Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants GM086822 finanziert. Die Autoren bedanken sich bei Dr. danken. Alec Pakhomov &amp; Paul Wallace (Univ. of Washington Nanotechnologie User Facility (NTUF)) und Andrea Slade (Bruker AXS) für ihre technische Unterstützung durch Experten. DNA AFM wurde an der Univ durchgeführt. Washington NTUF, ein Mitglied der National Nanotechnology Infrastructure Network. Die 2xGal4-2xGRE-luciferease Plasmid wurde freundlicherweise von der Arbeitsgruppe von Dr. Keith Yamamoto (Univ. of California, San Francisco) zur Verfügung gestellt.

1. Vorbereitung DNA-und Protein-Proben, die abgebildet frei von Verunreinigungen sein <ol><li> Isolieren von Biomolekülen zu sein bebildert und in einem geeigneten wässrigen Puffer. Proteine, die abgebildet werden gereinigt kann die Verwendung von Flüssig-Chromatographie 6, gefolgt Immunadsorption durch die Entfernung der Antikörper-und Pellet 1,2 oder Profinity eXact Reinigung und Entfernung tag 7 (Abbildung 2A). Isolieren Sie DNA-Moleküle durch Miniprep Reinigung (Abbildung 2B) abgebildet werden. </li><li> Bestätigen Zusammensetzung und Reinheit von Protein-Proben, die abgebildet mit SDS-PAGE und Western Blot werden. Für die DNA, bestätigen Sequenz und Reinheit durch Ausfüllen eines Restriktionsverdau und Gelelektrophorese. </li><li> Inkubieren Proben in einem AFM Adsorption Puffer, um die Einhaltung der Probe auf Glimmer zu fördern. Für Protein-Proben können 10 mM HEPES-Puffer verwendet werden. Zusätzliche Low-Ionenstärke Salzen oder anderen Cofaktoren können ebenfalls hinzugefügt werden. Für die DNA-Proben umfassen ein zweiwertiges Kation (z. B. Mg 2 + oder Ni 2 +), um die Adsorption der Glimmer-Substrat zu fördern. Ein geeignetes Mg 2 +-haltigem Puffer für DNA ist 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 3. Eine Alternative Ni 2 +-Puffer 10 mM HEPES, pH 6,8, 10 mM NiCl 2. </li><li> Verdünnen Sie die Probe auf eine Konzentration von 5 ug / ml in der Adsorption Puffer. Vorsichtig mischen. Auf Eis, während das Mikroskop vorbereitet wird. </li></ol> 2. Montage AFM-Sonde <ol><li> Legen Sie die Flüssigkeit Zelle Sondenhalter auf den entsprechenden freitragenden Einbau-Dockingstation. </li><li> Suchen Sie den langen, dicken Cantilevers (bezeichnet als &#39;B&#39; Freischwinger) der scharfen Nitrid Hebel (SNL) Sonde für die Bildgebung verwendet werden. Sorgfältig übertragen, um die Flüssigkeit Zelle Sondenhalter, sicherzustellen, dass die Spitze aufrecht bleibt. Technischer Hinweis: Besondere Vorsicht bezahlt werden muss, während die Sonde auf der Durchreise sind, und lassen Sie sie von jeder beliebigen Höhe kann zu Schäden oder Zerstörung der Freischwinger oder Spitze. Ein microlever SNL (MSNL) Sonde kann als Alternative zu den SNL-Sonde verwendet werden. </li><li> Entfernen Sie die Sonde Halter aus der Docking-Station und untersuchen die Cantilever unter einem Lichtmikroskop zu gewährleisten, ist es intakt und ordnungsgemäß in die Flüssigkeit Zelle Sondenhalter sitzt. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die AFM Kopf aus dem Instrument Schwalbenschwanz Montage durch Anziehen der Rändelschraube Klemmschraube. Technischer Hinweis: Besondere Vorsicht bezahlt werden muss, während die Manipulation der AFM Kopf, und lassen Sie sie von selbst eine kurze Strecke (z. B. wenn sie nicht richtig in den Schwalbenschwanz Montage sitzend) kann zu erheblichen Schäden. </li><li> Kehren Sie die AFM Kopf und fest drücken Sie die Flüssigkeit Zelle Sondenhalter auf die vier Stifte an der Unterseite des AFM Kopf. Vorsichtig wieder die AFM Kopf in das Gerät Schwalbenschwanz Montage. Lassen Sie die Rändelschraube Klemmschraube an die AFM Kopf in das Gerät zu befestigen. </li></ol> 3. Locating Cantileverspitze, Ausrichten Laser und Einstellen Photodetektor <ol><li> Mit dem AFM Instrument Software, suchen Sie die Cantilever-Spitze, indem Sie die Knöpfe der Onboard-Lichtmikroskop. Passen Sie die Beleuchtung des Mikroskops, wenn nötig bis zur Spitze Identifikation zu verbessern. Bringen Sie das Ende des Auslegers Spitze in der Nähe des Fadenkreuzes auf der Geräte-Software angezeigt. </li><li> Bringen Sie die Cantilever-Spitze in den Fokus, indem die oben und unten Pfeile der Optik-Controller an die Software. Verwenden Sie langsam (S) oder medium (M) Geschwindigkeit, während die Anpassung der Optik. </li><li> Richten Sie den Laser auf die Cantilever-Spitze mit dem Laser Einstellknöpfe. Bewegen Sie die Einstellknöpfe, bis der rote Laser in das weiße Ausleuchtung vor Ort. Trace entlang der Ausleger mit einem Zick-Zack-Muster, bis der Laser auf der Cantilever-Spitze positioniert ist. Wenn sie richtig ausgerichtet ist, wird eine starke Reflexion vor Ort in die Frontscheibe des AFM Kopf erscheinen. </li><li> Zentrum der Photodetektor durch Anpassung der Photodetektor Noppen auf der AFM Kopf. Dies wird der Laserpunkt in das Fadenkreuz der Photodetektor Anzeige der Geräte-Software ausrichten. Das beobachtete Signal Summe sollte etwa 4-6 werden. </li></ol> 4. Positioning AFM Kopf-und Tuning-Cantilever <ol><li> Legen Sie eine frisch gespaltene Blatt Glimmer an einem Metall-AFM Probe-Disc auf die magnetisierten Probenhalter Spitze des AFM Halteplatte. Dieses Setup wird verwendet, um die AFM Kopf vor der Abbildung der DNA-oder Protein-Probe in Schritt 1 vorbereitet Position sein. <ol><li> Technischer Hinweis: Die magnetisierten Probenhalter und flüssige Zelle Sondenhalter sind dicker als andere Probe Befestigungsmechanismen und Sondenhalterungen. Wenn es derzeit keine ausreichenden Abstand zwischen den Glimmer-Probenhalter Montage-und AFM Kopf, bewegen Sie die AFM Kopf hoch, indem Sie den Rücktritt Symbol auf der Geräte-Software mehrere Male. </li></ol></li><li> Drehen Sie das AFM Halteplatte so die Probe Disc für das erste bildgebende positioniert ist. Sicherstellen, dass die Glimmer-Substrat unter dem AFM Kopf zentriert ist. </li><li> Bewegen Sie die AFM Kopf nach unten in Richtung derOberfläche der Glimmer-Probenteller mit dem Schwerpunkt Oberfläche Steuerung der Geräte-Software. Wählen Sie das Medium (M) Geschwindigkeit auf der Z-Motor, und weiter in Richtung der Oberfläche, bis die AFM Spitze beträgt ca. 2 mm über dem Glimmer. Zu diesem Zeitpunkt, um mit dem langsamen (S) Z Motordrehzahl, um abrupte Kontakt zwischen der Sonde und der Oberfläche (im Folgenden als Absturz der Spitze) zu vermeiden wechseln. </li><li> Fahren Sie mit der Sonde näher an den Glimmersubstrat Oberfläche zu bewegen, bis deutliche Merkmale auf der Glimmer-Oberfläche oder die Spitze Reflexion im Mittelpunkt stehen. Umschalten zwischen Oberfläche und Spitze Reflexion Brennebenen mit dem &quot;Fokus auf:&quot; Symbol aus der Gerätesoftware. </li><li> Wählen Sie die Melodie Symbol aus der Geräte-Software und stellen Sie den Ausleger. Die Resonanzfrequenz der empfohlenen SNL und MSNL Cantileversonden ist 20-60 kHz. Wählen Sie einen 5% peak ausgeglichen. Technischer Hinweis: Ausreichende Cantilever-Tuning ist für eine ausreichende Probe Bildgebung unverzichtbar. </li></ol> 5. Imaging Glimmer Probenoberfläche <ol><li> Engage der Sonde auf die Glimmer-Oberfläche. Set ersten Scan Größe bis 10 um und Abtastrate bis 1 Hz. Integral gewinnen und Proportionalverstärkung kann zunächst auf 0,2 und 0,4 eingestellt werden, bzw.. Passen Sie Gewinne als erforderlich, um Spuren haben und verfolgen Scans etwa überlappen. Eine Verringerung der Amplitude Sollwert erhöht sich die Wechselwirkung zwischen der Sonde und der Glimmer und sicherzustellen Engagement. </li><li> Erfassen kompletter Scan Bilder des 10 pm Feld. Abnahme Scanformat bis 5, 1 und 0,5 mu m und Capture abzuschließen Bilder der einzelnen Felder. Passen Gewinne und Abtastrate wie nötig. Die Aufnahme von Bildern der Glimmer-Oberfläche bietet eine Grundlage für den Vergleich der DNA-und Protein-haltigen Proben. </li><li> Lösen Sie die Sonde mit einem einfachen Klick auf das Lösen Symbol auf der Geräte-Software. </li></ol> 6. Imaging von Biomolekülen von Interesse <ol><li> Vorsichtig mischen die DNA-oder Protein-Probe in Schritt 1 vorbereitet und bereiten Sie es auf der abgebildeten Glimmer-Oberfläche zu laden. Mix 5 ul der vorbereiteten Probe mit 45 ml frisches Adsorption Puffer (Endprobe Konzentration = 0,5 ug / ml). </li><li> Vorsichtig 50 ul der 0,5 ug / ml Biomolekül-haltigen Lösung direkt auf die Glimmer-Oberfläche. Tun Sie dies, ohne die Sonde oder AFM Kopf und sorgen für die Probelösung (aber nicht Pipettenspitze) in Kontakt mit der Sonde. </li><li> Pause 5 Minuten, damit die Biomoleküle in der Probe auf die Glimmer-Oberfläche haften. </li><li> Am Ende der 5 Minuten, pipet eine zusätzliche 50-100 &amp;mgr; l der Adsorption Puffer in die Flüssigkeit Zelle Sondenhalter darauf achten nicht zu berühren die Sonde, AFM Kopf, oder Glimmer mit der Pipettenspitze. Dies bildet einen Meniskus und damit für AFM-Tapping-Modus Bildgebung in der Flüssigkeit. Abbildung 3 zeigt die endgültige Anordnung der Flüssigkeit Zelle, Freischwinger, Probe, Probenhalterung und Meniskus. </li><li> Danach ist der Photodetektor und richten Sie den Laser auf die Cantilever wie nötig. Technischer Hinweis: Zum Betrachten der Sondenspitze und Laser-Ausrichtung wird durch das Beugungsmuster, indem Probenpuffer in den Sondenhalter verursacht kompliziert. Manuell neu einstellen zu dem Ausleger, wenn nötig. </li><li> Re-greifen die Sonde mit der Gerätesoftware. Einstellen der vertikalen Auslenkung, integrale Verstärkung und Proportionalverstärkung wie nötig. Dies wird den Prozess der Re-Imaging Abschnitt von Glimmer gescannt unmittelbar vor Zugabe Probe und Erfassen von Bildern. </li><li> Erhöhen Scangröße (500 nm-10 um) in Regionen von Interesse zu identifizieren. Zoom-in und reduzieren Abtastrate bis 0,5 Hz bis Bildauflösung zu verbessern </li><li> Sobald Imaging abgeschlossen ist, lösen Sie die Sonde durch die Auswahl zurückzutreten Symbol auf der Geräte-Software mehrere Male. Ausreichend Freiraum zwischen der AFM Spitze und Probe-Disc vor der Demontage des flüssigen Zell-oder Probe-Disc. </li><li> Spülen Sie die Flüssigkeit Zelle Sondenhalter und Probenteller mit destilliertem Wasser, Salz die Bildung von Kristallen als Rest-Adsorption Puffer verdunstet zu verhindern. Dry mit Druckluft. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Beispiele für AFM-Aufnahmen sind in Abbildung 4 dargestellt. Mica-Substrat (A) bietet eine molekular flachen Oberfläche, auf die DNA-und Protein adsorbieren kann. Imaging Glimmer vor Biomolekül Proben eine negative Kontrolle und Beurteilung der Bildgebung Lärm. Es bietet auch ein Maß an Gewissheit, dass der Ausleger richtig eingestellt ist und die anschließende Probe Bildgebung erfolgreich sein wird. Doppelsträngige Plasmid-DNA (B, D), mutmaßlich supercoiled, ist leicht durch seine asymmetrische Erscheinungsbild und einheitliche Ablage auf dem zuvor unauffällig Glimmersubstrat identifiziert. Protein-Komplexe von diskreten Partikelgrößen (C, E) sind ebenfalls eindeutig unterscheidbar von den Glimmer-Substrat. Partikelgröße Unterschiede zeigen Probe Heterogenität und kann nützlich sein, auf eine Angleichung Protein-Komplex Stöchiometrie oder biochemische Aktivität. Die allgemeine diagonal Form und die konsequente Ausrichtung der Protein Partikel in Panel C beobachtet ist ein bildgebendes Artefakt, wie Proteine ​​erwartungsgemäß wäre auf dem Glimmer-Substrat orientiert nach dem Zufallsprinzip. Mögliche Ursachen der beobachteten Artefakt ist ein physischer Spitze Anomalie oder AFM in zu schnell von einer Scan-Rate. Während Spitze Faltung (siehe Abbildung 1B) verhindert absolute Längenmessung Berechnungen in der x-und y-Achsen, Höhenmessung (z-Achse) und die relative x-und y-Messungen kann dennoch nützlich für die Abschätzung biophysikalischen Eigenschaften der abgebildeten Biomolekülen. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Tapping-Modus Rasterkraftmikroskopie (AFM). A, das Mikroskop. Am Ende des Auslegers ist eine scharfe Spitze, die bis schwingt auf und ab, während sie über die Oberfläche eines Glimmer-Substrat-Scans, um die biomolekularen Komplexen adsorbieren. Da der Scanner bewegt sich in x-und y-Richtung, wird ein Laserstrahl von der Rückseite des Cantilevers auf eine Position Sensitive Photodioden-Detektor reflektiert wird, um die vertikale (z) Abstand zur Spitze bewegt, wie es über die biomolekularen Komplexen auf den sitzenden Pässe Karte Glimmer. B. Verzerrung des Bildes in x-und y-Richtung durch die Spitze Faltung verursacht. Die nominelle Radius eines herkömmlichen Siliciumnitrid-Spitze ist größer als die Partikel, die abgebildet werden, und der Rand der Spitze in Kontakt mit der Probe beim Durchqueren der Oberfläche. Tipp Faltungsergebnisse in der abgebildeten Partikel erscheinen größer in der x-und y-Richtung, nicht aber die z-Richtung. Dieser Effekt kann durch die Verwendung von Spitzen mit einem kleineren nominal Spitzenradius minimiert werden. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2: Illustration der immunoadsorbed Protein-und DNA Probenvorbereitung. A, Veröffentlichung immunoadsorbed GR • Hsp70-Protein-Komplex aus dem monoklonalen Antikörper (mAb)-Protein A-Sepharose (PAS) Pellets. Inkubation des immunopellet mit einem Peptid, das die mAb Epitop erleichtert die Freigabe der GR • Hsp70-Protein-Komplex aus dem Pellet, so dass der Komplex aus dem Überstand und visualisiert durch AFM gesammelt werden. B, erfordert Vorbereitung der DNA für die AFM die Verwendung eines zweiwertigen Kations Adsorption Puffer. Die zweiwertigen Kations erhöht die Affinität der DNA für die Glimmer-Substrat. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3: Final Anordnung der AFM Spitze, flüssige Zelle Sondenhalter, Probe, Probenhalter und Puffer Meniskus. A, darauf zu achten, bei der Hinterlegung Probe und zusätzlichen Puffer auf die Glimmer-Substrat, um körperlichen Kontakt zwischen der Pipettenspitze und AFM Kopf, Flüssigkeit nennen, und Glimmer-Substrat zu vermeiden. B, Vergrößerung von A. Der Puffer Meniskus reicht von der Objektplatte, um die Flüssigkeit Zelle Sondenhalter. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4: Atomic Force Aufnahmen von Glimmer-Substrat (A), 2xGal4-2xGRE-luciferease Plasmid-DNA 8 (B, D) und GR • Hsp70-Protein-Komplexe (C, E) in einer gepufferten Lösung. Mica dient als Kontrolle Bild mit der Visualisierung von DNA und Protein zu vergleichen. GR • Hsp70-Protein-Komplexe wurden durch Immunadsorption von GR mit hsp70 und dann aus dem Antikörper-Bead-Pellet freigesetzt mit einem mAb konkurrierenden Antikörper (dargestellt in Abbildung 2A) grundiert vorbereitet. DNA wurde durch konventionelle Plasmid Miniprep vorbereitet. Panels A, B und C ein Äquivalent Vergrößerung (Maßstab = 200 nm) sind, wie auch Panels D und E (Maßstab = 40 nm).

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AFM bietet eine einzigartige mikroskopischen Technik in der Lage Bildgebung einzelnen unbeschichteten Biomolekülen in wässrigen und nahezu physiologischen gepufferten Lösungen in Echtzeit. Dies ermöglicht die Visualisierung der einzelnen Proteine ​​und DNA-Moleküle, sowie Multiproteinkomplexen-und Protein-DNA-Komplexe. Imaging makromolekularen Teilchen mit AFM kann nützlich sein für die Beurteilung der Probe Homogenität und zur Ermittlung der physikalischen Anordnung der Bestandteile der beobachteten Teilchen. Dieser Ansatz der Beobachtung einzelner makromolekulare Partikel können eine sinnvolle Ergänzung sein zu herkömmlichen biochemischen Techniken, wie Immunpräzipitationsassays, Polyacrylamidgelelektrophorese und Size-Exclusion-Säulenchromatographie, die erhebliche summative Daten, die den 10 3 -10 11 einzelnen biomolekularen Komplexen von Interesse anwesend bieten in einer Probe. Die Erforschung Multiproteinkomplex Stöchiometrie biomolekularen Wechselwirkungen und Cofaktor Anforderungen können alle untersuchten mittels AFM werden. Die hier vorgestellte Methode lässt sich an spezifischen biophysikalischen Fragestellungen von Interesse aufnehmen werden. Zum Beispiel mit einer Flüssigkeit Zelle Sondenhalter der Lage, den Austausch von Puffer, wird es möglich sein, Assay-Cofaktor für Protein-Komplexbildung. DNA-Protein-Baugruppen gebildet und getrennt werden, während sie abgebildet in near-real-time und sogar. DNA kann mit spezifischen Sequenzen von Interesse (zB ein mutmaßliches Response-Elementen oder neuartige Protein-Bindung Sequenz), mit der Hypothese bindendes Protein gemischt erzeugt werden, und abgebildet, einen direkten Nachweis von intermolekularen Wechselwirkungen liefern. Tapping Mode-AFM-Bildgebung ist wesentlich weniger kompliziert, wenn trockene Proben statt Proben in wässrigen Lösungen, und lineare DNA steht und geschlossenen Kreis DNA-Plasmide haben beide auf diese Weise 3,9 abgebildet worden sind verwendet. Die hier vorgestellte Methode nutzt Proben in gepufferten Lösungen, um eine physiologische Bildgebung Umfeld zu schaffen. Andere bemerkenswerte Methoden der Bildgebung Proteine ​​sollten ebenfalls berücksichtigt werden, einschließlich Nahfeld Infrarot-Mikroskopie 10. Die komplementäre Nutzung der Immunadsorption in Gemahlin mit AFM bietet die Möglichkeit, eine Vielzahl von Protein-Komplexe, mit gut etablierten biochemischen Techniken, und dann visualisieren folgende Entlassung aus dem immunoadsorbing Antikörper-Bead-Pellet. Zum Beispiel hat immunoadsorbed GR für seine Assoziation mit der molekularen Chaperon-Protein hsp70 1 sowie die Dynein Motorprotein untersucht 2 mit diesem Ansatz, um komplexe Größe und Stöchiometrien zu schätzen. Partikelgröße und biophysikalischen Eigenschaften (zB Festigkeit) haben sich als nützlich erwiesen bei der Ermittlung der Identität der Biomoleküle in AFM abgebildet Proben 11,12 beobachtet. Es ist auch möglich, Biomolekül Identität durch die Zugabe von einem interagierenden Biomolekül (zB ein Ligand oder monoklonale Antikörper), die zu seinem Ziel und verursachen eine Teilchengröße erhöhen binden würde, wenn das Ziel-Biomolekül vorhanden ist zu bestätigen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Dimension 3100 </td><td> Bruker </td><td> Dimension 3100 </td></tr><tr><td> Dimension Fluidzelle </td><td> Bruker </td><td> DTFML-DD-HE </td></tr><tr><td> Sharp-Nitrid-Hebel (SNL) Siliziumnitrid AFM-Sonde </td><td> Bruker </td><td> SNL-10 </td></tr><tr><td> Microlever scharfe Nitrid Hebel (MSNL) Siliziumnitrid AFM-Sonde </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td></tr><tr><td> NanoScope AFM Gerätesoftware </td><td> Bruker </td><td> 004-132-000 </td></tr><tr><td> Metall AFM Objektplatten </td><td> Ted Pella </td><td> 16208 </td></tr><tr><td> Grade V1 Mica Discs, 12 mm </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td></tr></tbody></table>

visualization of recombinant dna and protein complexes using atomic force microscopy

Atomic Force Microscopy (AFM) ermöglicht die Visualisierung der einzelnen Proteine, DNA-Moleküle, Protein-Protein-Komplexe, und DNA-Protein-Komplexen. Am Ende des Mikroskops Freischwinger ist ein Nano-Sonde, die Traversen Bildbereiche von Nanometern bis Mikrometern, die Messung der Höhe von Makromolekülen ruht auf der Substratoberfläche zu einem bestimmten Zeitpunkt. Elektrostatische Kräfte verursachen Proteine, Lipide und Nukleinsäuren zu locker an das Substrat in zufälligen Orientierungen legen und erlauben Bildgebung. Die generierten Daten ähneln einer topographischen Karte, wo die Makromoleküle als dreidimensionale Teilchen diskrete Größen (Abbildung 1) 1,2 lösen. Tapping-Modus AFM beinhaltet die wiederholte Schwingung des Cantilevers, die Bildgebung des relativ weichen Biomaterialien wie DNA und Proteine ​​ermöglicht. Einer der bemerkenswertesten Vorteile von AFM gegenüber anderen nanoskaligen Mikroskopie-Techniken ist die relative Anpassbarkeit an individuelle Proteine ​​und makromolekulare Komplexe in wässrigen Puffern, darunter nahezu physiologischen gepufferten Bedingungen, in Echtzeit und ohne Flecken oder Beschichtung der Probe, die abgebildet werden zu visualisieren. Die hier vorgestellte Methode beschreibt die Darstellung von DNA und einer immunoadsorbed Transkriptionsfaktor (dh den Glucocorticoid-Rezeptor, GR) in gepufferter Lösung (Abbildung 2). Immunoadsorbed Proteinen und Protein-Komplexe können aus den immunoadsorbing Antikörper-Bead-Pellet durch den Wettbewerb mit dem Antikörper-Epitop und dann abgebildet (Abbildung 2A) getrennt werden. Dies ermöglicht für die biochemische Manipulation von Biomolekülen von Interesse vor Bildgebung. Nach der Reinigung kann die DNA und Proteinen gemischt und die resultierende Interaktion Komplex kann auch abgebildet werden. Die Bindung von DNA auf Glimmer erfordert ein zweiwertiges Kation 3, wie Ni 2 + oder Mg 2 +, die Probenpuffer hinzugefügt werden noch werden halten Protein-Aktivität. Mit einem ähnlichen Ansatz hat AFM verwendet worden, um einzelne Enzyme, darunter RNA-Polymerase 4 und ein Reparatur-Enzym 5, gebunden, einzelne DNA-Stränge zu visualisieren. Diese Experimente liefern wichtige Einblicke in die Protein-Protein-und DNA-Protein-Interaktionen biophysikalischen statt auf der molekularen Ebene. Imaging einzelnen makromolekularen Teilchen mit AFM kann nützlich sein für die Bestimmung Teilchen Homogenität und zur Ermittlung der physikalischen Anordnung der Bestandteile der abgebildeten Partikel. Während die vorliegende Methode zur Visualisierung von GR-Chaperon-Protein-Komplexe 1,2 und DNA-Stränge, auf die die GR binden können entwickelt wurde, kann es im Großen und Ganzen zu bildgebenden DNA-und Protein-Proben angewandt werden aus einer Vielzahl von Quellen.

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Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

A-Tapping-Modus Rasterkraftmikroskop (AFM)-Methode zur Visualisierung von Plasmid-DNA, cytoplasmatische Proteine ​​und DNA-Protein-Komplexen beschrieben. Das Verfahren umfasst das alternative Ansätze zur Vorbereitung der Proben für AFM folgenden biochemischen Manipulation. DNA mit spezifischen Protein interagiert Regionen sind in der Nähe-physiologischen Puffer Bedingungen beobachtet.

Visualisierung von rekombinanten DNA-und Protein-Komplexe mit Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.3K Aufrufe.  Seattle University. A-Tapping-Modus Rasterkraftmikroskop (AFM)-Methode zur Visualisierung von Plasmid-DNA, cytoplasmatische Proteine ​​und DNA-Protein-Komplexen beschrieben. Das Verfahren umfasst das alternative Ansätze zur Vorbereitung der Proben für AFM folgenden biochemischen Manipulation. DNA mit spezifischen Protein interagiert Regionen sind in der Nähe-physiologischen Puffer Bedingungen beobachtet.

Serie: Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Bakterielle Immobilisierung für Imaging von Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Forschung

Biotechnik

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Endothelial Glykokalyx mit Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Oberflächenpotentialmessung von Bakterien mit Kelvin-Sonde Kraftmikroskopie

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in Parkinson&#8217;s disease and beta-amyloid and tau in Alzheimer&#8217;s disease, it is critically important to develop morphology specific reagents that can selectively target these disease-specific protein variants to study the role of these variants in disease pathology and for potential diagnostic and therapeutic applications. We have developed novel atomic force microscopy (AFM) based biopanning techniques that enable isolation of reagents that selectively recognize disease-specific protein variants. There are two key phases involved in the process, the negative and positive panning phases. During the negative panning phase, phages that are reactive to off-target antigens are eliminated through multiple rounds of subtractive panning utilizing a series of carefully selected off-target antigens. A key feature in the negative panning phase is utilizing AFM imaging to monitor the process and confirm that all undesired phage particles are removed. For the positive panning phase, the target antigen of interest is fixed on a mica surface and bound phages are eluted and screened to identify phages that selectively bind the target antigen. The target protein variant does not need to be purified providing the appropriate negative panning controls have been used. Even target protein variants that are only present at very low concentrations in complex biological material can be utilized in the positive panning step. Through application of this technology, we acquired antibodies to protein variants of TDP-43 that are selectively found in human ALS brain tissue. We expect that this protocol should be applicable to generating reagents that selectively bind protein variants present in a wide variety of different biological processes and diseases.

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Novel Rasterkraftmikroskopie.Wie Biopanning für Isolierung von Morphologie Spezifische Reagenzien gegen TDP-43 Varianten in Amyotrophe Lateralsklerose

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

Visualisierung von Germinosomes und die innere Membran in Bacillus Subtilis Sporen

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Anwendung der Atomkraftmikroskopie zur Erkennung früher Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automatisierung von Bio-Rasterkraftmikroskop-Messungen an Hunderten von C. albicans-Zellen

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...