Wir danken Mitglieder der Meshorer Labor, vor allem Shai Melcer, Adi Alajem, Edupuganti Raghu Ram, Badi Sri Sailaja, Anna Mattout und Alva Biran, für kritische Anmerkungen und für die Fehlersuche Bleichexperimenten auf einer täglichen Basis. EM ist ein Joseph H. und Belle R. Braun Senior Lecturer in Life Sciences und wird von der Israel Science Foundation (ISF 943/09), das Israel Ministry of Health (6007) der Europäischen Union (IRG-206872 und 238176) unterstützt, die Israel Cancer Research Foundation, die Interne Applikative Medical Grants der Hebrew University und dem Israel Institute Psychobiologie.

1. Plating die ES-Zellen T = 0 Std. MEF plating <ol><li> Bestreichen Sie die Live-Imaging-8-Well-μ-Slides (ibidi; München, Deutschland) mit Gelatine oder in Kammern Deckgläser (Lab-Tek, Rochester, NY) oder in Glas-bottom Kulturschalen (MatTek; Ashland, MA). Lassen Sie für 5-30 min und saugen sich die freie Gelatine. </li><li> Seed 22.000 MEFs / well in 250 ul Gesamtvolumen von DMEM [ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS)]. Lassen Sie Zellen in einer Gewebekultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO2) zu wachsen. </li></ol> T = 6 Std. ES-Zell-Beschichtung <ol start="3"><li> Saugen Sie DMEM. </li><li> Seed jedem MEF gut mit 15.000 R1 Zellen / well in 250 ul Gesamtvolumen von ES-Zell-Medium beschichtet [mit 10% ESC-grade fötales Rinderserum (FBS), 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nicht essentielle Aminosäuren, 0,1 mM β-ergänzt Mercaptoethanol und 1000 U / ml Leukämie inhibierenden Faktor (LIF)], zu erhalten 30% bis 50% Konfluenz des folgenden Tages. </li></ol> 2. Transfektion der ES-Zellen T = 24 Stunden Transiente Transfektion <ol><li> Ersetzen Sie das ES-Zell-Medium mit 250 ul / well frischer ES-Zell-Medien. </li><li> In einer 1,5-ml sterile Reagenzglas, 100 ul serumfreiem Medium [Opti-MEM (Gibco)], dann gibt man 10 ul Transit-LT1 Transfektionsreagenz (Mirus) direkt in die serumfreien Medien. Mix von sanften Pipettieren und Inkubieren bei Raumtemperatur für 5-20 min. </li><li> Add 1,5 ug GFP Plasmid-DNA (H1E, H1o oder HP1), um die verdünnte Transit-LT1-Reagenz. Mix von sanften Pipettieren und Inkubieren bei Raumtemperatur für 15-30 min. </li><li> Add 13,5 ul / Vertiefung der Transfektion Mischung. Schwenken Sie die 8-Well-μ-Slides, um sicherzustellen, gleichmäßige Verteilung. Nach 24 Stunden ersetzen die alten ES-Zell-Medien mit 250 ml frisches ES-Zell-Medien. </li></ol> 3. Performing FRAP und FLIP T = 48-72 Stunden <ol><li> Das Experiment auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) durchgeführt werden können, aber da in einem normalen FRAP / FLIP-Experiment, viele aufeinander folgende Bilder erfasst werden, ist es empfehlenswert, eine Spinnerei-Disk-konfokalen Mikroskop, die Aufnahmegeschwindigkeit ermöglicht den Einsatz und sorgt dafür, dass keine unerwünschte Probe Bleichen wird nach der ersten absichtlichen Bleichen Veranstaltung auftreten. Hier empfehlen wir die Verwendung der Revolution Spinning-Disk-konfokale System (www.Andor.com), mit dem Yokogawa CSU-X drehende Scheibe Kopf. Dieses System hat den doppelten Kapazität photobleach mit Hilfe eines speziellen FRAPPA Modul mit einem Punkt-Scanning-System, und schnell schalten das Licht zurück, um Bilder mit der sich drehenden Scheibe zu sammeln. Die 3 häufigsten fluoreszierende Proteine ​​für photobleaching Experimenten verwendet werden, GFP, YFP und Cherry. Wenn GFP oder YFP verwendet werden, ist ein ~ 488 nm Laser erforderlich. Für Cherry, mit einem ~ 560 nm-Laser. In allen Fällen empfehlen wir die Verwendung von Festkörperlasern. Nach einer automatisierten Bühne ist nützlich, aber nicht erforderlich. Da lebende Zellen abgebildet werden, ist es unerlässlich, eine Klimakammer verwenden (wir verwenden eine von LIS, Schweiz), Controlling Sauerstoff, Feuchtigkeit, CO 2 und Temperatur. FRAP wird mit maximal Laserintensität während Bildgebung mit der minimal Laserleistung erforderlich (in der Regel im Bereich von 10%, wenn Fluoreszenz Niveau angemessen ist) durchgeführt wird. Beachten Sie die Zellen mit fluoreszierenden Licht der geeigneten Wellenlänge, und wählen Sie eine Zelle, die GFP mit einem 60X Ölimmersion. Achten Sie auf richtigen subzellulären Verteilung. Gelegentlich, wenn Ausdruck zu hoch sind, kann das Protein die Lokalisierung &quot;spill &#39;zu anderen Fächern wie der Nukleolus. Solche Zellen sollen nicht angewählt werden. </li><li> Nun setzen Sie ein Imaging-Protokoll: collect 3-5 Frames vor dem Ausbleichen, dann Euchromatin oder Heterochromatin (angesehen als kondensierte GFP Herde) photobleach und sammeln 90-120 Frames nach dem photobleach mit 250-1000 ms Intervallen: H1E-GFP, 1000 ms, H1o und HP1-GFP, 250 ms (Zeitintervall ändert sich je nach Protein Dynamik, wo hochdynamische Proteine ​​erfordern kürzere Intervallzeit). Wir benutzen normalerweise 80-100% Laserintensität für Bleichen mit einem Laserpuls von 20-40 μseconds (1-2 Wiederholungen), aber diese Zahlen können je nach den untersuchten Proteins und der Expression ändern. Wenn Bleichen zweckmäßig ist, sollten Sie beobachten, ein &quot;schwarzes Loch&quot; in Ihrem GFP-Fluoreszenz. Das Schwarze Loch wird allmählich mit Fluoreszenz folgenden Erholung wieder gefüllt. Obwohl die sich drehende Scheibe erhalten bis zu rund 60 Bildern pro Sekunde (mit guten Fluoreszenzintensität und beim Zoomen in eine einzelne Zelle), empfehlen wir nicht mit dem System bei derart hohen Geschwindigkeiten durch niedrige Bildqualität und mögliche erhöhte Phototoxizität. </li><li> Für ein FLIP-Experiment, die Einrichtung eines unterschiedlichen bildgebenden Protokoll: collect 3-5 Frames vor dem Bleichen, starten Sie dann wiederholt an der gleichen Stelle Bleichen beim Sammeln von Bildern. Für H1E-GFP, Bleichmittel alle 5 sec, für H1o-GFP, Bleichmittel alle 2 sec, und für HP1-GFP bleach alle 1 Sek.. Bleichmittel sindd sammeln Bilder immer wieder während des gesamten Experiments. </li><li> Für beide Verfahren, wiederholen Sie den Vorgang auf 20-30 Zellen. Für statistische Zwecke Versuchswiederholung 3 mal oder mehr, vorzugsweise an verschiedenen Tagen. In homogenen Populationen und richtigen Einstellungen, ist die Standardabweichung in der Regel gering (&lt;5%). Für beide FRAP und FLIP, beeinflusst die Größe und Form des gebleichten Region der Erholung Dynamik und bleiben muss innerhalb eines Experiments konstant. Auch, wenn zwei Zellen miteinander verglichen werden, müssen identisch Protokolle verwendet werden und die Zellen müssen nacheinander am selben Tag wie Power-Laser und andere Bedingungen können schwanken, das Ergebnis des Experiments beeinflussen analysiert werden. </li></ol> 4. FRAP und FLIP Data Analysis <ol><li> In allen FRAP Frames gesammelt, messen die Fluoreszenz-Intensität in der ROI (ROI b = gebleichten Bereich), im Hintergrund-Bereich (ROI bg), und die nicht gebleicht nuklearen Bereich (ROI nb) als Funktion der Zeit vor und nach dem Bleichen. Wenn der gebleichten Region vernachlässigbar ist der gesamte Kern kann zur Normierung gewählt werden. </li><li> Für jeden Zeitpunkt, zu normalisieren Daten nach der Formel: (ROI b - ROI bg) / (ROI nb - ROI bg) / (pbROI b - pbROI bg) / (pbROI nb - pbROI bg) bezeichnet pb pre-gebleicht. Für die Vor-Bleiche Bilder, die Sie sollten sich ein Wert von ca. 1. Das erste Bild nach der Bleiche zeigt die Bleach Tiefe. Subtrahiere den Wert von 1 für den eigentlichen Bleach Tiefe Wert. Wiederholen Sie für jede Zelle und durchschnittlich 20-30 Zellen aus jedem Experiment. </li><li> In allen FLIP Frames gesammelt, messen die Fluoreszenz-Intensität in den nicht-nuklearen Bereich gebleicht, und der Hintergrund-Bereich (ROI nb = nicht gebleichten Bereich ROI bg = Hintergrund). Berechnung der FLIP Daten ist vergleichbar mit einem FRAP-Kurve, sollte nur die analysiert ROI (ROI nb) anders sein als die tatsächliche gebleichten Region, die nicht für die Berechnung verwendet wird: (ROI nb - ROI bg) / (pbROI nb - pbROI bg) . Es ist auch möglich, eine benachbarte Zelle (ROI n = Nachbarzelle) zur Normalisierung Zwecke zu verwenden: (ROI nb - ROI bg) / (ROI n - ROI bg) / (pbROI nb - pbROI bg) / (pbROI n - pbROI bg ). Nach der Datenerhebung ist es möglich, an die experimentellen Daten zur Computer-Simulation passen. Dies ermöglicht die Berechnung, mit einer guten Nachbarschaft, der mobilen Fraktion, die immobile Fraktion und die halbmaximale. Wir diskutieren nicht die mathematischen und statistischen Aspekten des FRAP-Analysen hier und verweisen den Leser auf andere hervorragende Publikationen 4-9. Das Bleichmittel Tiefe bezieht sich auf die Entfernung (auf der y-Achse) zwischen der Vor-Bleiche (100%) und das erste Bild nach der Bleiche; die mobile Fraktion bezieht sich auf die Entfernung (auf der y-Achse) zwischen den bleichen Tiefe und das gewonnene Signal, wenn die Kinetik ein Plateau erreicht, und die unbeweglichen Fraktion bezieht sich auf die Entfernung (auf der y-Achse) zwischen den wiederhergestellten Signal und die pre-Bleiche (100%)-Signal (siehe Abb. 1B und 2B). Jenseits dieser Analyse gibt es gute mathematische Modelle, um die Daten passen. Für eine einzelne Exponenten der Gleichung  <img src="/files/ftp_upload/2696/eq0.jpg" alt="Gleichung" width="80" /> wo t die Zeit ist, ist A die mobile Fraktion, 1-A ist die immobile Fraktion und k off ist die Dissoziationskonstante, können verwendet werden, um die Daten angepasst werden und eine direkte Schätzung der Off-Rate der Bindung (k off) kann erhalten, sowie für den Parameter A, die verwendet werden, um den Verein zu berechnen können. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. A und B zeigen repräsentative FRAP-Kurven von HP1 (links), H1o (Mitte) und H1E (rechts) in R1 ES-Zellen. Für Einfachheit und Klarheit Abbildung 1A zeigt die Rohdaten aus einer einzigen Zelle, bevor eine Normalisierung und Berechnung. Die gelbe Kurve entspricht der gebleichten Region entspricht die lila Kurve auf die nicht gebleicht nuklearen Bereich (wenn die gebleichte Region vernachlässigbar ist der gesamte Kern kann zur Normierung gewählt werden), und die rote Linie entspricht der Hintergrundfluoreszenz, die minimal in diesem Fall. Vertical Pfeil stellt die Bleiche Zeit. Normalisierte und gemittelten Daten ist in Abbildung 1B gezeigt. Beachten Sie die langsamere Erholung des H1 (blau) im Vergleich mit HP1 (rot). Auch die H1E Variante (dunkelblau) ist langsamer als die H1o Variante (hellblau). Mobile und immobile Fraktionen und Bleach Tiefe sind für HP1 angegeben. <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. A und B zeigen repräsentative FRAP Kurven verglichen Euchromatin (links) mit Heterochromatin (rechts) von HP1 in R1 ES-Zellen. Ähnlich wie in Abbildung 1, 2A Rohdaten aus einer einzigen Zelle zeigt, gelbe Kurve, die gebleichten Region entspricht, entspricht lila Kurve, die nicht gebleicht nuklearen Bereich, und die rote Linie entspricht der Hintergrundfluoreszenz. Vertical Pfeil stellt die Bleiche Zeit. Normalisierte und gemittelten Daten ist in Abbildung 2B gezeigt. Beachten Sie die langsamere Erholung von Heterochromatin (dunkelrot) im Vergleich mit Euchromatin (hellrot). Mobile und immobile Fraktionen und Bleach Tiefe sind für Euchromatin angegeben. <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3.. Ein typisches FLIP-Experiment von H1o R1 ES-Zellen ist in Abbildung 3A (roh, un-normalisierten Daten) und B (normiert und gemittelt Daten) dargestellt. In diesem Versuch wurde die lila Kurve, die nicht gebleicht nuklearen Bereich entspricht, entspricht die grüne Linie zu einem benachbarten Zellkern und die rote Linie entspricht der Hintergrundfluoreszenz.

<ol>
	<li>Phair, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+nature+of+dynamic+protein-chromatin+interactions+in+vivo:+three-dimensional+genome+scanning+and+dynamic+interaction+networks+of+chromatin+proteins.">Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins.</a> Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).</li><li>Meshorer, E., Girard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. , (2008).</li><li>Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperdynamic+plasticity+of+chromatin+proteins+in+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells.</a> Dev Cell. 10, 105-116 (2006).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , (2009).</li><li>Dundr, M., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+dynamics+of+nuclear+proteins+by+photobleaching.">Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).</li><li>Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+membrane+dynamics+and+reassembly+in+living+cells:+targeting+of+an+inner+nuclear+membrane+protein+in+interphase+and+mitosis.">Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis.</a> J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).</li><li>Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+fluctuation+microscopy+to+reveal+3D+architecture+and+function+in+the+cell+nucleus.">Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus.</a> Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).</li><li>Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+and+kinetic+modeling+in+the+analysis+of+nuclear+protein+dynamics:+what+do+we+really+know.">FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modelling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modelling approaches to in vivo imaging.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).</li><li>Poser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+TransgeneOmics:+a+high-throughput+method+for+exploration+of+protein+function+in+mammals.">BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals.</a> Nat Methods. 5, 409-415 (2008).</li><li>Sigal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+fluorescently+labeled+endogenous+protein+library+in+living+human+cells.">Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells.</a> Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).</li><li>Cohen, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+proteomics+of+individual+cancer+cells+in+response+to+a+drug.">Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug.</a> Science. 322, 1511-1516 (2008).</li></ol>

Anders als die meisten verfügbaren Techniken, die gereinigt Chromatin beinhalten von Zellpopulationen oder fixierten Zellen, FRAP Experimente folgen Änderungen in Chromatin Protein Dynamik in lebenden Zellen. Wir fanden Chromatin Protein Dynamik ein guter Indikator für die Chromatin Plastizität werden. Da es jedoch Absicherung erfordert das Gen von Interesse mit GFP, kann die Zugabe des fluoreszierenden Tag mit der Funktionsweise des Proteins beeinträchtigen. So, bevor Sie fortfahren mit FRAP, muss das Fusionsprote...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5671 </td></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Merck </td><td> 1,04078 </td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Gibco </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> Transit-LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300 </td></tr><tr><td> 8-Well-μ-Slides </td><td> ibidi </td><td> 80826 </td></tr></tbody></table>

photobleaching assays (frap &amp; flip) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) und Fluoreszenz-Loss In Photobleaching (FLIP) ermöglichen die Untersuchung von Protein Dynamik in lebenden Zellen mit guter räumlicher und zeitlicher Auflösung. Hier beschreiben wir, wie FRAP und FLIP-Assays von Chromatin-Proteine, einschließlich H1 und HP1, in embryonalen Maus-Stammzellen (ES-Zellen) durchzuführen. In einem FRAP-Experiment werden die Zellen transfiziert, entweder transient oder stabil mit einem Protein von Interesse mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) oder deren Derivate (YFP, CFP, Kirsche, etc.) fusioniert. In den transfizierten, fluoreszierenden Zellen, Bleichmittel eine intensive fokussierte Laserstrahl einer relativ kleinen Region of Interest (ROI). Die Wellenlänge des Lasers ist nach dem fluoreszierenden Protein für die Fusion eingesetzt ausgewählt. Das Laserlicht irreversibel Bleichmittel das Fluoreszenzsignal der Moleküle in der ROI und unmittelbar nach Bleichen, die Erholung der Fluoreszenz-Signal in den gebleichten Bereich - vermittelt durch den Austausch der gebleichten Moleküle mit dem ungebleichten Moleküle - wird überwacht mit Zeitraffer-Bildgebung. Die erzeugte Fluoreszenz Erholung Kurven geben Auskunft über das Protein der Mobilität. Wenn die fluoreszierenden Moleküle unbeweglich sind, wird keine Fluoreszenz Erholung beobachtet werden. In einem komplementären Ansatz, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), Bleichmittel den Laserstrahl der gleichen Stelle wiederholt und die Signalstärke wird an anderer Stelle in der fluoreszierenden Zellen gemessen. FLIP-Experimente daher messen Signalabfall statt Fluoreszenz Erholung und sind nützlich, um Protein-Mobilität sowie Protein pendelt zwischen zellulären Kompartimenten zu bestimmen. Transient Bindung ist eine gemeinsame Eigenschaft von Chromatin-assoziierten Proteinen. Obwohl die großen Anteil der einzelnen Chromatin-Protein ist an das Chromatin zu einem bestimmten Zeitpunkt in einem stabilen Zustand gebunden ist, ist die Bindung transient und die meisten Chromatin-Proteine ​​haben eine hohe Fluktuation auf Chromatin, mit einer Verweilzeit in der Größenordnung von Sekunden. Diese Eigenschaften sind entscheidend für die Erzeugung hoher Plastizität in der Genom-Ausdruck 1. Photobleaching Experimente sind deshalb besonders nützlich, um Chromatin Plastizität mit GFP-Fusion-Versionen von Chromatin Strukturproteine, insbesondere in ES-Zellen zu bestimmen, wo der dynamische Austausch von Chromatin-Proteine ​​(einschließlich Heterochromatin Protein 1 (HP1), Linker-Histon H1 und Core-Histonen) ist höher als in differenzierten Zellen 2,3.

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Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Wir beschreiben photobleaching Methoden einschließlich Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) und Fluoreszenz-Loss In Photobleaching (FLIP) zu Chromatin Protein Dynamik in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) zu überwachen. Chromatin Protein Dynamik, die als eines der Mittel, um das Chromatin Plastizität zu studieren, ist in pluripotente Zellen verbessert.

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) zu Chromatin Protein Dynamics in Living embryonalen Stammzellen Measure

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

27.0K Aufrufe.  The Hebrew University of Jerusalem. Wir beschreiben photobleaching Methoden einschließlich Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) und Fluoreszenz-Loss In Photobleaching (FLIP) zu Chromatin Protein Dynamik in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) zu überwachen. Chromatin Protein Dynamik, die als eines der Mittel, um das Chromatin Plastizität zu studieren, ist in pluripotente Zellen verbessert.

Serie: Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

Forschung

Biologie

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

Strukturierung von embryonalen Stammzellen mit dem Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

Probing für Mitochondriale komplexe Aktivität in humanen embryonalen Stammzellen

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Einfrieren und Auftauen humanen embryonalen Stammzellen

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

Verwendung LysoTracker zum programmierten Zelltod in Embryonen Erkennen und Differenzieren embryonalen Stammzellen

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Verwendung plusTipTracker Software zum Messen in die Dynamik der Mikrotubuli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wachstumskegel

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...