarennormalen für die Kalibrierung ist in dieser Abbildung dargestellt.
Die Messwerte sind durch die senkrechten gestrichelten Linien gekennzeichnet. Eine lineare X=Y-Funktion wird angezeigt, um zu veranschaulichen, wie nahe jeder der beiden getesteten Assays an einer idealen Messung liegt. Die Namen der Zelllinien auf der X-Achse sind die Namen der verschiedenen Cybrid-Klone, die mit diesem Assay genotypisiert wurden.
Die Ergebnisse der Genotypisierung von vier Cybrid-Klonen unbekannter m. 3243A>G-Heteroplasmie unter Verwendung beider Assays sind hier dargestellt. Die Sequenzierung erfolgte in technischer Ausfertigung.
Hier werden die Genotypisierungsergebnisse von mitochondrialen Zinkfingernuklease-behandelten Zellen zusammen mit unbehandelten und simulierten Kontrollen und die Pyrogramme von zwei MEF-Zellproben-PCR-Replikaten, die zur Generierung der Ergebnisse verwendet wurden, sowie die Wildtyp-Genotypisierungskontrolle gezeigt. Die Pyrosequenzierung kann als Auslese für Gentherapie-Experimente zur Bewertung verschiedener Gentherapie-Technologien in mitochondrialer DNA verwendet werden.
