Die Autoren möchten die Finanzierungsquellen danken: Army-UNL Center for Trauma Mechanics (DoD / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI: Dr. Namas Chandra), UNL Layman Award (26-1110-0033 -001 , PI: Lim).

Ein. Neuronale Zellkulturen <ol><li> Gehirnzellen einschließlich neuronaler Zellen, Astrozyten und ihre Co-Kultur kann als eine Zelle Modell verwendet werden. Als einer Machbarkeitsstudie Demonstration wird impulsive Druckbeaufschlagung Zelllinie neuronalen Zellen präsentiert. </li><li> SH-SY5Y-Neuroblastom-menschlichen Zellen (ATCC, CRL-2266) auf 18 mm Durchmesser Deckgläschen kultiviert. Die Zellen werden in einer Dichte von 3 × 10 3 Zellen / cm 2 unter Verwendung der Wachstumsmedien aus DMEM ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin. Zellkultur kultiviert Glasobjektträger in einer 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C gehalten wird </li><li> Die neuronalen Zelldifferenzierung von SH-SY5Y-Zellen zu erhalten, die Zellen mit Medium ferner mit 10 pM Retinsäure (RA) für 7 Tage mit Medien ergänzt behandelt alle zwei Tage gewechselt. Am Tag 7 sind Zellen bereit, unter Druck gesetzt werden. </li></ol> 2. Druckbeaufschlagung Ausstattung: Kolsky Bar <ol><li> Die Kolsky bar, deentwickelt durch Kolsky 1 1949, wurde verwendet, um die mechanische Eigenschaft aus einem Material mit einer sehr hohen Belastung zu messen. Die Vorrichtung besteht aus zwei Bügeln mit einer Probe in Kontakt zwischen den Stangen angeordnet. Spannungswellen-, auf der einfallenden bar angelegt, ausbreitet zu der Probe, wo die Welle spaltet sich in einem reflektierten und transmittierten Welle. Die Spannung in der Probe proportional zu der gesendeten Welle. In dieser Studie, verwenden wir eine Zelle Druckkammer zwischen den beiden Stangen des Kolsky Set-up abgegeben werden. </li><li> Die beiden Aluminium-Legierung Stäbe (jeweils 6-m) werden von ausgerichteten Messinglagern suspendiert und eine in vitro-Zelle Druckkammer ist zwischen den Stäben eingeklemmt. Der Upstream-bar ist der Vorfall bar mit einem 130 £ Masse auf ein Ende eingespannt. Reibungsmaterial Klammer in einer Position, die die gewünschte Impulsdauer geben wird platziert. Durch Schließen der Klammer und Anziehen einer Schere Buchse zwischen der Masse und einer Belastungshalterung ist die Klammer-Masse-Abschnitt des einfallenden bar pre-compressed auf das gewünschte Niveau. Erzwingen einer gekerbten Schraube, die die Klemme verriegelt zu einem plötzlichen Bruch mit einem hydraulischen System löst die zuvor gespeicherte Kompression schnell und erzeugt somit einen Druckimpuls. Diese breitet sich durch den Vorfall bar, treibt die Prüfkammer Kolben und unter Druck die Flüssigkeit und Zellen in der Kammer impulsiv. Die Kammer Druckbeaufschlagung wiederum löst einen Druckimpuls Verbreitung in den übertragenen bar stromabwärts. Die Stämme mit der Druckimpulse in den Stäben verbunden sind mit Verbindung hoher Dehnungsmessstreifen angeregt bis 45 Volt gemessen. Die Spurweite Signale werden mit einem digitalen Oszilloskop bei 1 MHz Frequenz als Belastung aufgezeichnet. </li><li> Die in vitro-Zelle Druckkammer besteht aus einem Kolben-Zylinder zusammensetzt. Der Zylinder weist 2,6 cm Innendurchmesser und 3,8 cm Außendurchmesser und weist eine kleine Öffnung an der Basis des Hohlraums abgegriffen. Das Loch dient als Luft und überschüssige Flüssigkeit Entlüftung während der Zellprobe Installation. Der Kolben ist 7,5 cm langund aus dem gleichen Material hergestellt bar. Der Kolben ist mit zwei bis drei Schichten der Klempner (Teflon)-Band, die als reibungsarme Dichtung dienen gewickelt. Die Endkappe ist 32 mm lang und hat zwei kleinen Schrauben aus rostfreiem Stahl, die die Deckgläser (auf denen Zellen kultiviert werden) während des Ladens zu sichern. </li></ol> 3. Impulsive Druckbeaufschlagung von neuronalen Zellen <ol><li> Alle Druckkammer Teile sterilisiert mit dem Autoklaven und unter UV-Licht gehalten. Die Anordnung der Kammer im Inneren der Haube Zellkultur durchgeführt. Die Entlüftungsschraube in der Kammer ist lose in die Lüftungsöffnung an der Basis des Hohlraums in Eingriff. Vorgewärmten (37 ° C) frisches Nährmedium in die Kammer ohne Luftblasen pipettiert. Dann wird ein Zell-kultivierten Glasobjektträger aufgenommen, und wird an der Kappe des Kolbens platziert (Zellen zugewandten Außenseite). Die kleinen Halteschrauben sind nach unten auf die Folie halten Sie sie fest angezogen sind. Der Kolben mit einem Zell-kultivierte Glasobjektträger eingefügt etwas into der Hohlraum der Kammer, und die Anordnung mit der Entlüftungsöffnung ist an der höchsten Stelle gekippt wird. Die Entlüftungsschraube wird entfernt und der Kolben in den Hohlraum ersten Herausdrücken Luftblasen, dann die überschüssige Flüssigkeit geschoben. Entweder eine Referenzmarke oder eine Spannvorrichtung ist als Leitfaden verwendet werden, um die gleiche Kultur Datenträger für jeden Test zu gewährleisten. Die axiale Abmessung der Medien in der Kammer beträgt ca. 6 mm. Desinfizieren Sie die Entlüftungsschraube und ersetzen Sie sie, um die Kammer wasserdicht zu machen. Die Kammer sollte nicht unter diese statische Belastung auslaufen, wenn es funktioniert, die Teflon-Wrap ersetzt oder verstärkt werden muss. </li><li> An diesem Punkt ist das System zurückgesetzt Kolsky bar. Die schwere Masse wird wieder in die ursprüngliche Position bewegt und ein neues ersetzt den Verriegelungsbolzen verwendet (gebrochen) ein. Aktivieren Sie den neuen Riegel mit der Hydraulik auf etwa 200 psi. Verwenden Sie die Schere Buchse, um das pre-loading Abschnitt des Vorfalls bar komprimiert bis zu einem Druck etwas höher als der gewünschte Wert, und Sie ihn dann, um die volle Reibung der EingriffJacks Schraube. Die Datenerfassung ist scharf. </li><li> Die zusammengebauten Zelle Druckkammer in das System montiert ist. Es liegt in einer V-Block durch kleine Schere lab Wagenheber platziert und ausgerichtet mit den beiden Stäben. Fett jede Schnittstelle mit einer leichten Fettschicht und reiben Sie die Stoßflächen zusammen, um eventuell vorhandene Lücken zwischen beseitigen. </li><li> Der Test ist nun bereit, um fortzufahren. Die Klammer Riegel ist gezwungen, durch schnelles Pumpen der hydraulische Klemme Fahrer brechen. Die Klemme wird trennen und die Datenerfassung sollten die Ergebnisse anzuzeigen. Die Zelle Druckbeaufschlagung Geschichte wird aus den Messungen des übertragenen bar Überdruck bestimmt. Wenn das übertragene bar eingesetzt ist lang genug, sollte dies nur von der ersten Störung an der Stelle sein, wo die Messungen einen Unterdruck zu zeigen. Die Dauer des Sendeimpulses kann kürzer als der einfallenden Pulses, wenn eine Luftblase eingeschlossen wird. Die Größe kann nicht erreichen, dass der einfallenden Pulses, aber es sollte eine ausreichend lon habeng Plateau vor Entladung. Andernfalls könnte entweder eine große Luftblase in der abgedichteten Kammer oder einer Fehlausrichtung zwischen der Anordnung und einer Bar aufgetreten sind. </li><li> Die Zelle Druckkammer wird dann entfernt und demontiert Inneren der Zellkultur Haube. Die Entlüftungsschraube wird entfernt und der Kolben frei gezogen der Kammer. Das Zell-kultivierten Glasobjektträger von dem Ende des Kolbens aufgenommen. </li></ol> 4. Beurteilung Pressurized Zellverhalten <ol><li> Nach Druckbeaufschlagung können die Zellen unmittelbar eingesehen werden oder weiter zur späteren Untersuchung inkubiert. Mit der richtigen aseptischen Betrieb Prozessen ist längerfristigen post-Inkubation möglich. </li><li> Pressurized Zellen können von allen Molekular-und Zellbiologie Techniken untersucht werden. Speziell für Nervenzellen Druckbeaufschlagung, um die zellulären und molekularen Physiologie TBI Bedingungen zu untersuchen, Assays Beurteilung Druck-induzierten Veränderungen in Neuritenwachstum, Mikrotubuli-Zytoskelett Veränderung neuronaler Gens Expression, Apoptose, etc., durchgeführt werden kann. Als Kontrolle Zellproben, Zellen, die denselben gezüchtet werden, im Inneren der Druckkammer für die gleiche Zeitperiode gehalten, jedoch nicht unter Druck verwendet werden (sogenannte, Kammer-Kontrolle). </li><li> Für die Beurteilung der Veränderungen in Neuritenwachstum, werden unter Druck und der Kammer Kontrollzellen durch optische Mikroskop unmittelbar nach Druckbeaufschlagung und 1 und 24 h post-Inkubation untersucht. Ein Beispiel Nervenzellen Bilder werden in die &quot;repräsentativen Ergebnisse &#39;Abschnitt (Abbildung 2). Die Neuritenlänge Veränderung kann durch Aktin Immunfluoreszenzfärbung und Bildanalyse quantifiziert werden. Die Zellen werden mit 4% w / v Paraformaldehydlösung mit einer 0,05% v / v Tween-20-Waschpuffer gespült fixiert, permeabilisiert und mit einer 0,1% v / v Triton X-100-Lösung. Nach dem Blockieren mit einer 1% w / v Rinderserumalbumin-Lösung werden die Zellen mit Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC)-konjugierter Phalloidin inkubiert. Immunofluoreszenz-Bilder der Zellen getroffen werden mit einem fluoreszierendenMikroskop und die Längen von Neuriten für unter Druck und Kontrolle Zellen werden unter Verwendung des quantifizierten ImageJ Software (NIH). </li><li> Die Neuriten als Axone oder Dendriten identifiziert werden. Um die morphologischen Veränderungen in den Axonen oder Dendriten beurteilen beschriebenen Experimenten oben kann durch Verwendung von Antikörpern Erfassen jeder Struktur wiederholt werden, dh, Neurofilament (NF)-Antikörpers zur Axonen und Mikrotubulus-assoziiertes Protein (MAP2) Antikörpers zur Dendriten. </li><li> Mikrotubuli sind eine der wichtigsten Komponenten des Cytoskeletts von Neuronen, und der Schaden an Mikrotubuli als Marker von neuronalen Verletzungen eingesetzt. 2 Microtubule visualisiert werden kann unter Verwendung des immunofluorescently β-Tubulin-Antikörper. Zellen werden nach 0 und 24 h nach der Druckbeaufschlagung fixiert, gefärbt mit β-Tubulin-Antikörper, und beobachtet von dem Fluoreszenzmikroskop. </li><li> Um die Wirkung von impulsiven Druckbeaufschlagung auf neuronale und apoptotischen Genexpression zu beurteilen, wird Gesamt-RNA aus einer unter Druck und Kontrolle Zellen extrahiert. Gene Expression kann durch Durchführen quantitativer RT-PCR oder Echtzeit-RT-PCR, ähnlich unserer veröffentlichten Protokollen untersucht werden. 3 </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Ein Beispiel Druckprofils, die an die Zellen innerhalb der Druckkammer. Die Kolsky bar Vorrichtung erfolgreich erzeugt 2 MPa Ebene Einzelpuls-Typ treibend Druckbeaufschlagung mit einer Dauer von ungefähr 0,7 ms. <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Ein Beispiel neuronale Zellantwort auf treibend Druckbeaufschlagung. SH-SY5Y-Zellen zu impulsiven Druckbeaufschlagung bei 2 MPa zeigen deutliche Neuriten / Axon Aufteilung gegenüber Kammer Kontrollzellen ausgesetzt. 6. Schwierigkeiten und Lösungen <ol><li> Chamber Abdichtung ist eines der größten Hindernisse zu überwinden. Es ist found dass große Festplatten mit O-Ringen ein Problem Fugenhobeln und erhöhte Reibung haben. Um die Reibung Effekte zu entfernen, sowie verhindern, Fugenhobeln, eine einfache Methode des Kolbens Tapen mit Teflon Klempner Band verwendet wird. Dies löst die Probleme und produziert gewünschten Druck Höhe und Dauer. </li><li> Pressurized Nervenzellen Verhalten, insbesondere bei der Beurteilung der sekundären TBI Mechanismus oder längerfristigen Auswirkungen, sollte sich nach einem langen Post-Inkubationszeit untersucht werden. Die zellhaltigen Kammer ausgesetzt ist, um potenziell unsterilen Bedingungen während der Bewegung des Kolsky bar, unter Druck, und Bewegen wieder zur Zellkultur Haube. Mit Pre-Sterilisation der Kammer Teile und ordnungsgemäßen Betrieb in der Montage / Demontage der Zelle-kultivierten Rutsche und Kammer im Inneren der Zellkultur Kapuze, längerfristige post-Inkubation ist möglich bis zu mehreren Wochen. </li><li> Die Reproduzierbarkeit der Daten ist ein wichtiger Parameter bei der zellulären mechanische Stimulation Experimente. Für unser Gerät, das reproducibility in neuronalen Zellen-Reaktion bestimmt wird, wie gewünscht impulsive Druckbeaufschlagung Profil, sowohl in Druck-Höhe und Dauer, wird immer wieder erhalten. Da wir die erhaltene Druckprofil für jede Druckbeaufschlagung aufzeichnen können die Zell-Antwort-Daten vor unerwünschten Druckprofil danach manuell ausgeschlossen werden. </li><li> Der gesamte Druck-Schritte, einschließlich Kammerbaugruppe, Transfer und montieren in der Kolsky bar, Druck-, Transfer-back, und Kammermusik Demontage, in weniger als 10 min. Die nächste Zelle kultivierten Folie kann sofort Druck nach dem vorherigen Druckbeaufschlagung. Somit kann eine ausreichende Anzahl von Experimenten Druckbeaufschlagung effizient durchgeführt werden. Unser Set-up verwendet 18 mm Durchmesser Deckgläser. Eine Druckbeaufschlagung Experiment nicht genügend Proteine ​​für westliche Immunoblot aufgrund Substrat Größe (und zum Teil auch, weil einige der Druck Zellen sind tot). Über drei wiederholten Druckbeaufschlagung Experimente liefern Proteinmenge für immunobl erforderlichotting. Wiederum wird die Reproduzierbarkeit jedes Mal mit dem Druckprofil überprüft. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+mechanical+properties+of+materials+at+very+high+rates+of+loading.">An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading.</a> Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).</li><li>Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+breaking+of+microtubules+in+axons+during+dynamic+stretch+injury+underlies+delayed+elasticity,+microtubule+disassembly,+and+axon+degeneration.">Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration.</a> FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).</li><li>Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+expression+and+osteopontin+regulation+in+human+fetal+osteoblastic+cells+mediated+by+substratum+surface+characteristics.">Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics.</a> Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).</li><li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+approaches+for+studying+blast-induced+traumatic+brain+injury.">In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).</li><li>Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explosive+blast+neurotrauma.">Explosive blast neurotrauma.</a> J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).</li><li>Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+percussion+barotrauma+chamber:+a+new+in+vitro+model+for+traumatic+brain+injury.">Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury.</a> J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).</li><li>VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure.">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).</li><li>Huang, H., Feng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+dynamic+tribological+response+of+closed+fracture+surface+pairs+by+Kolsky-bar+compression-shear+experiment.">A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment.</a> Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).</li><li>Song, B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+Hopkinson+pressure+bar+techniques+for+characterizing+soft+materials.">Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials.</a> Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Viele in vitro experimentellen Techniken zur Untersuchung von Gehirn Zellschäden in TBI Bedingungen versucht worden. Dazu gehören Neuron / Astrozyten Stretching, strömungsinduzierten Schubspannung, Gewicht fallen, Stift Platzwunde, Laser Durchtrennung, Lithotripsie, etc. 4,5 Es wurde davon ausgegangen, dass Kurzzeit-Überdruck eine dominierende physische Faktor für TBI ist. 6,7 Gerade , die Schockwelle der Explosion TBI besitzt eine Pulsdauer von einer Größenordnung von Millisekunden. 4 Basierend auf dieser Annahme und Beobachtung hat Barometer Kammer in der Lage transiente Druckbeaufschlagung entwickelt und verwendet für die Beurteilung Gehirnzelle Verhalten unter TBI Bedingungen. Zum Beispiel wurde in dem Fluid Schlagwerk Barotrauma Kammer ein Druckimpuls mit 20-30 ms langer Dauer und einem Spitzendruck von bis zu 0,5 MPa verwendet, um den menschlichen Gliazellen Verhalten unter TBI untersuchen. 6 kurzem VandeVord et al. 7 verwendete Metall Ballkontakt Barometer Kammer, um den Astrozyten Zelle zu untersuchenVerhalten unter TBI aber das Metall Ballkontakt mehrere Druckimpulse erzeugt. In dieser Studie haben wir eine neue Zelle Druckbeaufschlagungsvorrichtung, die single-pulse type impulsive Druckbeaufschlagung generiert entwickelt. Das Gerät wurde auf der Grundlage der Kolsky bar set-up, das als Material Prüfgerät in unserem 8 und anderen Studien verwendet wurde, entwickelt. 1,9 Die Kolsky bar die Materialprüfung Möglichkeit bei sehr hohen Laderate geändert wurde, um der Lage sein, Anwendung Einzelpuls-Typ Überdruck zu den kultivierten Zellen innerhalb der Druckkammer (Abbildung 1). Wir konnten erfolgreich steuern die Größe und Dauer des impulsiven Überdruck. Als Vertreter Zellantwort zeigten wir, dass bei 2 MPa Druck SH-SY5Y neuronalen Zellen anzuzeigen signifikante Neuriten und axonalen Verlust, drucklosen Kammer Kontrollzellen verglichen. Zusammenfassend haben wir eine neue impulsive Zelle Druckbeaufschlagung unter Verwendung einer speziell entwickelten Kolskybar-Gerät und zeigte sein Potential den Einsatz in der Untersuchung neuronaler Zell-Antwort in TBI Bedingungen. Wir bemerken auch, dass diese Technik sehr vielseitig, dass jede Art von Zellen kann treibend Drücke an verschiedenen Höhe und Dauer auszusetzen ist. Daher kann die Vorrichtung verwendet, um das treibend druckinduzierten zellulären Mechanotransduktion Verhalten zu untersuchen, nicht nur von Schädigung der Zellen, sondern auch zum zwangsweisen Stimulation der Zellen in ihrer Funktion und Schicksal Bestimmung.

<ul><li> SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) humanen Neuroblastom-Zellen </li><li> 18 mm Durchmesser Deckgläser </li><li> Zellkulturmedien: DMEM, 10% fetales Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin </li><li> Retinsäure (10 uM) zur Induktion Neurogenese </li><li> Kolsky bar impulsive Druckbeaufschlagungsvorrichtung </li><li> Kolben-Zylinder-Zell-Druckkammer </li><li> Edelstahl Schrauben für die Befestigung Zelle kultivierten Deckglas auf dem Kolben </li><li> Schmierfett für Schnittstellen zwischen Zelle Kammer und Kolsky bar </li><li> Allgemeine molekularbiologische Lieferungen für die Beurteilung der Zell-Antwort auf Druckbeaufschlagung (Fixativ, Antikörper, Fluoreszenzfarbstoff, PCR liefert, etc.) </li></ul>

impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study

Eine neuartige impulsive Zelle Druckbeaufschlagung Experiment wurde unter Verwendung eines Kolsky bar Gerät blast-induzierten Schädel-Hirn-Trauma (SHT) zu untersuchen. Wir zeigen in diesem Video Artikel, wie Blast TBI-relevanten impulsive Druckbeaufschlagung zu den neuronalen Zellen in vitro angewendet wird. Dies wird durch Verwendung gut kontrollierten Druckimpuls von einem spezialisierten Kolsky bar Vorrichtung geschaffen, mit komplettem Druckverlauf innerhalb der Zelle gespeichert Druckkammer erreicht. Druck stehenden neuronalen Zellen unmittelbar nach Druckbeaufschlagung inspiziert oder weiter inkubiert, um die langfristigen Auswirkungen von impulsartigen Druckbeaufschlagung auf Neuriten / axonalen Wachstums, neuronale Genexpression, Apoptose usw. Wir beobachteten, dass treibend Druckbeaufschlagung mit etwa 2 MPa untersuchen induziert Neurit deutlichen Verlust relativen zur drucklosen Zellen. Unsere Technik stellt ein neues Verfahren, um die molekularen / zellulären Mechanismen der Explosion TBI untersuchen, über treibend Druckbeaufschlagung Hirnzellen bei gut kontrollierten prEssure Größe und Dauer.

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Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Eine neuartige impulsive Zelle Druckbeaufschlagung Experiment wurde unter Verwendung eines Kolsky bar-Gerät, um die molekularen / zellulären Mechanismen der Hochofen-induzierte traumatische Hirnverletzung zu untersuchen.

Impulsive Druckbeaufschlagung des neuronalen Zellen zur Traumatic Brain Injury Study

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate blast-induced traumatic brain injury (TBI). ...

impulsive-pressurization-neuronal-cells-for-traumatic-brain-injury

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K Aufrufe.  University of Nebraska-Lincoln. Eine neuartige impulsive Zelle Druckbeaufschlagung Experiment wurde unter Verwendung eines Kolsky bar-Gerät, um die molekularen / zellulären Mechanismen der Hochofen-induzierte traumatische Hirnverletzung zu untersuchen.

Serie: Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Mikrostrukturierten Oberflächen zum Studium Hyaluronsäure Wechselwirkungen mit Krebszellen

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Forschung

Biotechnik

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

A Novel Dreidimensionale-Flow-Kammer-Geräte zu Chemokine gerichtet Extravasation von zirkulierenden Zellen unter physiologischen Bedingungen zu studieren Durchfluss

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Mit Mikrofluidik-Chips für Live-Imaging-und Studienverletzungs Antworten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

Lumineszenz-Resonanzenergietransfer zu Konformationsänderungen in Membranproteinen in Säugerzellen exprimiert Studieren

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Training Persons with Spinal Cord Injury to Ambulate Using a Powered Exoskeleton

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper extremity function and are able to maintain upright balance using forearm crutches. To ambulate in an exoskeleton, the user must acquire the ability to maintain balance while standing, sitting and appropriate weight shifting with each step. This can be a challenging task for those with deficits in sensation and proprioception in their lower extremities. This manuscript describes screening criteria and a training program developed at the James J. Peters VA Medical Center, Bronx, NY to teach users the skills needed to utilize these devices in institutional, home or community environments. Before training can begin, potential users are screened for appropriate range of motion of the hip, knee and ankle joints. Persons with SCI are at an increased risk of sustaining lower extremity fractures, even with minimal strain or trauma, therefore a bone mineral density assessment is performed to reduce the risk of fracture. Also, as part of screening, a physical examination is performed in order to identify additional health-related contraindications. 
Once the person has successfully passed all screening requirements, they are cleared to begin the training program. The device is properly adjusted to fit the user. A series of static and dynamic balance tasks are taught and performed by the user before learning to walk. The person is taught to ambulate in various environments ranging from indoor level surfaces to outdoors over uneven or changing surfaces. Once skilled enough to be a candidate for home use with the exoskeleton, the user is then required to designate a companion-walker who will train alongside them. Together, the pair must demonstrate the ability to perform various advanced tasks in order to be permitted to use the exoskeleton in their home/community environment.

Training a person with paralysis to ambulate using a powered exoskeleton may present challenges. The goals are to present the candidate selection criteria and the training procedures for exoskeletal-assisted walking and other mobility skills that can be progressed as the participant's skill level improves.

Personen mit Rückenmarksverletzungen Ausbildung zum ambulate eines aktiven Exoskelett Verwendung

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Dreidimensionale Gewebezüchtungen ausgerichtet Astrozyten Netzwerke Nervensystem Regeneration zu rekapitulieren Entwicklungsmechanismen

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Elektrospinnen Schreiben von dreidimensionalen Poly(ε-caprolactone) Gerüste mit steuerbaren Morphologien für Tissue Engineering Anwendungen zu schmelzen

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for movement disorders and is being applied to a growing number of disorders. Computational modeling has been successfully used to predict the clinical effects of DBS; however, there is a need for novel modeling techniques to keep pace with the growing complexity of DBS devices. These models also need to generate predictions quickly and accurately. The goal of this project is to develop an image processing pipeline to incorporate structural magnetic resonance imaging (MRI) and diffusion weighted imaging (DWI) into an interactive, patient specific model to simulate the effects of DBS. A virtual DBS lead can be placed inside of the patient model, along with active contacts and stimulation settings, where changes in lead position or orientation generate a new finite element mesh and solution of the bioelectric field problem in near real-time, a timespan of approximately 10 seconds. This system also enables the simulation of multiple leads in close proximity to allow for current steering by varying anodes and cathodes on different leads. The techniques presented in this paper reduce the burden of generating and using computational models while providing meaningful feedback about the effects of electrode position, electrode design, and stimulation configurations to researchers or clinicians who may not be modeling experts.

The goal of this project is to develop an interactive, patient-specific modeling pipeline to simulate the effects of deep brain stimulation in near real-time and provide meaningful feedback as to how these devices influence neural activity in the brain.

Targeting neuronalen Faser Traktate für Deep Brain Stimulationstherapie mit interaktiven, patientenspezifische Modelle

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Hyaluronsäure basierte Hydrogele für 3-dimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...