Wir sind dankbar für finanzielle Unterstützung (Grant Nr. RO2414/5-1 bis KR), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG).

<ol>
	<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Koestler, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+is+essential+for+actin+network+treadmilling+as+well+as+for+targeting+of+capping+protein+and+cofilin.">Arp2/3 complex is essential for actin network treadmilling as well as for targeting of capping protein and cofilin.</a> Mol Biol Cell. 24 (18), 2861-2875 (2013).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> J Cell Sci. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Lai, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+interactions+and+actin+network+turnover+in+lamellipodia.">Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia.</a> EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+lamellipodia+protrusion+is+determined+by+the+extent+of+cytosolic+actin+assembly.">Efficiency of lamellipodia protrusion is determined by the extent of cytosolic actin assembly.</a> Mol Biol Cell. 28 (10), 1311-1325 (2017).</li><li>Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fluorescence+marker+concentration+as+a+probe+of+mobility.">Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility.</a> Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).</li><li>Kremers, G. J., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+purified+fluorescent+proteins+and+dual-probe+optical+highlighting+in+live+cells.">Photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> CSH Protoc. 2008, 4988 (2008).</li><li>Small, J. V., Rottner, K., Carlier, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Actin-based Motility. , (2010).</li><li>Kaverina, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforced+polarisation+and+locomotion+of+fibroblasts+lacking+microtubules.">Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules.</a> Curr Biol. 10 (12), 739-742 (2000).</li><li>Small, J., Rottner, K., Hahne, P., Anderson, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+actin+cytoskeleton.">Visualising the actin cytoskeleton.</a> Microsc Res Tech. 47 (1), 3-17 (1999).</li><li>Mikhailov, A. V., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centripetal+transport+of+microtubules+in+motile+cells.">Centripetal transport of microtubules in motile cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 32 (3), 173-186 (1995).</li><li>Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASP+dynamics+during+lamellipodia+protrusion.">VASP dynamics during lamellipodia protrusion.</a> Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).</li><li>Svitkina, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+filopodia+initiation+by+reorganization+of+a+dendritic+network.">Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network.</a> J Cell Biol. 160 (3), 409-421 (2003).</li><li>Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+of+actin+at+the+leading+edge+of+cultured+cells.">Polarity of actin at the leading edge of cultured cells.</a> Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).</li><li>Dang, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signalling+to+the+Arp2/3+complex+steers+cell+migration.">Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration.</a> Nature. 503 (7475), 281-284 (2013).</li><li>Anderson, K. I., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+dynamics+during+keratocyte+motility.">Contact dynamics during keratocyte motility.</a> Curr Biol. 10 (5), 253-260 (2000).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+potentiates+vaccinia-induced+actin+polymerization+to+facilitate+viral+spread.">Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Kage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMNL+formins+boost+lamellipodial+force+generation.">FMNL formins boost lamellipodial force generation.</a> Nat Commun. 8, 14832 (2017).</li><li>Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+changes+to+the+mechanism+of+cell+locomotion+induced+by+overexpression+of+beta-actin.">Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin.</a> J Cell Sci. 114, 1367-1377 (2001).</li><li>Salmon, E. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+we+discovered+fluorescent+speckle+microscopy.">How we discovered fluorescent speckle microscopy.</a> Mol Biol Cell. 22 (21), 3940-3942 (2011).</li><li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems.">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3571-3584 (2014).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier diskutieren wir wichtige Schritte in die Techniken beschrieben in diesem Artikel, und wie sie für den Einsatz in verschiedenen experimentellen Bedingungen optimiert werden können.
Mikroinjektion ist eine Methode, die angewendet werden kann, um in den Zellen die sofortige Effekte von der Einführung exogene Proteine, Inhibitoren oder Drogen zu überwachen. Es ist besonders vorteilhaft für die Bestimmung der Funktionen der Proteine in schwierig zu transfizieren Zelltypen oder in Situationen, in denen langfristige Ausdruck nicht erwünscht ist. Anzumerken ist, dass die extrazelluläre Matrix Überleben von bestimmten Zelltypen abhängig, die sie auf ausgesät werden. Die Endothelzellen, epithelialen oder Fibroblasten-Like Zelltypen, wie auch kleinen Fisch keratozyten (siehe Dang Et al. 21 und Anderson und Cross22) können erfolgreich injiziert werden. Es gibt jedoch Ausnahmen, wie z. B. B16-F1 Zellen ausgesät auf Laminin, die bilden ein hervorragendes Modellsystem von Zellwanderung, aber sind nicht kompatibel mit Einspritzung auf diese Art von Substrat aus unbekannten Gründen. Für NIH3T3 Fibroblasten-Zellen führen wir regelmäßig Injektionen auf Fibronektin Substrat und zusätzliche Photomanipulation Techniken wie z. B. FRAP (sogar mit photoaktivierungen; für B16-F1 Zellen hier gezeigten) gleich gut in diese Fibroblasten (siehe durchgeführt werden können z. B. Köstler Et al. 3). es muss berücksichtigt werden, dass verschiedene Proteine nach ihrer funktionellen Eigenschaften und das Experiment Ziele unterschiedlich viel Zeit, Veränderungen, variierend von Sekunden bis Stunden dauern können. Ein Vorteil des Verfahrens ist, dass die Dosis/Konzentration von exogenen Agent genauer auf einzelne Zelle als z.B.gesteuert werden kann, wenn Plasmid Transfektion verwenden. Darüber hinaus ist die fluoreszierende Markierung eines Proteins keine Notwendigkeit, um seine Präsenz in der Zelle, garantieren die Flexibilität erhöhen können, wenn eine gleichzeitige Multi-Channel-Visualisierung von anderen Proteinen fluoreszent markiert erforderlich ist. Mikroinjektion ist besonders hilfreich für die Analyse von sofortiger Auswirkungen von bestimmten Proteinen oder Protein-Mischungen auf dynamische Veränderungen der Zellmorphologie oder das Zellskelett (z. B. Dang Et Al. 21 : ein Beispiel für sofortige Auswirkungen auf Migration von der Arp2/3 komplexe Inhibitor Arpin). Ein Nachteil der Technik ist die Invasivität, die Zellschäden verursachen oder Zellmorphologie beeinflussen kann. Daher ist ein wichtiger Aspekt bei der Durchführung von Mikroinjektionen die Zellviabilität Überwachung. Die hier vorgestellte Methode stützt sich auf manuelle Manipulation. Unter Bedingungen getestet, um kompatibel mit erfolgreichen Injektionen, wie z. B. Fibroblasten auf Fibronektin Substrat wachsen ermöglicht hier beschriebene manuellen Injektion-Protokoll eine in der Nähe von 100 % Erfolgsquote; Dies ist unerlässlich, wenn dieser Ansatz kombiniert mit anspruchsvoll und zeitaufwändig Follow-up-Experimente, einschließlich video-Mikroskopie oder FRAP, wie zuvor3veröffentlicht. Dies schließt nicht aus, dass gelegentlich, einzelne Zellen könnte leiden unter einer Mikroinjektion-Veranstaltung, die durch abrupte Kontrast zwischen dem Kern und Zytoplasma, gefolgt von Zelle Rand einfahren sicher erkannt werden kann. Solche seltenen experimentellen Fällen sind ausgeschlossen und somit nicht für weitere Analysen berücksichtigt.
Jedoch ein halbautomatische Ansatz ist auch allgemein verwendet, zum Beispiel mit rapid (< 300 ms) Computer-gesteuerte Nadel absenken deckungsgleich mit Einspritzung Druckanstieg, so dass die Nadel nur über jede Zelle vor der jeweiligen positioniert werden Injektion. Die Erfolgsquote der halbautomatische Injektionen ist definitionsgemäß geringer als das manuelle Methode, die oben beschrieben, einfach weil es für Geschwindigkeit optimiert ist, gefolgt von Analyse mehrerer Zellen, die erfolgreich diese Behandlung überlebt; damit verlassen es nicht auf erfolgreiche Injektion einer einzelnen Zelle. Daher sind im Gegensatz zu einzelnen Zellanalyse, halbautomatische Injektionen besser geeignet für die Analyse der Injektion Effekte aus mehreren hundert Zellen, z. B. durch Videomikroskopie bei kleiner Vergrößerung oder Zelle Fixierung und Färbung. Unabhängig von der detaillierten Ansatz beschäftigt Mikroinjektion stellt keinen Endpunkt-Assay dar, sondern ist kombinierbar mit einer Vielzahl von Techniken, einschließlich FRAP oder photoaktivierungen3.
Bei der Festlegung die Protein-Fluktuationsrate von FRAP, die Intensität des Lasers muss optimiert werden, je nach Mikroskop-Setup und Bildgebung (Vergrößerung, Ziele, etc., sowie der Zelltyp, Struktur und fluoreszierende Protein für Immunofluoreszenz). Beachten Sie, dass bei optimalen Laserleistung, effiziente bleichen mit der geringst möglichen lichtbedingten kombiniert wird zur Vermeidung von Schrumpfung oder komplette Retraktion der Struktur unter Analyse (z. B. Lamellipodia oder Filopodien) oder gar Schäden auf zellulärer Ebene. Im Idealfall sollte mindestens 70 – 80 % der Bleiche Effizienz erreicht werden, obwohl komplett bleichen durch extrem schnelle Umsatz des Proteins, behindert werden kann in dem Fall, etwas mehr als 50 % auch akzeptabel sein könnte. Optimale bleichen macht für eine vorgegebene Struktur und Fluoreszenzfarbstoff experimentell getestet werden sollte, ausgehend von einer geringen Laserleistung seine allmähliche Zunahme gefolgt. Natürlich, jeder Fluoreszenzfarbstoff kann per definitionem gebleicht werden mit Laserlicht in der Nähe von ihren Höhepunkt der Erregung (488 nm für häufig verwendete grüne Farbstoffe wie FITC oder EGFP). Jedoch mit kürzeren Wellenlängen, wie z. B. in der Nähe von UV-Laser, Laser liefern höhere Mächte und können daher auch für effiziente Bleichen von häufig verwendeten Farbstoffe eingesetzt werden. Wir beschäftigen regelmäßig 405 nm Diodenlaser (120 mW) zum Bleichen von EGFP und rot fluoreszierende Farbstoffe (z. B. mCherry), wenn auch mit etwas geringerer Effizienz bei der letzteren (Daten nicht gezeigt). Da die 405 nm-Diode auch für photoaktivierungen der PA-GLP (siehe unten) verwendet werden kann, verleiht es dieses System mit maximaler Flexibilität.
Die B16-F1 Zellstrukturen und fluoreszierende Proteine Photobleached hier wurden 405 nm-Laserleistungen zwischen 65 – 100 mW beantragt. Bei der Analyse einer Photobleached Region ist es wichtig zu prüfen, ob die vorgegebene Struktur in seine ursprüngliche Form über die Analyse Zeitraum erhalten bleibt. Zum Beispiel bei der Analyse der Umsatz von Proteinen an Lamellipodia Spitzen darauf achten ob die Krümmung der Lamellipodia im Laufe der Zeit erheblich verändert wird als Veränderungen in der Krümmung zu ungenauen Ergebnissen führen können, wenn die Region/Kontur analysiert nicht umfassen Sie vollständig die Gesamtheit der Struktur in den einzelnen gemessenen Frames. Darüber hinaus ist darauf hinzuweisen, dass Pakete in Lamellipodia, wie Microspikes, eingebettet in Fluoreszenzintensität Abweichungen verursachen könnten. Wie in Abbildung 2b (weißer Pfeil in 9 s Zeitrahmen) dargestellt, eine Microspike-artige Struktur befindet sich neben der gemessenen Photobleached Region, sondern bleibt während der gesamten Dauer der Messung außerhalb und somit führt nicht zu einer Ungenauigkeit. Für die Analyse von Protein-Umsatz sind wichtige Überlegungen bei der Auswahl der Position und Größe der Regionen analysiert ihre Fluoreszenz im Laufe der Zeit nicht erheblich durch Veränderungen der Zellmorphologie oder Faktoren anders als hart beeinflusst werden sollte, zu vermeiden Erwerb Immunofluoreszenz. Zum Beispiel sollten Strukturen erhebliche quantitative Beitrag der analysierten Struktur nicht aus der gemessenen Region während der Analyse bewegen; Darüber hinaus sollten unabhängige, fluoreszierende Entitäten wie vesikuläre Strukturen, die das Protein anziehen nicht das Feld von Interesse während der Analyse eingeben. Für die Festsetzung des Lamellipodial-Aktin-Polymerisation, sollte darauf geachtet werden, dass keine einziehbaren oder arruffano (d. h. nach oben klappbar) Lamellipodia analysiert werden, da dies die Genauigkeit der Ergebnisse stark beeinflusst. Darüber hinaus Retraktion der Lamellipodial Regionen vorkommen als schnelle rückwärtige Translokation, möglicherweise führend zu Überschätzung der Sätze der Lamellipodial-Aktin-Polymerisation. Eine weitere Überlegung ist die Entfernung der intrazellulären Normalisierung Regionen (genommen als Referenzpunkte für die Korrektur der Erwerb Immunofluoreszenz) von der tatsächlichen Position des Immunofluoreszenz, groß genug, um direkt zu vermeiden sollten beeinflussen Sie, indem Sie den Photobleached-Bereich.
Beim Einrichten der optimaler Bedingungen für photoaktivierungen PA-GFP-Tags Konstrukte sollte darauf geachtet werden, um zu vermeiden, sofort bleichen während der photoaktivierungen. In unserer Arbeit, die besten Ergebnisse wurden mit Laserleistungen 5 - 10 mal niedriger als normal beschäftigte zum Bleichen von EGFP. Für die Bildaufnahme von photoaktiviert Molekülen sollten Belichtungszeit und Zeitintervall zwischen den Frames unter Berücksichtigung der Größe der Regionen und Strukturen photoaktiviert werden optimiert und analysiert, sowie die mögliche Mobilität von photoaktiviert Proteinen subzellulärer Standorte. Für alle Arten von Fluoreszenz-Bildgebung ist Wartung der Zellviabilität entscheidend für den Erhalt der physiologisch relevante Ergebnisse.
Im Prinzip, grün-rot Ladungszustand der fluoreszierende Proteine wie mEos oder Dronpa Varianten12 stellt eine ebenso leistungsfähige Methode der folgenden Dynamik und Umsatz der subzellulären Strukturen wie die Lamellipodium (siehe z.B. Burnette Et al. 23). der Vorteil der letzteren Methode im Gegensatz zu PA-GFP wäre die Möglichkeit, Proteindynamik vor und nach der Konvertierung mit zwei unterschiedlichen Farben, ohne die Notwendigkeit, einen zusätzlichen roten fluoreszierenden Proteins Co auszudrücken zu folgen. Jedoch war in unseren Vorversuchen das Ausmaß der Veränderung von Kontrast und Intensität der Fluoreszenzsignal erreicht bei der photoaktivierungen der PA-GLP größer im Vergleich zu Photoconverted Sonden, vielleicht wegen der überlegenen spektralen Eigenschaften von Grün und rot fluoreszierende Sonden (Daten nicht gezeigt). Auf jeden Fall sind detaillierte Studien über Actin Filament Umsatz in Zellenrand Vorsprünge wie Lamellipodia oder Vaccinia Virus-induzierte Aktin Zahl bisher nur erschienen mit PA-GFP Derivate5,6,24.
Wenn man bedenkt welche Zelle Region um nach photoaktivierungen zu analysieren, mehrere Faktoren sollten berücksichtigt werden, die werden diskutiert, über das konkrete Beispiel gezeigte (Einbau von Actin-Monomere am Rande Zelle nach der Aktivierung in der Zellflüssigkeit), aber kann sicherlich zu den verschiedenen Analog wissenschaftlichen Problemen extrapoliert werden. Erstens bei der Messung der Rate der Lamellipodial Aufnahme von cytosolically photoaktiviert Proteine, zum Beispiel in verschiedenen experimentellen Bedingungen (wie in Dimchev Et Al. gezeigt ( 6), Größen der cytosolischen Regionen und ihre Abstände, Lamellipodial Kanten sollten zwischen experimentellen Gruppen vergleichbar. Es ist auch wichtig zu berücksichtigen, dass wenn Lichtaktivierung cytosolischen Regionen, die Zelle Dicke größer in Positionen näher in den Zellkern. Aktivierung dickere zelluläre Regionen kann in höheren Mengen von aktivierten Proteine führen, angesichts der Tatsache, dass die Verteilung des Proteins aktiviert werden homogen in das Zytosol verteilt wird. Zu guter Letzt können Ausdruck Niveaus des Proteins aktiviert werden in einzelnen Zellen durchaus sehr variabel sein. Aufgrund all dieser Überlegungen der Variabilität unbedingt die Einbeziehung cytosolically aktivierte Proteine an anderer Stelle in der Zelle im Verhältnis zu der gesamten Fluoreszenz erhalten nach der Aktivierung in den einzelnen Regionen vergleichen.
Wir haben beschrieben, wie Mikroinjektion kann als ein Werkzeug für die Untersuchung der Auswirkungen von Proteinen auf Zellmorphologie verwendet werden und haben dies durch den Nachweis der potenten Induktions von Lamellipodial Strukturen in NIH3T3 fibroblastenzellen mikroinjiziert mit veranschaulicht die kleine GTPase Rac1. Bisher haben wir diese Technik, um mit Arp2/3 Funktion in den Zellen mit der WCA C-terminale Domäne der Narbe/WAVE3mikroinjiziert stören eingesetzt. Verschiedene Parameter in mikroinjiziert Zellen können durch andere Tests, wie z. B. FRAP oder photoaktivierungen analysiert werden. Wir haben beschrieben, wie FRAP und photoaktivierungen für die Untersuchung der subzellulären Dynamik und Mobilität von Actin-Monomere eingesetzt werden können. FRAP betätigt wurde von unserer Gruppe vorher5 zu untersuchen, den Umsatz von Proteinen, Lamellipodia, wie z. B. VASP, Abi, Cortactin, Cofilin, Lokalisierung und capping Protein oder für die Aufklärung des Umsatzes der Komponenten in fokalen Adhäsionen in der Gegenwart und Abwesenheit von Rac4-Signalisierung. Darüber hinaus Messraten Aktin-Polymerisation kann durch Immunofluoreszenz EGFP getaggt β-Aktin5erreicht werden, aber alternative Methoden existieren. Tracking fluoreszierende Inhomogenitäten wie live Cell Imaging-kompatiblen Sonden zellulären actinfilamente, z.B. Lifeact25, Kennzeichnung kann auch Erwerbstätige6,26. Der Vorteil hierbei ist, dass die Überexpression des β-Aktin vermieden werden kann, die ist in der Lage Zelle Rand Vorsprung und Migration zu erhöhen und somit potenziell mischt sich mit den spezifischen Assay oder experimentelle Frage (siehe z. B. Kage Et Al. 26; Peckham Et al. ( 27). allerdings ein deutlichen Nachteil der Lifeact Sonde stellt seine rasche ein-/ausschalten Kinetik der Bindung an actinfilamente, so dass Bleichen von Actin Filament Strukturen gekennzeichnet durch Lifeact in Zellen nur über die Sonde Umsatz informiert aber nicht der Umsatz die actinfilamente, es an die25 bindet. Die Verfolgung von Fluoreszenz Inhomogenitäten beschäftigt bereits6,26 bietet einen praktischen Kompromiss, ähnlich zu der weit verbreiteten Verfolgung von Fluoreszenz Flecken integriert filamentösen Zellskelett Strukturen (siehe z. B. Lachs und Waterman28), aber möglicherweise nicht so geradlinig zu verwenden und so präzise wie FRAP EGFP-markierten F-Aktin-Strukturen. Photoaktivierungen wurde von uns für die Schätzung der Preise von Monomeren Aktin Einbindung in hervorstehenden Lamellipodia, sowie seine Mobilität in das Zytosol, im Zusammenhang mit experimentell dran cytosolischen F-Aktin Ebenen6angewendet. Die Technik ist nützlich, wenn Prüfung Mobilität und Verteilung von Proteinen aus relativ großen Flächen, wie cytosolischen Regionen abgeleitet. Allerdings prüft die Verteilung von Proteinen abgeleitet relativ kleine photoaktiviert Strukturen; z. B. Wachstum Zapfen können aufgrund der geringen Anzahl von fluoreszierende Moleküle aktiviert, schwache Signale und damit auch Mangel an Sensibilität schwierig sein. Mögliche alternative Techniken zur photoaktivierungen oder Ladungszustand der Fluoreszenz (siehe oben) können Inverse FRAP, gehören, die auf Immunofluoreszenz die gesamte Zelle außer den ROI setzt, gefolgt durch die Verfolgung der Mobilität von fluoreszierenden Molekülen Weg von dieser Region. Die Technik erfordert keine überexprimierenden Photoactivatable Versionen von Proteinen, aber wird immer Belastung durch eine ungewöhnlich hohe Dosis der Laserleistung, was möglicherweise zu unerwünschten Nebenwirkungen wie lichtbedingten beinhalten.
Klar, kann nicht photoaktivierungen und FRAP unterscheiden, ob Proteine als Monomeren, dimeren oder auch kleine Oligomere in Bewegung sind und ob sie in Kombination mit weiteren Bindungspartner bewegen. Informationen dieser Art erhalten Sie stattdessen von Fluoreszenz Korrelation Spektroskopie Techniken29 oder, alternativ, FLIM-FRET-30. Dennoch bilden FRAP und photoaktivierungen einfache Ansätze, um lokale und globale Proteindynamik in Zellen, unabhängig davon, das Protein des Interesses, subzelluläre Lage oder Zelltyp studierte direkt zu beurteilen.

Überwachung der räumlich-zeitliche Dynamik von Proteinen und anderen Molekülen in lebenden Zellen ist ein wesentliches Instrument in vielen Bereichen der Zell- und Molekularbiologie geworden. Erweiterte Fluoreszenz mikroskopiertechniken einschließlich Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) und Bund-Fluoreszenz Lifetime imaging (Bund-FLIM) oder FRAP, Verlust der Fluoreszenz in Immunofluoreszenz (FLIP) und photoaktivierungen sowie viele andere zulassen für die zeitliche und räumliche Verfolgung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, Konformationsänderungen, sowie die Bestimmung der Kinetik der Diffusion und Lokalisierung von verschiedenen Proteinen in der Zelle1,2. FRAP und photoaktivierungen Techniken sind vor allem für die Prüfung der Regulierungsbehörden der Aktin-Zytoskelett und Zelle Migration allgemein anwendbar. Diese Techniken können allein oder in Kombination mit zusätzlichen Mikromanipulation Techniken wie Mikroinjektion3angewendet werden und beinhalten die Expression von Proteinen eindringmittel beschriftet. Sie ermöglichen die Abschätzung der Kinetik der Verband Protein Aktin-reiche Strukturen Zellwanderung, z. B. Filopodien oder Lamellipodia, der Umsatz der Proteine in fokalen Adhäsionen4beteiligt oder verzweigte Aktin Netzwerke5. Sie ermöglichen auch die Bestimmung der Lamellipodial-Aktin-Polymerisation-Preise, die Bewertung der Dispersion von Monomeren Aktin im Zytosol, die Rate der subzellulären Actin Monomeren Translokation, dadurch actinfilamente im vorstehenden Lamellipodia6und andere Parameter.
FRAP ist eine Methode zur Visualisierung und Quantifizierung der Mobilität von Proteinen innerhalb einer lebenden Zelle, ursprünglich in den 1970er Jahren von Axelrod7entwickelt. Eine Region of Interest (ROI) innerhalb einer Zelle, bevölkert mit fluoreszent-markierten Proteinen ist ein Laser von hoher Intensität, zu bleichen der Fluorophor Moleküle vorhanden in dieser Region einen bestimmten kurzen Zeitraum hinweg führen vorübergehend ausgesetzt. Ungebleicht, eindringmittel beschriftet Proteine befindet sich außerhalb der ROI beim Bleichen, diffuse und die gebleichte Region abhängig von ihrer raumzeitlichen Dynamik, verursacht die Verschiebung der Photobleached Moleküle im Laufe der Zeit zu infiltrieren. Die Rate der Fluoreszenz Wiederaufnahme in gebleichtem Regionen ist abhängig von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich die Größe und die Rate der Verbreitung eines bestimmten Moleküls und natürlich die Fluktuationsrate innerhalb der vermeintlichen gebleichten Struktur verbunden. So lösliche Proteine wird die Erholung der Fluoreszenz in der gebleichten ROI schnell durch Diffusion, während Proteine fest zugeordnete Strukturen wie fokale Adhäsionen zu vermitteln, haben längere Umschlagzeiten, wie deren Fluoreszenz-Erholung wird richten Sie sich sowohl auf die Diffusion der löslichen Fraktion der Protein- und Dissoziation-Verband Kinetik des Bruches Struktur verbunden. Fluoreszenz-Recovery ist in der Regel erworben und quantifiziert, bis das ursprüngliche Niveau der Pre-Bleichmittel Intensität der Fluoreszenz erreicht ist. Allerdings tritt dies nicht auf, wenn ein Teil der ursprünglichen Fluoreszenzintensität gehört zu den sogenannten unbeweglich Fraktion, die nicht durch Diffusion wieder aufgefüllt werden kann oder ist sehr langsam Preisen im Vergleich zu den Großteil der Moleküle bestehend aus mobilen Auffüllen Bruchteil. Zur Bestimmung des Protein-Umsatz, FRAP Kurven erzeugt werden, das Ausmaß der Fluoreszenz-Erholung im Laufe der Zeit darstellt. Aus diesen Kurven Erholung können durchschnittliche zweieinhalbmal Proteingewinnung berechnet werden. Kurve passt der Durchschnittsdaten FRAP, und damit mathematischen Analysen erstellen, ist es auch möglich, abzuleiten, die durchschnittliche Fluktuationsrate der mobilen Fraktion aus einer homogenen Bevölkerung von Molekülen zusammengesetzt ist, ob es besteht mindestens zwei Subpopulationen von Molekülen mit Differential Rate umdrehen. Neben der Schätzung Protein Umsatzraten durch quantitative Ansätze, können verfolgen die Erholung der Photobleached Regionen in Lamellipodia für genaue Quantifizierung von Lamellipodial Motilität Parameter wie retrograde Flow, Vorsprung auch, und Aktin-Polymerisation-Preise. FRAP stellt, ein vielseitiges Werkzeug für die Beurteilung verschiedener Parameter innerhalb der Strukturen lebender Zellen angewendet werden.
Photoaktivierungen ist eine Methode verwendet, um die Verbreitung und die Mobilität der Proteine oder Moleküle, die aus einem bestimmten zellulären Ort verfolgen. Die Technik beschäftigt, zum Beispiel eine Variante des Wildtyp grün fluoreszierendes Protein (GFP), ursprünglich entwickelt von Patterson und Lippincott-Schwartz8, die in einer Art und Weise mutiert ist, mit dem seine Fluoreszenz hoch nach Exposition gegenüber erhöht werden können Ultraviolettes (UV) Licht (rund 400 nm; hier, 405 nm). Wie beschrieben von Patterson Et Al., Wildtyp GFP Chromophore existieren als eine gemischte Bevölkerung von neutralen Phenole und anionischen Phenolates, erzeugen eine große Absorption Peak bei ca. 397 nm und eine kleinere noch 475 nm, beziehungsweise. Bei der Bestrahlung des Proteins mit UV-Licht erfährt die Bevölkerung Ladungszustand, Verschiebung in Richtung der anionischen Form. Wenn begeistert von 488 nm, das Photoconverted/photoaktiviert-Protein stellt eine Erhöhung der 3-fold in Fluoreszenz, nicht ausreichend in der Praxis für die Unterscheidung zwischen aktiviert und nicht GFP aufgrund der hohen intrinsischen Hintergrundfluoreszenz aktivierte. Jedoch wurde eine Abnahme der hintergrundintensität erreicht, durch die Einführung einer einzigen Aminosäure Mutation in der GFP-Sequenz (Histidin Substitution an Position 203). Das daraus resultierende T203H mutierte, auch bekannt als Photoactivatable-GLP (PA-GFP) zeichnet sich durch einen erheblichen Rückgang der Extinktion der kleine Spitze, die bei Bestrahlung mit UV-Licht fast 100fach erhöht wird, wenn anschließend mit 488 nm Licht angeregt. Überexpression von PA-GFP-markierten Proteinen ist eine weit verbreitete Ansatz, der die Bestimmung der Diffusion und Beweglichkeit der Moleküle in den Zellen ermöglicht. Wir haben zuvor PA-GFP-Tags Aktin um festzustellen, die Rate der Dispersion von Actin-Monomere vom cytosolischen Regionen angewendet ermöglicht nicht nur die Erforschung ihrer Mobilität innerhalb der Zytosol, sondern auch ihre Aufnahme Rate in die hervorstehenden Lamellipodial Aktin Netzwerk6. Neuere Literatur beschreibt auch neuartige, Foto-Cabrio Proteine, die im Prinzip in einer analogen Weise verwendet werden können, sondern beherbergen den möglichen Vorteil bereits vor der Foto-Konvertierung sichtbar. Beispiele für diese Gruppe von fluoreszierenden Proteinen sind Dendra2 und mEos29,10,11,12.
In diesem Artikel erklären wir die Methodik der microinjecting Zellen mit Proteinen. Wir erklären weiter, wie diese Technik mit FRAP, durch Immunofluoreszenz Proteine Aktin-Zytoskelett-Verordnung und Motilität, beteiligt kombiniert werden kann und wie FRAP Kurven und Halbzeit der Verwertung von mobilen Fraktionen abgeleitet werden können. Darüber hinaus bieten wir ein Beispiel der Verwendung von der FRAP-Technik Aktin Polymerisation der Lamellipodial Netzwerke bestimmen. Wir bieten auch Anleitungen und Tipps für photoaktivierungen Experimente durchzuführen, die zur cytosolischen Mobilität von Monomeren Aktin und Raten von Aktin Einbindung in Lamellipodia herangezogen werden können. Diese Techniken sind natürlich nicht nur um tracking-Aktin-Zytoskelett-Komponenten, sondern auf potenziell erforderlich moderate Anpassung bzw. Optimierung begrenzt, kann weit angewendet werden um andere Zelltypen oder verschiedene Proteinen, Strukturen, zu untersuchen und Parameter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1617px;" width="1615">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">B16-F1 mouse skin melanoma cells&#160;</td>
			<td style="width:575px;">American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td style="width:167px;">CRL-6323</td>
			<td style="width:511px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">NIH-3T3 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM 4.5g/L glucose&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F-12 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">N8641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum&#160; (FCS)</td>
			<td>PAA Laboratories, Linz, Austria</td>
			<td style="width:167px;">A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Lot054M3396</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glumatine 200mM (100x)</td>
			<td>Life Technolgies</td>
			<td style="width:167px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen-Strep 5000 U/mL</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:167px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin coating buffer&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin from human plasma&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11 051 407 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Jetpei</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">101-10N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">JetPei buffer</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">702-50</td>
			<td>150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PA-GFP-actin plasmid DNA&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>described in Koestler et al.2008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pEGFP-actin plasmid DNA</td>
			<td>Clontech, Mountain View, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Rac1 protein for microinjection</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:365px;">Microinjection buffer</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:365px;">Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope circular cover glasses 15mm, No.1&#160;</td>
			<td>Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">1001/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Femtotips Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">5242 956 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:365px;">Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Grease&#160;</td>
			<td>ACC Silicones, Bridgewater, England</td>
			<td style="width:167px;">SGM494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Microscope: Axio Observer&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoolSnap-HQ2 camera&#160;</td>
			<td>Photometrics, Tucson, AZ</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lambda DG4 light source&#160;</td>
			<td>Sutter Instrucment, Novato, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser source&#160;</td>
			<td>Visitron Systems</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Eppendorf FemtoJet microinjector&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>With built-in compressor for pressure supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Nikon Narishige Micromanipulator system</td>
			<td style="width:575px;">Nikon Instruments, Japan</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Visiview software v2.1.4</td>
			<td>Visitron Systems, Puchheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metamorph software v7.8.10</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Sigma Plot v.12</td>
			<td style="width:575px;">Systat Software Inc.</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators

Prüfung der räumlich-zeitliche Dynamik der Proteine kann ihre funktionale Bedeutung in verschiedenen Kontexten zeigen. In diesem Artikel ist es diskutiert wie fluoreszierende Erholung nach Immunofluoreszenz (FRAP) und photoaktivierungen-Techniken verwendet werden, um die räumlich-zeitliche Dynamik der Proteine an subzellulären Orten zu studieren. Wir zeigen auch, wie diese Techniken einfach Bestimmung verschiedener Parameter verbunden mit Aktin-Zytoskeletts Regulierung und Zelle Motilität zu ermöglichen. Darüber hinaus die Mikroinjektion von Zellen zusätzlich eine alternative Behandlung (möglicherweise vor oder ergänzend zu die vorgenannten Photomanipulation Techniken) Trigger sofortige Wirkungen der translozierten Proteine auf Zelle bezeichnet man als Morphologie und Funktion. Mikromanipulation wie Protein Einspritzung oder lokale Anwendung von Plasmamembran durchlässig Drogen oder Zellskelett Hemmer dienen als mächtiges Werkzeug, um die unmittelbaren Auswirkungen einer bestimmten Behandlung auf Zelle Verhalten auf die einzelne Zelle und subzellulärer erfassen Ebene. Dies ist hier durch sofortige Induktion der Lamellipodial Zelle Rand Vorsprung durch die Injektion von rekombinanten Rac1 Protein veranschaulicht, wie vor einem Viertel Jahrhundert gegründet. Darüber hinaus bieten wir ein Protokoll für die Bestimmung des Umsatzes der erweiterten grün fluoreszierendes Protein (EGFP)-VASP, ein Aktin-Filament-Polymerase prominent an Lamellipodial Spitzen der B16-F1 Zellen ansammeln beschäftigt FRAP und einschließlich der zugehörigen Daten Analyse und Kurvenanpassung. Wir präsentieren auch Richtlinien für die Schätzung der Preise der Lamellipodial Aktin Netzwerk Polymerisation, beispielhaft durch Zellen, die mit dem Ausdruck EGFP getaggt β-Aktin. Zu guter Letzt sind Anweisungen für wie zu untersuchen, die Preise der Aktin-Monomer-Mobilität innerhalb der Zelle Zytoplasma, gefolgt von Aktin Einbau an Standorten von rapid Filament Assembly, wie die Spitzen der hervorstehenden Lamellipodia, mit photoaktivierungen Ansätze. Keines dieser Protokolle ist auf Komponenten oder Regulatoren des Aktin-Zytoskeletts beschränkt, sondern kann problemlos erweitert werden, um in Analog Mode die raumzeitliche Dynamik und Funktion von Proteinen in verschiedenen verschiedenen subzellulären Strukturen oder funktionelle erkunden Kontexten.

Abbildung 1 g h zeigen Phase kontrastreiche Bilder einer NIH3T3 Fibroblasten-Zelle vor und 10 min nach Mikroinjektion von Rac1, die ein kleines Rho-Familie GTPase induzieren Lamellipodia Bildung durch seine Interaktion mit der Welle Komplex fähig ist. Die Zelle wird zuerst vor der Mikroinjektion (Abbildung 1g), visualisiert, um seine Lebensfähigkeit und Morphologie, z. B. Mangel an Lamellipodia zu bestätigen. In 10 min nach Mikroinjektion hat die Zelle deutlich seine Morphologie verändert, dürfte von dieser Behandlung, und zeigt eine erfolgreiche Injektion (Abbildung 1h).
Für Einfachheit und Klarheit bieten wir als nächstes Exemplarische Ergebnisse für FRAP und photoaktivierungen Analyse in Zellen, die nicht zusätzlich mikroinjiziert worden.
Analyse des Umsatzes der VASP EGFP markiert, an der Spitze Lamellipodium zeigt Abbildung 2a-f. Beachten Sie, dass VASP richtet sich darüber hinaus, im Entstehen begriffenen und fokale Adhäsionen, klein und länglich Punkte in die Zelle innen18,19. Die Fluoreszenzintensität einer Lamellipodial Region mit einer klaren VASP Ansammlung an der Spitze war gebleicht und für jeden Zeitrahmen durch Anschluss an die Kontur des ROI vor, während und nach dem Bleichen wie die Lamellipodium nach vorne ragt gemessen. Als gebleichte EGFP-VASP Proteine durch nicht gebleicht Moleküle an diesen Standorten recycelt werden, wird allmähliche Erholung der Fluoreszenz (Abbildung 2b) beobachtet. Die FRAP Erholung Kurve erhalten auf diese Weise und normiert auf die Pre-Bleichmittel Intensität (ausgedrückt als 1) ist in Abbildung 2cersichtlich. Immunofluoreszenz Effizienz kann variieren und etwa 20 % des Wertes vor dem Bleichen in diesem Beispiel, wie aus der Value-at-t0 ermittelt wurde (das erste Bild nach Immunofluoreszenz). Die Zunahme der Fluoreszenz erreicht ein Plateau im Beispiel bei ca. 80 % der Fluoreszenz vor dem Bleichen. In einer statischen Struktur während der zeitliche Verlauf des Experiments, wie z. B. eine fokale Adhäsion nach Wiederherstellung der immobile Bruch (IF, roter Pfeil in Abbildung 2 definiert ist der Unterschied zwischen Pre-Bleichmittel Intensität und die Plateau-Fluoreszenz erreicht c, e), während die Anzahl der Fluoreszenz zwischen dem Zeitpunkt der Bleichen und vollständige Genesung wiederhergestellt wird als mobile Bruch (grünen Doppelpfeil in Abbildung 2C, e) definiert. Beachten Sie, dass in einer dynamisch verändernden Struktur wie die Lamellipodium Tipp hier analysiert, das Ausmaß der IF könnte nicht nur unbeweglich Moleküle, sondern auch eine Reduzierung des Vorsprungs Geschwindigkeit ableiten bekanntlich EGFP-VASP Intensität abhängig Parameter-18. Um die halbe Zeit der Erholung zu berechnen, entstand eine Fit Kurve auf Sigma Plot (Abbildung 2d). In diesem Fall der Wert des Parameters "b" extrahiert von der Lösung der Gleichung 2 ist gleich auf 0.0754, angewendet, bei der logarithmischen Funktion (Gleichung 4) Ergebnisse in einem geschätzten Hälfte-Zeit der Erholung der 9.19 s (Abbildung 2d , ganz rechts Panel), die relativ schnell in dieser bestimmten Zelle im Vergleich zum Durchschnitt ist vorher5veröffentlicht. Beachten ist, dass die Hälfte Wiederherstellungszeiten von Zelle zu Zelle innerhalb der gleichen Bevölkerung manchmal erheblich variieren können. Für repräsentative Ergebnisse zu erhalten, empfehlen wir daher, Bestimmung dieses Parameters als Mittelwert aus mindestens 15-20 Zellen. Zur Veranschaulichung der Grad der Abweichung, arithmetische Mittel der EGFP-VASP Erholung im Durchschnitt aus 15 Zellen für jeden Zeitpunkt waren erzeugt (Abb. 2e) und durchschnittliche Kurve passt erstellt und angezeigt auf analoge Weise (Abbildung 2 ( f).
Die Polymerisation bei der Lamellipodial-Aktin-Netzwerk umfasst die Summe vorwärts Netzwerk Vorsprung und retrograde Strömung. FRAP kann zur Messung der Aktin-Polymerisation-Rate von transfecting Zellen (in diesem Fall B16-F1) mit EGFP getaggt β-Aktin und Immunofluoreszenz einer hervorstehenden Lamellipodial Region (Abbildung 2g) angewendet werden. Für die Analyse der Lamellipodial Aktin Netzwerk Polymerisation bemisst sich die Fluoreszenz-Erholung beim Bleichen von EGFP getaggt β-Aktin im Laufe der Zeit. Als die Polymerisation von Actin Monomeren fortschreitet an den Stacheldraht Enden der Lamellipodial actinfilamente (die alle in Richtung der vorderen20hinweisen), ist das Netzwerk ständig umgesiedelt nach hinten und nach vorn, voran die Preise von denen problemlos durch polarisierte Erholung der Fluoreszenz auf Immunofluoreszenz erhalten. Fluoreszenz-Erholung von der Lamellipodium ist abgeschlossen, sobald die gebleichte Zone erreicht hat, die Übergangszone zwischen der hintere Teil der Lamellipodium und der Lamelle, charakterisiert durch eine geringere Dichte mehr horizontal angeordnet Filament-Bundles sehr viel langsamer als die Beobachtungen in den Lamellipodium umdrehen. Wie in Abbildung 2gdargestellt, kann Fluoreszenz Erholung visualisiert werden, als eine Linie horizontal auf den Rand und fließt nach hinten in Richtung der Lamelle, die ermöglicht die Messung der Entfernungen von Vorsprung und retrograde Strömung (einzeln dargestellt im rechten Bereich von Abbildung 2g als orange und rote Doppelpfeile, beziehungsweise).
Wir haben auch photoaktivierungen in B16-F1 Zellen mit PA-GFP-Aktin, die Mobilität der Actin-Monomere innerhalb der Zellflüssigkeit und die bei ihrer Aufnahme innerhalb von hervorstehenden Lamellipodia verfolgen transfiziert angewandt. Wie in Abbildung 3a, bdargestellt, eine cytosolische Region war photoaktiviert durch die Einwirkung von 405 nm Laser, während Bilder auf die GFP erworben wurden Kanal jeder 1,5 s für die Verteilung der GFP-Tag, photoaktiviert Aktin zu visualisieren. Photoactivated GLP-Aktin ersichtlich aus der cytosolischen Region in Abbildung 3bdiffundieren. Die Rate der Fluoreszenz Intensität Rückgang der cytosolischen photoaktiviert-Region wird als prozentualer Anteil der Anfangsintensität T0 dargestellt (zuerst Rahmen nach photoaktivierungen; Abbildung 3 ( c). Photoaktiviert Aktin integriert auch an den Spitzen der Lamellipodia, wo neue Actin-Monomere, um den wachsenden Stacheldraht enden hinzugefügt werden der actinfilamente während Vorsprung verlängern. Um die Rate der Lamellipodial Einbindung abschätzen zu können, haben wir im Laufe der Zeit einer zweidimensionalen Kontur/Region von etwa 5 µm Breite und 1 µm in Höhe der Fluoreszenzintensität gemessen; die Region war ständig neu positioniert an der Spitze der Lamellipodium als es ragte. Aktin-Aufnahme wurde als Prozentsatz der Fluoreszenzintensität der cytosolischen Region T0 photoaktiviert vertreten (Abbildung 3-d). Mit fortschreitender Dehnung der actinfilamente flossen neue Actin-Monomere Lamellipodial vorne. Ein Bruchteil dieser Actin-Monomere wurde der cytosolischen Pool stochastisch abgeleitet wo Monomere photoaktiviert waren. Dadurch wird die rasche Zunahme der Fluoreszenz in Lamellipodia in den ersten 20 s nach photoaktivierungen. Als neue Monomere zu Lamellipodial vorne, zuvor eingebaute Actin Monomeren Strömung mit Fäden in Richtung der Lamelle durch retrograde Strömung hinzugefügt werden. Im Laufe der Zeit der ROI ist komplett gefüllt mit fluoreszierenden Monomeren und ein Plateau in Fluoreszenz ist erreicht (Abbildung 3-d). Ein allmählicher Rückgang der Fluoreszenz ist dann beobachtet, wenn Diffusion von photoaktiviert Monomere in der Zelle nach werden nicht photoaktiviert-Aktin-Monomere zunehmend Lamellipodial vorne neu hinzugefügt. Diese Abnahme der Fluoreszenz finden ein neues Plateau erreicht wird, sobald ein Gleichgewicht in der gesamten Zelle zwischen photoaktiviert und nicht photoaktiviert Monomere (Daten nicht gezeigt) erreicht ist.
Die Mobilität der Actin-Monomere in der Zellflüssigkeit wurde durch die Messung der Fluoreszenz-Intensitäten in Regionen gleicher Größe positioniert nach distal aus der photoaktiviert Region (wie auf Abbildung 3eine farbcodierte Regionen mit der Bezeichnung abgeleitet R1-R5). Wie in Abbildung 3edargestellt, Fluoreszenzintensität in jeder dieser Regionen sinkt schrittweise Weg von der cytosolically photoaktiviert Region, als der Anteil der photoaktiviert-Aktin-Monomere wird zunehmend verdünnt mit nicht aktivierte (d. h. nicht-fluoreszierende) Monomeren. Darüber hinaus ist der Höhepunkt der Fluoreszenz später erreicht: je weiter entfernt die gemessenen Region liegt aus der photoaktiviert Region, je länger die Zeit, die erforderlich für Actin-Monomere in diesen Regionen verbreiten. Ein repräsentativer Wert für den Grad der Aktin-Monomer-Infiltration in jeder Region kann abgeleitet werden, durch Quantifizierung der Hälfte der Zeit die Fluoreszenz-Plateau zu erreichen. Je weiter entfernt der Region, desto länger dauert es für die photoaktiviert-Aktin hinein diffundieren und somit mehr Zeit wird benötigt für das fluoreszierende Plateau erreicht werden, letztlich zu einem höheren t1/2 Wert (Abbildung 3e).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig1.jpg"> Abbildung 1 : Imaging-Kammer Montage- und Mikroinjektion Verfahren. (ein) Imaging-Kammer-Komponenten. (b) Silikon Fett ist sorgfältig um die Öffnung der Kunststoff Versiegelung verschmiert. (c) das Deckglas befindet sich mit der Zelle-Seite nach oben in die Mitte der bildgebenden Kammer öffnen. (d) eine sichere Abdichtung ist durch die Positionierung der Kunststoff Versiegelung auf dem Deckglas und durch Anziehen der Spannpratzen etabliert. (e) Mikroskopie Medium ist in den Schlitz der Kammer pipettiert. (f) der bildgebenden Kammer befindet sich auf dem Mikroskoptisch, Wärmemelder und Elektroden sind mit einer Heizeinheit auf 37 ° C voreingestellt verknüpft und Zellen dürfen für mindestens 30 min anzupassen, bevor Mikroskopie ausgelöst wird. In diesem Beispiel Mikroskoptisch ist ausgestattet mit einem Mikromanipulator für die Durchführung von Mikroinjektionen und die Mikroinjektion Nadel wird in das Medium der Zelle Deckschicht in der bildgebenden Kammer eingetaucht. (g) An NIH3T3 Fibroblasten-Zelle wird durch Phasenkontrast-Mikroskopie vor Mikroinjektion visualisiert. Das Rote Kreuz in das Fach perinukleäre gibt den Speicherort der die zukünftigen Mikroinjektion, das entspricht einer hohen zytoplasmatischen Region aufgrund der Nähe zu den sperrigen Kern. (h) 10 min nach Mikroinjektion mit Rac1, reagiert die Zelle durch prominente Bildung von Lamellipodia rund um die gesamte Zelle Peripherie (gekennzeichnet durch grüne Pfeile). <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig2.jpg"> Abbildung 2: FRAP ermöglicht die Bestimmung von Protein-Umsatz oder Lamellipodial-Aktin-Polymerisation Tarife. (einem) Vertreter Beispiel B16-F1-Zelle mit dem Ausdruck EGFP-VASP vor Immunofluoreszenz einer Lamellipodial Region, wie angegeben. Verschiedenfarbige Konturen/Formen sind beschriftet, um anzugeben, welche Regionen für Fluoreszenz-Intensität-Messungen im Laufe der Zeit galten. Hinweis Die rote Kontur mit einem Ausrufezeichen versehen, die eine cytosolische Region befindet sich in einer Gegend mit mehreren Vesikel und Zelle Oberfläche Rüschen Etiketten gekennzeichnet. Dynamische Bereiche wie diese sollte für die Auswahl von Regionen der Fluoreszenz Referenz vermieden werden, da sie von starken kurzfristigen Schwankungen der Fluoreszenz, was möglicherweise zu ungenauen Ergebnissen gekennzeichnet sind. (b) Lamellipodial Region der EGFP-VASP mit dem Ausdruck ihrer Zelle vor und nach Immunofluoreszenz. Die Erholung der Fluoreszenzsignal nach Immunofluoreszenz innerhalb der Region in lila markiert ist über einen Zeitraum visualisiert. Pfeil zeigt die Spitze des einen Microspike angereichert für VASP wahrscheinlich aufgrund der hohen Dichte der actinfilamente polymerisierenden dort19. (c) ein Beispiel für ein FRAP Erholung Kurve als abgeleitet Quantifizierung der fluoreszenten Intensität der Photobleached Lamellipodium (violette Kontur) in b rot und grüne Linien auf der rechten Seite zeigen bzw. unbeweglich und mobile Brüche. (d) A passt der FRAP Erholung Kurve in c (links) und ein Beispiel für die Berechnungsmethode verwendet, um die Hälfte Erholungszeit (Rechte Abbildung) abzuleiten. (e) ein Beispiel für eine Erholung der FRAP-Kurve abgeleitet von durchschnittlich die Fluoreszenz Erholung Kurven 15 Zellen mit SEM-Bars, den Grad der Variabilität innerhalb der Probe-Population. (f) eine Kurve Passform abgeleitet von durchschnittlich FRAP Erholung Kurve Fits 15 Zellen (links) und ein Beispiel für die Berechnungsmethode verwendet, um die Hälfte Erholungszeit (Rechte Abbildung) abzuleiten. (g) Zeitraffer Platten der überstehenden Lamellipodium einer B16-F1-Zelle mit dem Ausdruck EGFP getaggt β-Aktin, vor und nach dem Bleichen von einer Lamellipodial Region wie angegeben, durch Fluoreszenz-Erholung in der Lamellipodium im Laufe der Zeit folgten. Auf dem rechten Panel Messwerte Protrusion und retrograde Strecken stehen zur Verfügung (in Orange und rot, beziehungsweise). Berechnungen unter der Bild-Tafeln zeigen, wie die Summe der Vorwölbung und retrograde Entfernungen werden verwendet, um die Polymerisation Rate von Lamellipodial Aktin Netzwerk ableiten. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig3.jpg"> Abbildung 3: Photoaktivierungen PA-GFP-Aktin für Monomer tracking in die Zelle. (ein) A repräsentatives Beispiel einer B16-F1-Zelle mit dem Ausdruck PA-GFP-Aktin vor photoaktivierungen in einer cytosolischen Region auslösen, wie durch den roten Kreis (PA) angegeben. Verschiedenfarbige Konturen sind beschriftet, um anzugeben, welche Regionen für Fluoreszenz-Intensität-Messungen im Laufe der Zeit galten. (b) eine Darstellung der zeitlichen Verteilung der PA-GFP-Aktin Folgendes photoaktivierungen. Beachten Sie die schrittweise Verringerung der Fluoreszenz in der photoaktiviert, cytosolischen Region (roter Kreis), wie die photoaktiviert-Aktin davon diffundiert. Aufgrund ihrer Verbreitung auf der Vorder- und Montage in das Netzwerk sind Aktin-Monomere photoaktiviert allmählich in Lamellipodia (Cyan Region) und in der Zellflüssigkeit (verschiedene farblich gekennzeichneten Regionen) auf Distanz und Zeit-abhängige Weise verbessert. (c) Vertreter, zeitliche Abnahme der Fluoreszenz in der photoaktiviert cytosolischen Region (rote Kontur in b). (d) zeitliche Änderungen in Fluoreszenzintensität in der Lamellipodial Region (Cyan Kontur in b). (e) Kurven repräsentativ für die zeitlichen Veränderungen in der Fluoreszenzintensität der cytosolischen Regionen (farbcodiert in b) aufgrund der Positionierung in Variablen Abständen aus dem Bereich der photoaktivierungen. Beachten Sie wie zweieinhalbmal erreichen die Fluoreszenz plateau (angegeben in der Legende auf der rechten Seite) erhöhen mit dem Abstand der gegebenen Region auf dem Gebiet der photoaktivierungen, wahrscheinlich korrelieren mit der zunehmenden Zeiten für Diffusion von Actin-Monomere in der jeweiligen Region. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Wir beschreiben, wie Mikro- und Fotomanipulation Techniken wie FRAP und photoaktivierungen ermöglichen die Bestimmung der Motilität Parameter und die räumlich-zeitliche Dynamik der Proteine innerhalb Migration Zellen. Experimentellen Messwerte sind subzelluläre Dynamik und Umsatz der Motilität Regulierungsbehörden oder des zugrunde liegenden Aktin-Zytoskeletts.

Mikromanipulation Techniken Analyse der morphogenetischen Dynamik und Umsatz des Zytoskeletts Regulatoren

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

micromanipulation-techniques-allowing-analysis-morphogenetic-dynamics

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.0K Aufrufe.  Technische Universität Braunschweig. Wir beschreiben, wie Mikro- und Fotomanipulation Techniken wie FRAP und photoaktivierungen ermöglichen die Bestimmung der Motilität Parameter und die räumlich-zeitliche Dynamik der Proteine innerhalb Migration Zellen. Experimentellen Messwerte sind subzelluläre Dynamik und Umsatz der Motilität Regulierungsbehörden oder des zugrunde liegenden Aktin-Zytoskeletts.

Serie: Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Forschung

Biologie

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

Microiontophoresis und Mikromanipulation für Intravital Fluoreszenz-Imaging der Mikrozirkulation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

Tracking Morphogenetic Tissue Verformungen in der frühen Hühnerembryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once the pre-cursor round cell begins to elongate and differentiate into what is morphologically recognized as a spermatozoon. However, the spermatozoon is very immature, having no ability for motility or egg recognition. Both of these events occur once the spermatozoa transit a secondary organ known as the epididymis. During the ~12 day passage that it takes for a sperm cell to pass through the epididymis, post-translational modifications of existing proteins play a pivotal role in the maturation of the cell. One major facet of such is protein phosphorylation. In order to characterize phosphorylation events taking place during sperm maturation, both pure sperm cell populations and pre-fractionation of phosphopeptides must be established. Using back flushing techniques, a method for the isolation of pure spermatozoa of high quality and yield from the distal or caudal epididymides is outlined. The steps for solubilization, digestion, and pre-fractionation of sperm phosphopeptides through TiO2 affinity chromatography are explained. Once isolated, phosphopeptides can be injected into MS to identify both protein phosphorylation events on specific amino acid residues and quantify the levels of phosphorylation taking place during the sperm maturation processes.

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Phosphopeptid Analyse der Nebenhoden Nagetier Spermien

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Techniken für die Analyse der extrazellulären Vesikeln mittels Durchflusszytometrie

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &#8216;Touch DNA&#8217; Evidence

DNA profiles can be obtained from &#8216;touch DNA&#8217; evidence, which comprises microscopic traces of human biological material. Current methods for the recovery of trace DNA employ cotton swabs or adhesive tape to sample an area of interest. However, such a &#8216;blind-swabbing&#8217; approach will co-sample cellular material from the different individuals, even if the individuals&#8217; cells are located in geographically distinct locations on the item. Thus, some of the DNA mixtures encountered in touch DNA samples are artificially created by the swabbing itself. In some instances, a victim&#8217;s DNA may be found in significant excess thus masking any potential perpetrator&#8217;s DNA.
In order to circumvent the challenges with standard recovery and analysis methods, we have developed a lower cost, &#8216;smart analysis&#8217; method that results in enhanced genetic analysis of touch DNA evidence. We describe an optimized and efficient micromanipulation recovery strategy for the collection of bio-particles present in touch DNA samples, as well as an enhanced amplification strategy involving a one-step 5 &#181;l microvolume lysis/STR amplification to permit the recovery of STR profiles from the bio-particle donor(s). The use of individual or few (i.e., &#8220;clumps&#8221;) bioparticles results in the ability to obtain single source profiles. These procedures represent alternative enhanced techniques for the isolation and analysis of single bioparticles from forensic touch DNA evidence. While not necessary in every forensic investigation, the method could be highly beneficial for the recovery of a single source perpetrator DNA profile in cases involving physical assault (e.g., strangulation) that may not be possible using standard analysis techniques. Additionally, the strategies developed here offer an opportunity to obtain genetic information at the single cell level from a variety of other non-forensic trace biological material.

Here we describe an optimized and efficient removal strategy for the collection of bio-particles present in &#8216;touch DNA&#8217; samples, together with an enhanced amplification protocol involving a one-step 5 &#181;l micro-volume lysis/STR amplification, to permit the recovery of short tandem repeat (STR) profiles of the bio-particle donor(s).

Erweiterte Genetische Analyse der Einzelmenschen Biopartikeln von Simplified Mikromanipulation von Forensic &#39;Touch DNA&#39; Evidence Recovered

DNA profiles can be obtained from &#8216;touch DNA&#8217; evidence, which comprises microscopic traces of human biological material. Current methods for ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Hochauflösende Bildgebung und Analyse einzelner Astral Dynamik der Mikrotubuli in Bäckerhefe

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Einfache und effektive Verwaltung und Visualisierung von Mikropartikeln im Herz-Kreislauf-System von kleinen Fischen mit Niere Injektion

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...