Wir erkennen die Sachspenden von Bakterienstämmen aus den Gruppen von Prof. Judith Armitage (University of Oxford, UK) und Prof. Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London, UK). IMD wird gemeinsam von der Abteilung für Biochemie (Oxford University) und OCISB finanziert werden; AR wird durch ein Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) DTC-Stipendium finanziert werden; ND wird von der Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) finanziert werden; MCL ist finanziert durch ein Royal Society University Research Fellowship.

<ol><li> Zu Beginn dieses Verfahrens wurden 50 ul eingefroren Bestände fluoreszierendes Protein exprimieren Escherichia coli Bakterienzellen werden zunächst aufgetaut und aerob unter Schütteln in 5 ml LB Nährmedien über Nacht bei 37 Grad C. Am Morgen gewachsen ist 50 ul dieser gesättigten Kultur extrahiert und Subkultur in minimal M63 Glukose Kulturmedien, Inkubation bei 30 ° C für 4 bis 6 Stunden. Hier zeigen wir mit zwei verschiedenen Zell-Stämme, von denen ein Elektron-Transport drückt Cytochrom fusioniert an GFP, die andere, die ein Protein in der bakteriellen Flagellen Motor fusioniert an GFP beteiligt ausdrückt. </li><li> Zellen können entweder direkt aus dem wachsenden Subkultur geerntet, wenn sie anzusehen als immobilisierte Proben, oder sie können geschert, um bakterielle Flagellen abschneiden, wenn Anzeige unter &quot;angebunden&quot; Bedingungen. </li><li> Shearing geht darum, in der Regel 1-5ml der Subkultur in ein Gerät, bestehend aus zwei sterile Spritzen mit sterilen Rohrleitungen verbunden. Die Scherung wird durch wechselseitiges Drücken in jedem Spritzenpumpe, die Kultur durch die engen Schlauch schieben getan. Dies ist 50-100 mal getan, je nach Ausmaß der Scherung erforderlich. Die Kultur wird dann zu Pellets der Zellen, die in Minimalmedium resuspendiert ist Geißeln Fragmente zu entfernen zentrifugiert. </li><li> Wir bereiten dann BK7 Deckgläser durch Eintauchen in eine gesättigte Lösung von KOH in Ethanol für 20 min gereinigt, gründliches Waschen in deionisiertem Wasser und Ethanol und verlassen an der Luft trocknen für mindestens 1 h </li><li> Wir bauen einen einfachen Flow-Zelle, die Zellen im Mikroskop Haus. Dazu gehört das Zeichnen von Linien von Paraffin Fett auf BK7 Glas-Objektträger und dann eine Tunnel-Sandwich, indem Sie eine der gereinigten coverlips oben und nach unten drücken vorsichtig mit einer Pinzette, mit einer Liefermenge Zellvolumen von 5-10 ul . </li><li> Zur Beobachtung immobilisierten Zellen füllen wir den Fluss-Zelle durch Injektion mit einer 0,1% w / v Lösung von Poly-L-Lysin, und lassen Sie es bei Raumtemperatur für mindestens 1 min inkubieren. Wir haben dann spülen mit 100 ul minimal Medien durch Einspritzen von den Medien von einem Ende des Flow-Zelle und Feuchtigkeitsregulierung mit Seidenpapier von den anderen. </li><li> Wir haben dann bis 20 ul einer 1:500 Verdünnung von 200 nm Durchmesser Latexmikrokügelchen (Polysciences) in Minimalmedium zu dem Deckglas Oberfläche markieren Docht. Die Flow-Zelle wird invertiert, so dass das Deckglas nach unten zeigt, auf einer Plattform deutlich von der Oberfläche in eine einfache feuchte Kammer gelegt, und über Nacht bei Raumtemperatur für 5 min. Unbound Kügelchen werden dann entfernt Feuchtigkeitstransport durch 100 ul Minimalmedium gewaschen. </li><li> Wenn wir angebunden Zellen zu beobachten, wollen wir auslassen des Poly-L-Lysin Schritt und stattdessen füllen Sie das Flow-Zelle mit 5 mg / ml anti-Flagellin-Antikörper. Die Flow-Zelle ist in der feuchten Kammer für 10 min und wird dann durch durch Feuchtigkeitsregulierung gespült. </li><li> 20 ul der Zellkultur wird dann durch das Flow-Zelle böse, entweder über die geschert Probe, wenn die Beobachtung angebunden Zellen oder die ungescherten Probe in Betrachtung immobilisierten Zellen. </li><li> Die Flow-Zelle wird umgedreht und in der feuchten Kammer für 20 min. Unbound Zellen werden dann durch Feuchtigkeitsregulierung durch 100 ul Minimalmedium gewaschen. </li><li> Ein Tropfen Immersionsöl ist in der Mitte der Oberseite des Deckglases gesetzt und die Flow-Zelle wird dann sanft auf den Probenhalter des custom built Fluoreszenzmikroskop platziert, wodurch optischen Kontakt mit der hohen numerischen Apertur Objektiv. </li><li> Das Mikroskop Elektron-Multiplikation Kamera eingeschaltet ist und die Kamera auf bis -70 Grad C gekühlt werden, ist die Software gesetzt, um Bilder in einem typischen Bildrate von 25 Hz in Frame-Transfer-Modus zu erwerben, zunächst disenabling den Gain-Regler auf der Kamera. </li><li> Die Hellfeldbeleuchtung wird eingeschaltet und das Bild wird in den Mittelpunkt gerückt, die Auswahl einer geeigneten Zelle oder Gruppe von Zellen auf der Grundlage ihres Seins mit ihrer Längsachse parallel zur Oberfläche Deckglas geklebt abgebildet werden. Der Schwerpunkt liegt dabei fein eingestellt, um sicherzustellen, dass die 200 nm Latexkügelchen hielt sich an die Oberfläche Deckglas gerade im Fokus sind. </li><li> Eine Bildsequenz in Hellfeld erworben, um den Umriss der Zellkörper aufnehmen. Das Hellfeld ist ausgeschaltet und die Kamera zu gewinnen ist auf maximal aktiviert. </li><li> Für einen Standard-Akquisition mit Total Internal Reflection Fluorescence (oder TIRF) mit einem Laserstrahl über entsprechende Wellenlänge (hier grün fluoreszierende Protein Anregung verwenden wir eine 473 nm-Laser) wird so in der hinteren Brennebene fokussiert werden voreingestellt das Objektiv, sondern seitlich von der optischen Achse verschoben, um eine evaneszente Feld für Fluoreszenzanregung in die Zelle Probe zu erzeugen. </li><li> Die Kamera Übernahme wird gestartet und der Laser Shutter geöffnet, um den fluoreszierenden Proteinen innerhalb der Bakterien erregen. Die Parameter für die Laser-Intensität und Geschwindigkeit des Erwerbs müssen für das jeweilige biologische System Gegenstand von Ermittlungen durch das Experimentieren mit verschiedenen Werten optimiert werden, aber eine typische Reichweite rELEVANT zu studieren mobilen Protein-Komplexe in der Zellmembran sind 1-10 mW Laserleistung über einen kreisförmigen Anregungsbereich mit einem Durchmesser von ~ 30 um, mit einer Belichtungszeit pro Einzelbild von 5-40 ms. Die Proben werden bis gebleicht, in der Regel für ~ 10 s. beleuchtet </li><li> Dieses Protokoll kann sowohl für die angebundenen Zellen, in denen die Körper der Zelle über einen Punkt der Befestigung zwischen dem Deckglas und Flagellen Stub dreht, und für immobilisierte Zellen, die fest mit dem Deckglas Oberfläche fixiert werden. </li><li> Einige Zellen Stämme, die eine hohe Kopienzahl von Komplexen aus einer anfänglichen beugungsbegrenzt fokussierten Laser Bleichmittel auf dem einen Pol der Zelle vor der TIRF Bildgebung profitieren. Das Bleichmittel ist gleichbedeutend mit, dass in Fluorescence Recovery After Photobleaching (oder FRAP) verwendet. Mit unseren Kunden Mikroskop einige der Anregung Laserlicht in ein zweites unabhängiges Pfad für FRAP-type Bleichen eingesetzt eingespeist werden. In der Regel 1-10mW Laserleistung verwendet wird, mit einem typischen Bleiche Zeit im Bereich 10-300 ms. Dies führt zu viel höheren Bildkontrast in der gebleichten Zone der Zelle ermöglicht einzelnen Komplexe, die anschließend in diesem Bereich diffuse leichter sichtbar gemacht werden. </li><li> Zur Visualisierung Komplexe im Zytoplasma der Zelle, die viel schneller als die in der Zellmembran eine andere Beleuchtung Modus namens &quot;slimfield&quot; beschäftigt ist diffus. Hier wird ein fokussierter Laserstrahl wird erweitert seitlich nur umfassen eine einzelne Zelle. Dadurch entsteht ein sehr intensives Feld ermöglicht viel schneller Aufnahmen von typisch einer Millisekunde zu ergreifen. </li><li> Nach der Datenerfassung werden die Bilder in eigens geschriebenen Software (codiert in LabVIEW 8.5) zugeführt. Dieser erkennt automatisch die Position der fluoreszierenden Flecken in den Zellen zu einer Genauigkeit von typischerweise wenigen Nanometern und Auszüge ihrer Größe und Helligkeit. Die brightnessof die photobleaching Trace mit Bezug auf die Zeit von ein Kettenfahrzeug molekularen Komplex dann verwendet wird, um die Stöchiometrie Schätzung, dh wie viele einzelne fluoreszierende Proteine ​​bilden eine einzelne molekularen Komplex. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Wenn das Protokoll korrekt ausgeführt wird, die Bilder der Zellen im Hellfeld betrachtet wird sehr deutlich, mit dem Perimeter der Zellkörper dunkel gegen einen weiß / grau Zellkörper (Abb. 1a). In Fluoreszenz mit immobilisierten Zellen, können wir sehen deutliche Flecken Intensität, der typischerweise 250-300 nm in der Breite (Abb. 1b). Gesunde, gefesselte Zellen gesehen, um den Punkt der Leine Anlage im Hellfeld Bilder zu drehen. Unter Fluoreszenzanregung einige molekulare Komplexe in unserem Fall könnte auch an der Stelle der Befestigung zu sehen, was auf eine Lokalisierung des markierten Proteins mit der Flagellen-Motor. Diese Spots werden einzelne molekulare Komplexe und die Anzahl von ihnen gesehen wird auf die Beleuchtung Modus verwendet werden und wie viele der Komplexe sind tatsächlich in der Zelle anwesend zu einem beliebigen Zeitpunkt ab. Die Mobilität der Spots ist abhängig von der spezifischen biologischen untersuchte System. Wenn die Dichte der Flecken ist anfänglich sehr hoch, wie es der Fall mit den markierten Cytochrome hier verwendeten dann eine anfängliche FRAP Bleichmittel kann der Bildkontrast zu verbessern. <img src="/files/ftp_upload/1508/1508Figure1tmb.jpg" border="0" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. (A) Hellfeld-und (B) TIRF Bild (Fehlfarben) für eine immobilisierte Escherichia coli Zelle, die ein Protein fusioniert, um grün fluoreszierende Protein (GFP), die bekanntlich in der Flagellen-Motoren von Bakterien beteiligt ist. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1508/1508Figure1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.

<ol>
	<li>Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+turnover+in+single,+functioning+membrane+protein+complexes.">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li><li>Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+stoichiometry+of+the+TatA+component+of+the+twin-arginine+protein+transport+system+observed+by+in+vivo+single-molecule+imaging.">Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).</li><li>Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+single+titin+molecules+using+a+two-bead+optical+tweezers+assay.">The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay.</a> Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).</li><li>Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+single+kettin+molecules+using+a+two-bead+laser-tweezers+assay.">The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay.</a> FEBS Lett. , 535-555 (2003).</li><li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+clustering+and+dynamics+of+cytochrome+bd+complexes+in+the+Escherichia+coli+plasma+membrane.">In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane.</a> Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).</li><li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Escherichia+coli+OXPHOS+complexes+concentrated+in+specialised+zones+within+the+plasma+membrane.">Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).</li><li>Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+measurements+of+Membrane+Potential,+Sodium-Motive+Force+and+Flagellar+Motor+Speed+in+Escherichia+coli.">Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli.</a> Biophys. 93, 294-302 (2007).</li><li>Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+measurement+of+intracellular+sodium+concentration+in+single+Escherichia+coli+cells.">Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells.</a> Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Es muss darauf geachtet nicht &quot;über shear&quot; Zelle für das Betrachten angebunden Bakterien, da dies die Funktionalität des Flagellen-Motoren beeinträchtigt werden. Es ist wichtig, um Zellen viel länger als eine Stunde einmal den Einsatz auf dem Objektträger, da sie sich möglicherweise Sauerstoff verbraucht. Erhebliche Optimierung erforderlich, um den besten Mikroskop Imaging Bedingungen gesorgt, spezifische biologische System untersucht werden. Es kann klug sein, um die Imaging unter Verwendung von gerein...

visualizing single molecular complexes in vivo using advanced fluorescence microscopy

Vollen Einblick in die Mechanismen der lebenden Zellen kann nur durch die Untersuchung der wichtigsten Prozesse, und entlocken direkte Ereignisse auf zellulärer Ebene erreicht werden. Bis heute ist die Scher-Komplexität biologischer Systeme ist präzise Einzel-Molekül-Experimente verursacht weit zu anspruchsvoll sein, anstatt sich auf Studien einzelner Systeme mit relativ groben Schüttgut Ensemble-gemittelten Messungen. Allerdings treten viele wichtige Prozesse in der lebenden Zelle auf der Ebene von nur einem oder einigen wenigen Molekülen, Ensemble-Messungen in der Regel Maske der stochastischen und heterogene Natur dieser Ereignisse. Hier, mit Hilfe modernster optischer Mikroskopie und analytische Bild-Analyse-Tools zeigen wir, wie Proteine ​​innerhalb einer einzelnen lebenden Bakterienzelle mit einer Genauigkeit von einzelnen Molekülen und wie können wir die Dynamik innerhalb molekulare Komplexe in funktionierenden biologischen Maschinen beobachten zu überwachen. Die Techniken sind direkt relevant physiologisch. Sie sind minimal-perturbative und nicht-invasive, um die biologische untersuchten Probe an und sind für Untersuchungen in lebenden Material abgestimmt, verfügt nicht ohne weiteres verfügbar zu anderen Einzel-Molekül-Ansätze der Biophysik. Darüber hinaus untersuchten die biologischen Proben alle produzieren Fluoreszenz-markierten Protein in Konzentrationen, die fast identisch mit den unveränderten Zellen Stämme (&quot;genomische encoding&quot;), im Gegensatz zu den häufigeren, aber weniger idealen Ansatz für die Erzeugung deutlich mehr Protein als würde natürlich vorkommen entgegengesetzt sind (&quot;Plasmid Ausdruck&quot;). So sind die tatsächlichen biologischen Proben, die untersucht werden soll deutlich näher an den natürlichen Organismen und damit die Beobachtungen mehr relevant echten physiologischen Prozessen.

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Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Hier zeigen wir die Protokolle für die Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie an lebenden Bakterienzellen, damit funktionale molekulare Komplexe detektiert werden, verfolgt und quantifiziert.

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

9.2K Aufrufe.  University of Oxford. Hier zeigen wir die Protokolle für die Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie an lebenden Bakterienzellen, damit funktionale molekulare Komplexe detektiert werden, verfolgt und quantifiziert.

Serie: Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Forschung

Biologie

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualisierung Bakterien in Nematoden durch Fluoreszenzmikroskopie

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Schnelle Analyse und Exploration von Fluoreszenzmikroskopie Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

Funktionelle Bildgebung der virale Transkription Fabriken mit 3D Fluoreszenz-Mikroskopie

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

Visualisierung der Lymphknotenstruktur und Zelllokalisierung mittels Ex-Vivo Konfokalmikroskopie

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...