Name: g2-seq: a high throughput sequencing-based technique for identifying late replicating regions of the genome
Uploaded: 2018-03-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschuss NIH GM117446 an A.B

1. Vorbereitung der Zellen für Flow Cytometry sortieren
<ol><li>15 mL Reagenzgläsern, 8 mL YEPD Brühe enthält, so dass die Kulturen eine Dichte von 5 x 106 bis 1,5 x 107 Zellen pro mL nach Übernachtung Wachstum erreichen zu impfen (siehe Diskussion Hinweis 1).</li>
	<li>Spin-down Hefezellen (1.400 x g, bei Raumtemperatur oder 4 ° C) in eine Schraubkappe Zentrifugenröhrchen 15 mL für 5 min, Zellen in 1,5 mL 70 % igem Ethanol und Transfer nach einem 1,6 mL Microfuge Rohr, lassen diese Sit für 1 h bei Raumtemperatur oder mindestens 3 h auf Eis (Aufschwemmen können gespeichert werden auf unbestimmte Zeit bei 4 ° C) (siehe Diskussionspunkt (2)).</li>
	<li>Spin-down Hefezellen in die Microfuge (14.000 x g, 4 ° C) für 1 min in 1 mL 50 mM Natriumcitrat, pH 7,2, Spin-down (14.000 x g, 4 ° C) für 1 min aufzuwirbeln, Aspirieren überstand, Aufschwemmen in 1 mL 50 mM Natriumcitrat, pH 7,2 , mit 0,25 mg/mL RNAse-Lösung für 1 h bei 50 ° C oder über Nacht bei 37 ° C in Hitze Block oder Wasserbad.</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL Proteinase K-Lösung (20 mg/mL Nukleinsäuretablette in 10 mM Tris pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50 % Gewicht, Volumen Glycerin) und 1 h bei 50 ° c inkubieren</li>
	<li>Spin-down Zellen (14.000 x g, 4 ° C), Aufschwemmen Zellen in 1 mL 50 mM Natriumcitrat, pH 7,2, spin-down (14.000 x g, 4 ° C), überstand mit Vakuum anzusaugen, Aufschwemmen in 1 mL 1 µM grün Nukleinsäure-Stamm Nukleinsäuretablette in 50 mM Natriumcitrat , pH 7,2 und in der Dunkelheit für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, beschallen 2 X für 2 s (Ausgangsleistung 2 Watt).</li>
</ol>(2) Zellsortierung
<ol><li>Mit einer Zelle Sorter, sortieren Zellen nach DNA-Gehalt in Phasen G1, S, "frühen G2" und "späten G2", sammeln von mindestens 1,6 Millionen haploiden Zellen von jedem Zellzyklus-Phase wie in Abbildung 1 (siehe Diskussionspunkt (3)).</li>
	<li>Zellen auf Microfuge Röhren übertragen und spin-down Zellen für 20 min bei 14.000 x g bei 4 ° C in der Microfuge und aspirieren überstand mit Vakuum (das Pellet kann bei-20 ° C eingefroren auf unbestimmte Zeit gespeichert werden, siehe Diskussion Punkt (4)).</li>
</ol>3. DNA-Extraktion und die Vorbereitung der Sequenzierung Bibliotheken
Hinweis: Die folgenden Schritte basieren auf "Protokoll I" in der Hefe Genomic DNA Extraktion Kit (siehe Tabelle der Materialien).
<ol><li>Fügen Sie 120 µL "Verdauung Puffer," eine proprietäre Puffer, der Hefe lytische Enzyme verdauen die Zellwand und 5 µL Hefe lytische Enzym, Aufschwemmen durch aufschütteln und Inkubation bei 37 ° C für 40-60 min ermöglicht.</li>
	<li>Fügen Sie 120 µL "Lysis Buffer," eine proprietäre Puffer, Waschmittel und hart für 10-20 s Wirbel enthält.</li>
	<li>Fügen Sie 250 µL Chloroform - mischen für 1 min.</li>
	<li>Mit Höchstgeschwindigkeit in einem Microfuge für 2 min drehen.</li>
	<li>Laden Sie den Überstand auf der DNA-Bindung Spalte und Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit in eine Microfuge für 1 min.</li>
	<li>Fügen Sie 300 µL "DNA waschen Puffer", ein proprietäres Puffer, Ethanol und Zentrifuge für 1 min bei maximaler Geschwindigkeit in eine Microfuge enthält. Verwerfen der Durchströmung, 300 µL Waschpuffer DNA hinzufügen und wiederholen Sie den Waschvorgang zu.</li>
	<li>Die Spin-Spalte auf ein frisches Microfuge Rohr übertragen, fügen 60 µL Wasser (nicht TE) - 1-3 min warten und dann Zentrifugieren für 10 s, um die DNA zu eluieren.</li>
	<li>Konzentration durch Zugabe von 5 µL DNA zu 195 µL DsDNA-hohe Empfindlichkeit-Reagenz, das verdünnt 1: 200 in DsDNA-hohe Empfindlichkeit-Puffer und dann Fluoreszenz-Maßnahme in einem Fluorometer, mit 10 µL der mitgelieferten Standards für die Kalibrierung wurde zu messen; zwischen 10 und 50 ng der DNA Gesamtausbeute erwarten.</li>
	<li>Beschallen (Peak Vorfall macht 450, Einschaltdauer 30 % Zyklen pro Burst 200, Behandlung Zeit 60 s, Wasserstand 6) DNA in 250-350 bp Fragmente aufzubrechen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Bibliothek mit DNA-Probe Vorbereitungssatz und es (mindestens 10 Millionen 50 bp Einend-gelesen) auf die DNA-Sequenzierung Instrument im Schnellmodus-Sequenz (vgl. Diskussion (5)).</li>
</ol>4. Analyse der Daten und Erstellung von Replikation Sequenzierung Profile
<ol><li>Ausrichten von Saccharomyces Cerevisiae sacCer3 Genom mit Gsnap12 -Sequenzen (siehe Diskussionspapier (6)).</li>
	<li>Bestimmen Sie, dass pro Basenpaar tiefen mit Bedtools "GenomeCoverageBed" Software13lesen.</li>
	<li>Artifizielle Spikes in Lesen Sie tiefen zu entfernen, falls vorhanden (siehe Diskussionspapier (7)).</li>
	<li>Glatten Tiefen von Chromosom mit Mittelstreifen in eine 20 kb Schiebefenster mit "RunMean" Funktion in R Paket "CaTools" gelesen (siehe Diskussionspapier (8)).</li>
	<li>Plot gelesen tiefen in S Phase Anfang G2 und späten G2 als prozentualer Anteil vollständig replizierten lesen Sie tiefen (siehe Diskussionspapier (9)).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time.">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li><li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication.">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li><li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+replication+fork+barrier+at+the+3'+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes.">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li><li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+dynamics+of+the+yeast+genome.">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li><li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity.">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li><li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program.">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li><li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing.">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li><li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+fragile+sites.">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li><li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer.">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li><li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle.">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li><li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences.">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li><li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment:+Enhancements+to+Speed,+Accuracy,+and+Functionality.">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li><li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie.">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , 17 (2010).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li><li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Während diese Technik robust ist und relativ geradlinig, besondere Aufmerksamkeit werden, an folgende gewidmet sollte:
(1) Wir empfehlen, mindestens 12 h Kulturen wachsen, bevor sie Log-Phase erreichen, da Unterschiede im Zellzyklus Distributionen zu manifestieren, wenn Kulturen geerntet werden, nach dem Erreichen der gewünschten Dichte nur 4 h nach der Inokulation. Unsere Annahme ist, dass eine Zellzyklus-Distribution, die ein relativ stabiles Gleichgewicht erreicht hat besser als eine Vert...

Eukaryotische Genom Replikation wird eingeleitet, an mehreren diskreten Standorten, genannt Ursprünge der Replikation, von welchen Replikation Gabeln in beide Richtungen (rezensiert in Fragkos Et Al., 20151) gehen. Ursprünge variieren in ihren Zeitplan und die Effizienz der Zündung und verschiedene Techniken wurden entwickelt, um Replikation Herkunft Aktivitäten überwachen und die Ursachen dieser Unterschiede zu erhellen. Die Aktivität der einzelnen Ursprünge kann aus einsträngiger DNA2, welche Formulare rund um aktive Ursprung abgeleitet werden oder mithilfe von 2D Gelelektrophorese, um spezielle Replikations Zwischenprodukte3zu überwachen, können beide mit erkannt werden radioaktiven Sonden. Beide Techniken sind leichter in S. Cerevisiae als in Säugerzellen, angewendet, da Ursprünge auf bestimmten bekannten Sequenzen in der ehemaligen beschränkt sind. Mit dem Aufkommen von Microarrays wurde es möglich, die Herkunft weltweit brennen zu beurteilen. Dies geschah zunächst durch Kennzeichnung DNA mit schweren Isotopen, Freisetzung von Zellen aus einem G1 in mittlerer mit leichten Isotope und dann die Bildung von schwer-leicht-Hybrid DNA in das Genom4Überwachung. Die Einführung von Hochdurchsatz-Sequenzierung erlaubt ähnliche genomweite Überwachung der Herkunft Aktivität ohne das Erfordernis einer teuren Isotopen Kennzeichnung. Zellen wurden in einem Durchflusszytometer laut DNA-Gehalt und ihre DNA ausgesetzt Tiefe Sequenzierung sortiert. Da Sequenz Abdeckung von 1 X bis 2 X im Laufe der S-Phase verläuft, kann relative Replikation Timing durch Vergleich lesen Sie Tiefen der Zellen in der S-Phase, die in G1 oder G25,6bewertet werden. Diese Techniken, vor allem Hefe, führte zu einem tieferen Verständnis der wie DNA-Sequenz, Chromatinstruktur und DNA-Replikation Proteine Herkunft Timing und Effizienz regulieren.
Treue Übertragung der genetischen Information während der Zellproliferation erfordert nicht nur erfolgreiche Initiation der DNA-Replikation, die stattfindet am Ursprung, sondern auch erfolgreichen Abschluss der Replikation, die auftritt, wo Replikations-Gabeln treffen. Wie die Initiation der Replikation variiert der Zeitpunkt der Fertigstellung der Replikation des Genoms mit bestimmten Regionen bleiben bis spät in den Zellzyklus Langzeittransaktionen. Solche Regionen enthalten Sequenzen oder Chromatin Strukturen, die DNA-Polymerasen behindern oder möglicherweise besonders aktive Replikation Ursprünge fern. Spät repliziert Regionen kann als fragile Sites, manifestieren sich die chromosomalen Bruch und höhere Mutationsraten zugeordnet sind, und haben bei Krebs und Altern7,8,9in Verbindung gebracht. Allerdings hat unser Verständnis von wo und wie dies geschieht trotz der Bedeutung der ordnungsgemäßen Abschluss der DNA-Replikation in der Instandhaltung der Genomstabilität weit hinter der Initiation der Replikation hinterher. Und während einzelner Gene, deren späte Replikation mit Krankheit assoziiert wurde, mit z. B. qPCR10, globale Studien zur Aufklärung der Standorte und die zugrunde liegenden Ursachen der letzten Replikation gefehlt untersucht worden. Hier beschreiben wir eine Technik, die wir uns beziehen, um als "G2 Seq" Wir Durchflusszytometrie mit Hochdurchsatz-Sequenzierung verbinden Aufschluss über die Vollendung des Genoms Replikation in Hefe-11. Mit geringfügigen Änderungen kann dieses Protokoll auf alle Zellen angepasst werden, die Strömung nach DNA-Gehalt sortiert werden können.

<table><tbody><tr><td>YeaStar Genomic DNA kit</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-323</td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;micro;M SYTOX Green</td><td>ThermoFisher</td><td>57020</td><td>resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2</td></tr><tr><td>50 mM sodium citrate, pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase solution (0.25 mg / mL)</td><td>Sigma</td><td>R6513</td><td>0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20&amp;deg;</td></tr><tr><td>proteinase K solution (20 mg / mL)</td><td>ThermoFisher / Invitrogen</td><td>25530-015</td><td>resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Model 50 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50A220</td><td></td></tr><tr><td>BD Biosciences FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Zymo-spin III columns</td><td>Zymo Research</td><td>C1005</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator</td><td>Covaris</td><td>500219</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>15026486</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500 instrument</td><td>Illumina</td><td>SY&amp;ndash;401&amp;ndash;2501</td><td></td></tr><tr><td>gsnap alignment software</td><td>open source software / Genentech</td><td></td><td>http://research-pub.gene.com/gmap</td></tr></tbody></table>

g2-seq: a high throughput sequencing-based technique for identifying late replicating regions of the genome

Zahlreiche Techniken wurden entwickelt, um den Fortschritt der DNA-Replikation durch die S-Phase des Zellzyklus folgen. Die meisten dieser Techniken sind in Richtung Aufklärung des Standortes und der Zeitpunkt der Einleitung des Genoms Vervielfältigung, anstatt seine Vollendung verwiesen worden. Es ist jedoch wichtig, dass wir Regionen des Genoms, die letzten Replikation abgeschlossen sind verstehen, weil diese Regionen erhöhten chromosomalen Bruch und Mutation leiden, und sie im Zusammenhang mit Krankheit und Alterung wurden. Hier beschreiben wir, wie wir eine Technik, die verwendet wurde, um die Replikation Einleitung um stattdessen diesen Regionen des Genoms letzte vollständige Replikation identifizieren überwachen ausgedehnt haben. Dieser Ansatz basiert auf einer Kombination der Durchflusszytometrie und Hochdurchsatz-Sequenzierung. Obwohl dieser Bericht konzentriert sich auf die Anwendung dieser Technik auf Hefe, kann der Ansatz mit beliebigen Zellen verwendet werden, die in einem Durchflusszytometer laut DNA-Gehalt sortiert werden können.

Wir haben wie oben beschrieben vor spät replizierenden Standorte in der angehenden Hefe verwendet. Tests dieser Ansatz mit einer bekannten späten replizierende Region auf ein künstliches Chromosom erwies sich die Technik präzise und zuverlässig sein. Unsere Ergebnisse haben auch gezeigt, die biologische Bedeutung der rechtzeitigen Abschluss der Replikation zeigen, dass eine spätere replizierende Region auf Chromosom 7, die wir identifiziert als späte Replikation auf der Grundlage u...

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G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

Wir beschreiben eine Technik Durchflusszytometrie und Hochdurchsatz-Sequenzierung zu spätere replizierende Regionen des Genoms zu identifizieren, zu kombinieren.

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

g2-seq-high-throughput-sequencing-based-technique-for-identifying

Research

JoVE Journal

Genetics

5.7K Aufrufe.  Fred Hutchinson Cancer Research Center. Wir beschreiben eine Technik Durchflusszytometrie und Hochdurchsatz-Sequenzierung zu spätere replizierende Regionen des Genoms zu identifizieren, zu kombinieren.

Serie: G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Forschung

Genetik

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Genomweite Bestimmung der Mammalian Replication-Timing von Inhaltsmessung DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

<meta charset="utf8"></head><body>2D-Gelelektrophorese zur Analyse der DNA-Replikation und von Fork-Stalling-Ereignissen

Electrophoretic Analysis of Replication Through Structure-Prone DNA Repeats Within the SV40-Based Human Episome

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This protocol describes how to analyze replication fork progression through structure-prone, expandable DNA repeats within the simian virus 40 (SV40)-based episome in human cells. In brief, upon plasmid transfection into human cells, replication intermediates are isolated by the modified Hirt protocol and treated with the DpnI restriction enzyme to remove non-replicated DNA. Intermediates are then digested by appropriate restriction enzymes to place the repeat of interest within the origin-distal half of a 3-5 kb-long DNA fragment. The replication intermediates are separated into two perpendicular dimensions, first by size and then by shape. Following Southern blot hybridization, this approach allows researchers to observe fork stalling at various structure-forming repeats on the descending half of the replication Y-arc. Furthermore, this positioning of the stall site allows the visualization of various outcomes of repeat-mediated fork stalling, such as fork reversal, the advent of a converging fork, and recombinational fork restart.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Charakterisierung der DNA-Replikation pathogener Wiederholungen zur Aufdeckung von Mechanismen des Abwürgens und der Expansion von Replikatio

Here, we outline the procedure for analyzing replication progression through pathogenic, structure-prone repeats using 2-dimensional gel electrophoresis.

Elektrophoretische Analyse der Replikation durch strukturanfällige DNA-Wiederholungen innerhalb des SV40-basierten humanen Episoms

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

Gel-Seq: Eine Methode zur gleichzeitigen Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von DNA und RNA mit Hydrogel Matrizen

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Biotechnik

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

Medizin

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

Ultra-lange lesen Sequenzierung für ganze genomische DNA-Analysen

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

Zusammenfassung

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Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Genomweite Bestimmung der Mammalian Replication-Timing von Inhaltsmessung DNA

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

Elektrophoretische Analyse der Replikation durch strukturanfällige DNA-Wiederholungen innerhalb des SV40-basierten humanen Episoms

Elektrophoretische Analyse der Replikation durch strukturanfällige DNA-Wiederholungen innerhalb des SV40-basierten humanen Episoms

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Gel-Seq: Eine Methode zur gleichzeitigen Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von DNA und RNA mit Hydrogel Matrizen

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

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