Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) unter dem Förderkennzeichen FO 315/4- und der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung Nr. HEALTH-F2-2009-241778 unterstützt CF.

1. Seeding von Endothelzellen in Well Platten <ol><li> Kultivieren Mausgehirn mikrovaskulären Endothelzellen (CEND) in T75 Kulturflasche, Wechsel des Mediums (DMEM mit 10% FCS, 50 U / ml Penicillin / Streptomycin, 1% L-Glutamin) zweimal pro Woche, bis zum Erreichen der Konfluenz. (Für die Erzeugung und Immortalisierung Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen finden Burek et al, 2012;. Förster et al, 2005, 21,19.). </li><li> Die Zellen werden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entfernen Sie die PBS und trypsinize die Zellen mit 2 ml warmem Trypsin-EDTA-Lösung. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für 5 Minuten oder bis die Zelle Schicht dispergiert ist. </li><li> In 8 ml Kulturmedium in die Zellen. Tippen Sie auf den Kolben mehrmals, um die Zellen zu lösen. </li><li> Sehen Zellen unter dem Mikroskop, um eine vollständige Loslösung von Kolben zu gewährleisten. </li><li> Pipette Medium mit abgelösten Zellen nach oben und unten. Schwenken Sie die Flasche, um die Zelle Sus mischenauf. </li><li> Nehmen Sie 20 ul der Zellsuspension, legte in einem Hämocytometer und zählen Sie die Anzahl der Zellen. </li><li> Bestimmen Sie die Zelldichte und Saatgut 20.000 Zellen / cm 2 in den Brunnen. </li><li> Übertragen der Zellsuspension in collagen1 vorbeschichteten 6-well flexible Boden Kulturplatten (57,75 cm 2) in einem Gesamtvolumen von 3 ml / Vertiefung. Jedes der gut hat eine Fläche von 9,62 cm 2. </li><li> Wachsen die Zellen bei 37 ° C für eine Woche bis zur Konfluenz. Ändern Sie das Kulturmedium zweimal pro Woche. </li></ol> 2. Zelldifferenzierung Vor Stretch-induzierte Verletzung <ol><li> Ändern des Kulturmedium der Zellen, die mit Differenzierungsmedium (DMEM mit 1% Serum-fetalem Kälberserum (ssFCS), 50 U / ml Penicillin / Streptomycin). </li><li> Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für 24 Stunden. </li></ol> 3. Stretch-induzierte Verletzung von Endothelzellen <ol><li> Schalten Sie das Gerät Zellverletzung Controller. </li><li> Stellen Sie die Verzögerung auf 50 ms. </li><li> Stellen Sie den Regler Druck bis 15 psi und drücken Sie den Auslöser ein paar Mal, bis der registrierten Druckspitzen stabil wird. </li><li> Stellen Sie den Regler auf den gewünschten Wert. Verwenden Sie Tabelle 1 als Leitfaden zur Erzeugung von verschiedenen Graden der Strecke Verletzungen. </li><li> Legen Sie die 6-well flexible Boden Kultur Platte (57,75 cm 2) in den Tablett-Halter. Stellen Sie sicher, dass das auch auf die richtige und Größe (dh große gut) gesetzt ist. </li><li> Setzen Sie den Adapter-Stecker fest auf den Brunnen. Halten Sie den Stecker fest in Stelle mit einer Hand, während die andere Hand drückt den Auslöser. </li><li> Notieren Sie sich die Druckspitzen erzeugt. </li><li> Sofort stellte den Teller zurück in die 37 ° C-Inkubator für die gewünschte Länge der Zeit, oder verwenden Sie sofort für nachfolgende Experimente oder Auswertung. </li></ol> 4. Beurteilung der Stretch Verletzung durch Farbstoffaufnahme Assay <ol><li> Unmittelbar nachdem die Zellen strgeätzt (Schritt 3.7), fügen Sie 30 ul einer 1 mg / ml Lösung der Lebensfähigkeit Fleck, dass die Handlungen als Marker Zytotoxizität (bitte sehen ergänzenden Tabelle von Materialien und Ausrüstung) zum Zellkulturmedium (Anmerkung: 10 ul der Farbstofflösung ist für jeden ml Zellkulturmedium verwendet werden). </li><li> Nach der Zugabe des Farbstoffs zu den Zellen unmittelbar unter einem Fluoreszenzmikroskop anzuzeigen. </li></ol> 5. Beurteilung der Stretch Verletzung von Lactatdehydrogenase (LDH) Veröffentlichungsdatum <ol><li> Unmittelbar nach dem Dehnen die Zellen (Schritt 3.7), entfernen Sie 200 ul Zellkulturmedium aus dem Brunnen. Machen Sie dasselbe für jeden Zeitpunkt nach der Verletzung, das Sie in Ihrer Untersuchung der LDH-Freisetzung umfassen würde (dh zB 30 min, 1 h, 2 h, etc.) </li><li> Zentrifuge das Zellkulturmedium bei der höchsten Einstellung von einer Mikrozentrifuge für 5 min auf eine beliebige Zelle Ablagerungen zu entfernen. Entfernen Sie den Überstand und nutzen diese für die nachfolgenden Schritte. </li><li> Sobald Sie have Schritt 5.1 abgeschlossen und haben die notwendigen Proben, die Sie gerne von den verschiedenen Zeitpunkten Sie gerne genauer untersuchen, lysieren die Zellen mit dem Lyse-Lösung in der LDH-Assay-Kit (siehe zusätzliche Tabelle der Werkstoffe und Ausrüstung) enthalten würde hätte. </li><li> Setzen Sie 100 ul der Assay-Medium im Assay kitto enthalten jede Vertiefung einer 96-Brunnen Platte im Kit enthalten. </li><li> Setzen 100 ul der zellfreien Kulturmedium in zwei parallele Vertiefungen einer 96-Vertiefungen Platte in dem Assay-Kit enthalten. </li><li> Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Die Absorption bei 492 nm auf. </li></ol>

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	<li>Hyder, A. A., Wunderlich, C. A., Puvanachandra, P., Gururaj, G., Kobusingye, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+traumatic+brain+injuries:+a+global+perspective.">The impact of traumatic brain injuries: a global perspective.</a> NeuroRehabilitation. 22 (5), 341-353 (2007).</li><li>Morrison, B., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+centralnervoussystemmodels+of+mechanicallyinducedtrauma:+a+review.">In vitro centralnervoussystemmodels of mechanicallyinducedtrauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15 (11), 911-928 (1998).</li><li>Albert-Weissenberger, C., Sir&#233;n, A. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+immortalized+murine+brain+microvascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+blood+brain+barrier+model.">Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model.</a> J. Vis. Exp. (66), (2011).</li><li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Gabler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+injury+of+cortical+neurons.">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li><li>Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+brain+barrier+breakdown+as+a+therapeutic+target+in+traumatic+brain+injury.">Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury.</a> Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).</li><li>Thal, S. C., Schaible, E. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Auswirkungen von mechanischen Verletzungen in vitro untersucht worden und Methoden festgelegt wurden für Astrozyten, Neuronen, Gliazellen und Endothelzellen 8, 9, 22. Es ist jedoch bisher noch keine in vitro-Modell der Strecke Verletzungen in kultivierten Endothelzellen des Gehirns bekannt. Cellular Modelle Trauma wertvolle Vorteile gegenüber Tiermodellen da die mechanische Umgebung der Zellen genau gesteuert werden 6. Daher ein in vitro-Modell für Trauma durch Stretch-Verletzungen mit kultivierten Endothelzellen Gehirnzellen, die als Modell der Blut-Hirn-Schranke (BHS), wie das, was unser Protokoll presents kann sich als nützlich erweisen. Dieses Protokoll nutzt CEND Zellen, eine etablierte BBB-Modell in unserem Labor. Seit BBB Aufschlüsselung wird oft in SHT-Patienten dokumentiert und TBI wird oft mit der Störung des BBB, die Ödembildung 23, 24 führen kann verknüpft, verschenkt den Verfahrentierte hier können speziell bei der Durchführung von Studien BBB in Bezug auf TBI verwendet werden. In diesem Modell ist es wichtig, dass, wie viel Grad der Strecke Schädigung der Zellen angelegt zu nehmen. Soweit die Zellen in jedem Fall und mit dem, was viel Druck angewendet werden verletzt unterscheiden der Grad der Schädigung, die Endothelzellen beeinflussen können sehr stark von anderen Zelltypen. Endothelzellen sind widerstandsfähiger gegen Verletzungen als Astrozyten oder gemischten Gliazellen 9 dehnen. Darüber hinaus sind sie schneller reparieren nach der Verletzung zu den anderen Zelltypen verglichen. Daher wird für die Endothelzellen des Gehirns, insbesondere Cend Zellen größere Menge an Dehnung Verletzungen erforderlich, um einen hohen Grad der Verletzung zu erzeugen. Man könnte den gewünschten Grad der Schädigung durch Anwenden der entsprechenden Druck in der Tabelle 1 angegeben zu erreichen. Für Cend Zellen, jedoch schwere Verletzungen bevorzugt aufgrund ihrer Resistenz gegen belasten. Die LDH-Assays durchgeführt wurden, zeigtendass der Grad der Dehnung erhöht, wird mehr LDH in den Überstand sezerniert werden. Im Gegensatz dazu erzeugt die Zellen, die eine geringe Menge der Ausdehnung Verletzung gegeben wurden LDH in einer Menge ähnlich zu Kontrollzellen. Wie im Protokoll erwähnt, muss man darauf achten, dass die geeignete Menge des Mediums, da eine Zunahme oder Abnahme in der Menge des Mediums zu Unterschieden in der Spitze ausgeübten Druck in die Vertiefungen führen wird. Zum Beispiel registriert eine Vertiefung mit 5 ml Flüssigkeit pro Spitzendruck im Durchschnitt von 4,0 psi, während eine leere Vertiefung registriert durchschnittlich 3,8 psi bei 45 psi Druck ausgeübt wird. Daher ist es am besten, die Auslöser mehrmals über ein Steuerelement auch drücken, um sicherzustellen, dass die Druckspitzen, die erzeugt werden, um die gewünschte Menge entspricht. In unseren Experimenten verwendeten wir eine Lebensfähigkeit Fleck, um die Wirkung der Ausdehnung der Permeabilität der Zellmembran zu bestimmen. Die Optik der flexible Boden Petrischalen wir verwendet ermöglicht es uns, view die gefärbten Zellen direkt unter dem Mikroskop. Allerdings, wenn man direkt nach dem Studium Immunomarkierung Stretch-Verletzungen führen will, kann Schwierigkeiten auftreten. Erstens kann die Größe und Dicke der Platte ein Problem mit einigen Mikroskop Aussichtsplattformen. Zweitens kann die Optik der flexiblen Membran der auch ein Hindernis für die Anzeige zu löschen. Trotz der genannten Beschränkungen, jedoch kann das beschriebene Verfahren als ein Modell der in vitro mechanische Schädigung der Blut-Hirn verwendet werden. Schädel-Hirn-Trauma (SHT) besteht aus zwei Komponenten, nämlich, Ischämie und Trauma. Ischämie kann als sekundäre Verletzungen nach TBI in Fällen, wenn es ernst Blutverlust was zu niedrigen Blutdruck oder als Folge der Schwellung des Gehirns beschränkt Sauerstoffversorgung des Gehirns auftreten. Es wird als ein verzögertes, nicht mechanische Schäden, die in Folge pathologischer Prozesse zum Zeitpunkt der Verletzung 25 eingeleitet betrachtet. Das Auftreten von Hypoxie einfter schweren Schädel-Hirn-Verletzungen üblich ist 26. Oxygen Glukose Deprivation (OGD) ist die Methode derzeit an Modell Ischämie in vitro verwendet. Somit kann Unterwerfen Zellen als ein sekundärer Insult zu den Zellen nach dem Strecken OGD imitieren die Inzidenz von TBI durch Ischämie gefolgt. Daher, um unsere aktuellen In-vitro-Modell zu verbessern TBI und Muster sie so nah wie möglich an einem tatsächlichen TBI, wie es in vivo auftritt, in der Zukunft werden wir beschäftigen auch OGD in Kombination mit Stretch-Verletzung.

Schädel-Hirn-Trauma (SHT) ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Über 10 Millionen Menschen werden jährlich von TBI so dass es ein großes gesundheitliches und medizinisches Problem 1 betroffen. Aus diesem Grund wurden verschiedene in-vivo-und in vitro-Modelle von TBI wurde gegründet und entwickelt, um ihre Mechanismen zu studieren 2,3,4. Ein besseres Verständnis der TBI kann dazu beitragen, stationäre Behandlung und eine Verringerung der Mortalität, Morbidität und Kosten. Viele Modelle für Hirn-Verletzungen, die sowohl in vivo und in-vitro-Methoden nutzen, existieren. In-vivo-Modellen konnte das eigentliche Ereignis von Kopfverletzungen zu imitieren. Aufgrund der Komplexität der in vivo Situation, Zugänglichkeit zum Gewebe von Interesse begrenzt wird 2. Für das Verständnis der physiologischen Reaktion von einzelnen Zellen als Folge der Verletzung zugefügt, ist es wichtig, dass die Zellen isoliert werden aus dem systemischen Auswirkungen, welchehemmen oder verändern ihre individuelle Reaktion 5. Aus diesem Grund bieten Zellmodellen Trauma wertvolle Vorteile gegenüber Tiermodellen da die mechanische Umgebung der Zellen genau gesteuert werden 6. In-vitro-Systemen, die die Verwendung der mechanischen Belastung, um Zellen oder Gewebe auf Änderungen durch ein solches Verfahren von Verletzungen induziert bestimmen beschäftigen entwickelt worden. Zum Beispiel ist ein Verfahren zur Untersuchung der Wirkung von mechanischen Schädigung Zellen Astrozyten, Neuronen, Glia-Zellen und Endothelzellen 7,8,9 worden. Die in-vitro-Trauma Modell für die Untersuchung von Nagetieren und menschlichen Astrozyten Reaktivität 10 beschäftigte Drucksteuerungsvorrichtung identisch zu dem, was wir für unser Modell etabliert. Die gleiche Methode wurde angewandt, um Verletzungen durch Stretch induzieren in Maus Hirnkapillarendothelzellen (bEnd3) 11 und kortikalen Neuronen 12,13 sowie, zerebrale endothElial Zellen von neugeborenen Ferkeln 14. Vorrichtung verformt den Boden der Kulturschale wodurch mechanische Dehnung Verletzung 10. Es fügt Verletzungsgefahr kultivierten Zellen durch die Anwendung der Luftdruck über den Zellen. Dieser Druck ausweichen kann die Membran auf dem die Zellen wachsen, wodurch Dehnung der Zellen. Verschiedene Grade der Dehnung (dh &quot;low&quot; mäßig &quot;oder&quot; schweren &quot;) kann durch Einstellen des Luftdrucks Pulsdauer und Intensität entsprechend erreicht werden. Diese Methode der Streck-induzierten Verletzung mit traumatischen Verletzung wurde in vivo 7 korreliert. Außerdem Dieses Verfahren Verletzungsgefahr ermöglicht die präzise Steuerung der extrazellulären Umgebung und können leicht reproduziert werden. Obwohl ein ähnlicher Ansatz wurde bei vielen anderen Zelltypen des Gehirns, einschließlich bEnd3 verwendet wurde, ist unser Modell von Vorteil, dass es nutzt die Mausgehirn mikrovaskuläre Endothelzellen (Cend) erzeugtin unserem Labor. Diese Zelllinie ist ein gut geeignetes Modell der Blut-Hirn-Schranke (BHS). In-vitro-Zellkulturen als Modelle verwendet werden, sollten BBB Eigenschaften, die es ihnen ermöglichen, als Bildschirm dienen Durchlässigkeit besitzen würde. Ein wichtiges Kriterium für eine in vitro Zell-Modell um ein Prädiktor für BBB Permeabilität ist, dass es besitzen sollte physiologisch realistischen Zellarchitektur 15. Obwohl bEnd3 Zellen zeigen charakteristische spindelförmige Morphologie Plattenepithelkarzinom in Kultur 16, zeigen sie unregelmäßig morphogenetic Verhalten in vitro, wobei sie Zysten-Hohlräume anstatt der regulären röhrenförmige Strukturen in Fibringele 17 zu bilden. Darüber hinaus, wenn die Zellen in embryonale und neugeborenen Mäusen injiziert wurden, induziert sie schnell wachsenden Tumoren tödlich embryonalen Mäusen, aber nicht in Neugeborenen und jungen Mäusen. Es wird daher vorgeschlagen, dass ein oder mehrere Prozesse, die die normalen endothelialen Wachstumsfaktor, Migration und Differenzierung verändert wurden oder eliminierted in dieser Zelllinie 18. Auf der anderen Seite zeigen morphologische, immunozytochemische Auswertung von Endothelzellen und BBB Markerexpression, bioelektrischen und parazellulären Flussmessungen dass unser Modell BBB Cend tatsächlich ein geeignetes Modell der BBB 19. Gehirn-Endothel in vivo wird durch einen extrem engen Permeabilität mit trans-endothelialen elektrischen Widerstand (TEER) im Bereich von 2.000-5.000 Qcm 2 gekennzeichnet. Für Untersuchungen des Gehirns Mikrovaskulatur Barriereeigenschaften gegenüber Arzneimitteln, sollte parazellulären Restriktivität und Dichtheit der Zellen berücksichtigt werden. In den meisten Hirn-Endothelzellen (BCEC), wird dies nicht als die Zellen zeigen TEER Bereich 50-100 Qcm 2 20 erhalten. Sich unbegrenzt vermehrende Zelllinie Hirnendothelzellen bEnd3 erzeugt TEER-Werte von nicht mehr als 60 Qcm 2 15. Im Gegensatz Differenzierung CEND Zellen mit Medium, das Serum reduziert AnzeigeTEER-Werte im Bereich von 300 bis 500 Qcm 2 19,21. Bis heute, in-vitro-Modellen der Strecke Verletzungen in kultivierten Endothelzellen des Gehirns sind rar. Daher kann ein in vitro-Modell für Trauma durch Stretch-Verletzungen mit kultivierten Endothelzellen des Gehirns, die als Modell der BBB wirken sich als nützlich erweisen. In diesem Protokoll, präsentieren wir ein in vitro-Modell, dass die tatsächlichen Auswirkungen, die Gehirnzellen, insbesondere Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen der BBB, während TBI erhalten nachahmen könnte. Der Hauptvorteil dieses Modells ist, dass die Höhe der Schädigung der Zellen sowie die extrazelluläre Umgebung leicht in präziser Weise ermöglicht eine einfache Reproduzierbarkeit der Versuchsanordnung gesteuert werden angewendet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cell Injury Controller II</td>
			<td style="width:351px;">Custom Design and Fabrication, Virginia, USA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:431px;"></td>
			<td style="width:435px;">http://www.radiology.vcu.edu/research/customdesign/cic.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Remarks</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflex Culture Plate - Collagen Type I</td>
			<td>Flexcell, Dunn Labortechnik</td>
			<td>BF - 3001C</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:351px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5796</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">A15110-1333</td>
			<td style="width:431px;">final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 &#176;C)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0282</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MEM Vitamin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0373</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Na-pyruvate</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">L0473</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Nonessential amino acids (NEA)</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0293</td>
			<td style="width:431px;">Storage at 4 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">A2212</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS)</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>12676-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td>L11-004</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Image-iT DEAD Green</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>I10291</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C, protected from light</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4744926001</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stretch in brain microvascular endothelial cells (cend) as an in vitro traumatic brain injury model of the blood brain barrier

Aufgrund der hohen Sterblichkeit Vorfall etwa von Schädel-Hirn-Trauma (SHT), Methoden, mit denen ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen daran beteiligt wäre gebracht sind nützlich für die Behandlung. Es gibt sowohl in vivo und in-vitro-Methoden für diesen Zweck. In-vivo-Modellen können tatsächliche Kopfverletzung zu imitieren, wie es während TBI auftritt. Allerdings kann in vivo Techniken nicht für ein Studium an der Zellphysiologie Ebene genutzt werden. Daher wird in vitro Methoden sind vorteilhaft für diesen Zweck, da sie leichter Zugang zu den Zellen und die extrazelluläre Umgebung zur Manipulation bieten. Unser Protokoll stellt ein in vitro-Modell der TBI mit Stretch-Verletzung im Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen. Es nutzt Druck auf die Zellen in flexible Boden Vertiefungen kultiviert. Der ausgeübte Druck kann leicht kontrolliert werden kann und Verletzungen, die von niedrig bis schweren Bereich zu produzieren. Das murineGehirn mikrovaskuläre Endothelzellen (Cend) im Labor erzeugt wird, ein gut geeignetes Modell für die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​wodurch ein Vorteil gegenüber anderen Systemen, die eine ähnliche Technik einzusetzen. Darüber hinaus ist aufgrund der Einfachheit des Verfahrens sind Versuchsanordnungen leicht dupliziert. Somit kann das Modell bei der Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen in TBI am BBB beteiligt sind, verwendet werden.

Zellen auf Kollagen kultiviert Ich angeschwemmt 6-well flexible Boden Kultur Platten (57,75 cm 2) wurden in verschiedenen Graden der Strecke Verletzungen mit der Zelle Bahre Gerät unterzogen. Nach Aussetzen der Zellen Verletzungen, wurden sie unter dem Mikroskop für die Auswirkungen der Stretch-induzierte Verletzung Zellmorphologie untersucht. Es wurde beobachtet, dass stärkere Dehnung der Zellen eine stärkere Zelle Verzerrung ebenfalls beobachtet (Abbildung 1) wurde angelegt. Wie in 1A gezeigt, erscheinen Kontrollzellen, die nicht zu Verletzungen ausgesetzt waren als regelmäßig geformte zerebrovaskuläre Endothelzellen (CEND) ohne Angabe von Zellschwellung oder Verzerrung. Wenn stretch Verletzungen angewendet wurde (1B-D), könnte Verformung unter dem Lichtmikroskop beobachtet werden. Nach dem Dehnen die Zellen stark mit einem Spitzenwert Druck zwischen 3,5-4,5 psi erschienen die CEND Zellen deutlich zurückgezogen, geschwollen und deformiert mit nicht<html> Lage Interzellularräume. Zusätzlich Aufnahme der Lebensfähigkeit Fleck (100 nM Endkonzentration) als der Grad der Dehnung Verletzung erhöht (Abbildung 2) erhöht. Die Lebensfähigkeit Fleck einen Farbstoff impermeant, gesunde Zellen, die permeierenden wenn die Plasmamembran Integrität der Zellen beeinträchtigt wird wird. Der Farbstoff wurde von den meisten der Kontrollzellen ausgeschlossen, daher nur einige der Zellen gefärbt wurden (2A), um gestreckte Zellen (2B-D) verglichen. Mehr Zellen fluoreszieren grün mit einem erhöhten Grad der Strecke Verletzungen. Als biochemische Marker der Schädigung, die Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase (LDH) Enzym wurde auch nach den Anweisungen des Herstellers untersucht. Abbildung 3 zeigt, dass eine wachsende Zelle Stretch Verletzungen erhöht LDH-Freisetzung verursacht. 928/50928fig1.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; Abbildung 1. Lichtmikroskopie Prüfung der normalen vs verletzten Zellen. (A) Normale ungedehnt konfluenten Zellrasen istightly verpackt und verlängert. Wenn Zellen durch Anlegen einer Spitze Druckimpuls 1,8-2,0 psi (dh geringe Dehnung) scheinen sie weniger kompakt gedehnt wurden, angezeigt durch Pfeile Bereiche (B). Wenn die Zellen wurden mit einer mäßig 2,5-3,0 Peak Druckimpuls verletzt erschienen einige von ihnen geschwollen und deformiert (C). Die Zellen werden mit schweren zurückgezogenen Strecke von 3,5-4,5 psi, wie durch den Pfeil (D) gezeigt. 100-facher Vergrößerung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig2.jpg" width="500px" /> Abbildung 2. Fluorescence mikroskopische Untersuchung von normalen Zellen vs verletzten Zellen mit Lebensfähigkeit Fleck 2h nach der Verletzung behandelt A: Kontrolle ungedehnten Zellen BD: gestreckten Zellen (B - niedrig, C - moderate, D - schwer).... 100-facher Vergrößerung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig3.jpg" width="500px" /> Abbildung 3. Lactat-Dehydrogenase (LDH) Enzymfreisetzung in den Überstand nach Strecke Verletzungen. Freigesetzte LDH in das Kulturmedium wurde in verschiedenen Zeitabständen nach Strecke induzierte Verletzung gemessen. LDH wurde als Prozent der gesamten lösbaren LDH (LDH in Medien sowie Zellen) ausgedrückt. Die Werte sind ± SEM. Die n für jeden Zeitpunkt 5 ist, mit Ausnahme des 0 v hrert schwere Strecke, wo n = 3 unterzogen. LDH-Freisetzung aus den Zellen, die zu niedrigen und mittleren Strecke ausgesetzt waren nicht signifikant von der ungedehnten Kontrollen und voneinander. Zellen, die stark gedehnt wurden veröffentlicht eine deutlich größere Menge an LDH zu allen anderen Proben, mit Ausnahme der mäßig gestreckt Probe 1 h verglichen. (P &lt;0.05, Eine ANOVA, Holm-Sidak Methode). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . Tabelle 1. Leitfaden zur Erzeugung von verschiedenen Graden der Strecke Verletzungen. <table border="1"><tbody><tr><th> Regulator Druck </th><th> Spitzendruck </th><th> Grad der Verletzung </th></tr><tr><td> 15 psi </td><td> 1,2-1,5 psi </td><td> &lt;Niedrig </td></tr><tr><td> 20-25 psi </td><td> 1,8-2,0 psi </td><td> Niedrig </td></tr><tr><td> 30-35 psi </td><td> 2,5-3,0 psi </td><td> Moderat </td&gt; </tr><tr><td> 40-50 psi </td><td> 3,5-4,5 psi </td><td> Schwer </td></tr><tr><td> 60 psi </td><td> 4,8 bis 6,0 psi </td><td> &gt; Schwere </td></tr></tbody></table>

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Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In-vitro-Schädel-Hirn-Verletzungen Modelle werden entwickelt, um in vivo Gehirn Verformung reproduzieren. Stretch-induzierte Schädigung für Astrozyten, Neuronen, Gliazellen, Aorten-und Endothelzellen des Gehirns eingesetzt. Allerdings nutzt unser System eine Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​Modell, das Eigenschaften ein zulässiger BBB-Modell ein in vitro-Modell herzustellen TBI besitzt.

Stretchlimousine in Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (CEND) als<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatische Hirnverletzung Modell der Blut-Hirn-Schranke

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

stretch-brain-microvascular-endothelial-cells-cend-as-an-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

14.8K Aufrufe.  Zentrum für operative Medizin der Universität Würzburg.  In-vitro-Schädel-Hirn-Verletzungen Modelle werden entwickelt, um in vivo Gehirn Verformung reproduzieren. Stretch-induzierte Schädigung für Astrozyten, Neuronen, Gliazellen, Aorten-und Endothelzellen des Gehirns eingesetzt. Allerdings nutzt unser System eine Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​Modell, das Eigenschaften ein zulässiger BBB-Modell ein in vitro-Modell herzustellen TBI besitzt. 

Serie: Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

MRI-geführten Störung der Blut-Hirn-Schranke mit Hilfe der transkraniellen fokussiertem Ultraschall in einem Rattenmodell

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Forschung

Medizin

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Rat Modell der Blut-Hirn-Schranke Störung zu Neurovascular Therapeutics Gezielte zulassen

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Einrichten einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Ratte Blut-Hirn-Schranke (BBB): Ein Fokus auf BBB-Undurchlässigkeit und Rezeptor-vermittelten Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

Controlled Cortical Impact-Modell für traumatische Hirnverletzung

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Novel Model of Mild Traumatic Brain Injury for Juvenile Rats

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor vehicle accidents, and falls, a reliable animal model of mTBI had previously not been developed for this important aspect of development. The modified weight-drop technique employs a glancing impact to the head of a freely moving rodent transmitting acceleration, deceleration, and rotational forces upon the brain. When applied to juvenile rats, this modified weight-drop technique induced clinically relevant behavioural outcomes that were representative of post-concussion symptomology. The technique is a rapidly applied procedure with an extremely low mortality rate, rendering it ideal for high-throughput studies of therapeutics. In addition, because the procedure involves a mild injury to a closed head, it can easily be used for studies of repetitive brain injury. Owing to the simplistic nature of this technique, and the clinically relevant biomechanics of the injury pathophysiology, the modified weight-drop technique provides researchers with a reliable model of mTBI that can be used in a wide variety of behavioural, molecular, and genetic studies.

The modified weight-drop technique is an easy, cost-effective procedure used for the induction of mild traumatic brain injury in juvenile rats. This novel technique produces clinically relevant symptomology that will advance the study of mild traumatic brain injury (mTBI) and concussion.

Roman Modell Mild traumatische Hirnverletzung für jungen Ratten

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

Sauerstoff-Glukose Deprivation und Reoxygenierung als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ischämie-Reperfusion Injury Modell zum Studium der Blut-Hirnschranke Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Mouse Model of Single and Repetitive Mild Traumatic Brain Injury

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal neurological deficits and even amnesia. Athletes participating in contact sports are at high risk of exposure to large number of mTBIs. In terms of the level of injury in a sporting athlete, a mTBI is defined as a mild injury that does not cause gross pathological changes, but does cause short-term neurological deficits that are spontaneously resolved. Despite previous attempts to model mTBI in mice and rats, many have reported gross adverse effects including skull fractures, intracerebral bleeding, axonal injury and neuronal cell death. Herein, we describe our highly reproducible animal model of mTBI that reproduces clinically relevant symptoms. This model uses a custom made pneumatic impactor device to deliver a closed-head trauma. This impact is made under precise velocity and deformation parameters, creating a reliable and reproducible model to examine the mechanisms that contribute to effects of single or repetitive concussive mTBI.

Athletes absorb several hundred mild traumatic brain injuries (mTBI)/concussions every year; however, the consequence of these on the brain is poorly understood. Therefore, an animal model of single and repetitive mTBI that consistently replicates clinically relevant symptoms provides the means to advance the study of mTBI and concussion.

Ein Mausmodell der einzelnen und repetitiven milden traumatischen Gehirnverletzung

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

In-Vitro- Assays zur Beurteilung der Blut-Hirn-Schranke Mesh-artigen Gefäßbildung und -störung

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...