Die NSF-MRT-Programm (CHE: 1229103) ist für die Finanzierung des Kaufs von neuen Steuerelektronik, Software, Flüssigkeitszellen und andere Geräte benötigt, um eine Dual-AFM / STM zusammen anerkannt. Wir erkennen die gemeinsamen Einrichtungen an der Universität von Chicago NSF-MRSEC Programm (DMR-0820054) für die Unterstützung bei AFM Instrumentierung, Ausbildung und Bildgebung, und für Systemzeit von der Materialforschung Einrichtungen Network (DMR-0820054) zur Verfügung gestellt. Wir danken besonders Dr. Qiti Guo, Dr. Justin Jureller, und Prof. Ka Yee Lee für vor die Finanzierung des NSF-MRT Vorschlag, dass die notwendige Messtechnik, um unsere Campus gebracht begrüßen unsere Studenten. Wir erkennen die Finanzierung aus einem Titel III STEM Grant (ID: P031C110157) Northeastern Illinois University verliehen, die Forschungsstipendien Sommer für Studierende und Lehr sowie Unterstützung für Verbrauchsmaterialien zur Verfügung gestellt. Schließlich erkennen wir Bruker-Nano, Inc. für die weitere instrumentale Unterstützung und für die Erlaubnis, reproduce ein Diagramm, das den Mechanismus der Peakforce QNM und das Wort ScanAsyst verwenden, um die automatische Software zu beschreiben.

1. Computer und Mikroskop Set Up <ol><li> Öffnen Sie das Ventil der N 2-Zylinder, und stellen Sie die Regler, um sicherzustellen, dass die Lufttisch schwimmt und Niveau. </li><li> Schalten Sie den Computer, Controller und Faseroptik-Licht in dieser Reihenfolge. </li><li> Stellen Sie den Scanner an AFM / LFM-Modus und in der Mitte der Kamera über der AFM Kopf. </li><li> Offene Software. Wählen Experiment Kategorie &quot;Nanomechanische Eigenschaften&quot;, &quot;Quantitative Nano Mapping&quot; unter Experiment-Gruppe und &quot;Peakforce QNM in Fluid&quot; unter Experiment. Klicken Sie auf Laden Experiment und dann einrichten. </li><li> Fokussieren Sie die Kamera mit dem Ziel, den Z Oberfläche der Bühne zu sehen. Verwendung des groben oben / unten bewegen Piezos die Bühne etwa 1 mm unter der Oberfläche des AFM Kopföffnung. </li></ol> 2. Herstellung von Glimmer-Oberfläche <ol><li> Drücken eines Aufklebers auf das Gesicht eines sauberen Probenträgerplatte (15 mm Durchmesser, 0,8 mm dick). Schieben Sie einen Glimmer V-4Grade Platte (25 x 25 x 26 mm) auf die Klebe bis fest angeschlossen ist. </li><li> Reiben ein Stück Tesafilm auf das Glimmer gewährleisten sie vollständig ohne Luftblasen eingehalten werden. Ziehen Sie das Band vor der Glimmer von einer Seite zur gleichmäßig spalten. Bei Bedarf wiederholen, um sicherzustellen, der Glimmer ist flach. </li><li> Fassen Sie die Stützscheibe, sauber Glimmer Seite nach oben, mit einem Paar von Kreis Pinzette (Plattengreifer) und legen Sie den Scanner ein. Der Glimmer sollte unter dem Niveau des AFM Kopföffnung sein. </li></ol> 3. Flüssigkeitszelle Versammlung und Imaging von Glimmeroberfläche <ol><li> Spülen der Fluidzelle, O-Ring, Spritzenadapter, Schlauch-Adapter, und die Ausstoßschlauch in 100% Ethanol. Spülen Sie die Flüssigkeitszelle in DI-Wasser. Lassen Sie alle Teile Luft vollständig trocknen. </li><li> Schieben Sie den Schlauchadapter in den Anschluss auf der sauberen Flüssigkeitszelle. O-Ring drücken Sie vorsichtig in die Mitte der Vertiefung Fluidzelle mit Flachkopf Pinzette. </li><li> Drücken Sie die Feder leicht auf die Sonde Halteclip und drehen Sie es weg von der Groove für den Tipp. </li><li> Fassen Sie die Sonde am langen Ende von der Spitze mit Flachkopf Pinzette. Die Sonde in die Nut mit der Spitze zur Mitte der Zelle. Schieben Sie den Frühling in und stellen Sie die Halteklammer über die Sonde, um sie (Abbildung 1B) zu sichern. </li><li> Überprüfen Sie die Klemme an der AFM, um sicherzustellen, es ist vollständig eingefahren (Abbildung 1c). </li><li> Legen Sie die Flüssigkeitszelle, O-Ring und die Sonde nach unten, oben auf dem Glimmer Probe. Lassen Sie die Flüssigkeit Zelle, um auf die Bolzen des AFM Ruhe. Senken Sie die Klammer zur Stabilisierung der Zellflüssigkeit auf der Bühne. Drücken Sie die Down-Schalter auf dem Mikroskop, bis eine visuelle Inspektion zeigt die O-Ring fest zwischen der Trägerscheibe und der Fluidzelle zusammengedrückt. </li><li> Während Sie den Monitor, konzentrieren sich die Grobtrieb, um die Spitze der Fluidzelle auf dem Bildschirm sichtbar zu machen. </li><li> Bewegen Sie den Mikroskop, bis es ein klares Bild von der Spitze über die X / Y-Stellknöpfe und die Z-Ziel. Die Spitze wird AppOhr wie eine metallische, goldene Dreieck. Bewegen der Spitze näher an die Probenoberfläche unter Verwendung der unten piezoHebel am Mikroskop. Konzentrieren Sie sich auf die Reflexion der Spitze. Verfolgen Sie die aktuellen Freischwinger in Beziehung zu seinen Überlegungen. In diesem Stadium sollten sie aneinander ausgerichtet werden, jedoch nicht vollständig überlappen. </li><li> Befestigen Sie den Spritzenadapter in eine sterile 1 ml Spritze. Ein Ende des Ausstoßschlauch mit dem Spritzenadapter und das andere Ende des Schlauchs in den Behälter der Pufferlösung. Ziehen Sie die Kolben der Spritze. </li><li> Befestigen Sie den Schlauch an den Schlauchadapter an der Fluidzelle. Drücken Sie den Kolben, bis die Flüssigkeit die mittlere Kammer vollständig ausfüllt. Prüfen Sie die Zelle, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen. Überprüfen, um zu sehen, gibt es keine Flüssigkeit auslaufen aus der Fluidzelle auf das Mikroskop. Legen Sie die Spritze auf einem festen Träger angehoben. </li><li> Verwenden Sie die Kamera-Feed und die X / Y-Knöpfe Übersetzung, um den Laser auf dem Bildschirm (ein diffuser roter Punkt) zu lokalisieren. Mit dem Laser movement Bedienknöpfe, bewegen Sie den Laser auf die Spitze. </li><li> Feineinstellung der Laser und Spiegel kontrolliert, bis das Summensignal auf dem Mikroskop angezeigt wird maximiert (Wert = 4 - 6). </li><li> Stellen Sie den Winkel des Quadranten-Diode mit den Knöpfen an der linken hinteren Seite und der linken oberen Seite der Scankopf an die vertikalen und horizontalen Auslenkungen am Mikroskop so nahe wie möglich bei Null (± 0,1) angezeigt senken. </li><li> In der Software, wählen Akquisitionsmöglichkeiten. Auf ein Minimum, wählen Höhe (Spur und Rück), Spitzenkraft Fehler und Deformation. Die anderen Optionen sind benutzerabhängig und kann auf der Grundlage der von der Experimentator gewünschten spezifischen Informationen angepasst werden. </li><li> Wählen Sie &quot;Linie&quot; für RT Flugzeug Fit in jedem Aufnahmefenster. Wählen Sie &quot;None&quot; für die OT Flugzeug Fit in den hohen Fenstern. Stellen Sie die X und Y-Offset und Scanwinkel auf Null, wenn nicht bereits geschehen. </li><li> Stellen Sie die Abtastrate auf 1 Hz, der Probe pro Zeile bis 256, die ScanAsyst Selbststeuerungeinzelne, und ScanAsyst Auto Z Grenze ab. Ändere die Z Grenze bis 500 nm aufweist. Stellen Sie Scangröße bis 1 um. </li><li> Klicken einrasten. An diesem Punkt ist die Spitze der Oberfläche nähert. Während die Spitze nähern, beobachten Z Piezo Spannungsänderung in der unteren linken Ecke des Bildschirms. Wenn die Spitze außerhalb des Bereichs liegt, ziehen Sie die Spitze und Re-Ansatz. Wenn dies nicht erfolgreich ist, muss die Spitze, um einen erfolgreichen Ansatz umgestellt werden. Sobald die Spitze eingeschaltet ist, werden die Linien beginnen, sich auf jede der Erwerb Fenster, die ein Bild zu komponieren erscheint. </li><li> Nehmen Sie Bilder von Glimmer mit 1 x 1 um und vergrößern sich langsam, um zu gewährleisten, dass die Glimmeroberfläche eben und sauber ist. Klicken Sie auf die kontinuierliche Aufnahme das Speichern von Bildern, wie sie erscheinen. Vergrößern und bewegen sich um die Oberfläche nach Wunsch. </li></ol> 4. Proteinablagerung und Herstellung der Probe für Imaging <ol><li> Erhalten gereinigtes Protein Probe 38 und auf Eis zu halten. Wenn in einem Gefrierschrank gelagert, aufgetaut Probe aufEis für 5 min. </li><li> Verdünnen das Protein zu 0,0010 mg / ml unter Verwendung von Kühl Bildgebung Pufferlösung. Die Abbildungspuffer verwendet hier 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), 150 mM NaCl und 15 mM MgCl 2. </li><li> Füllen Sie ein 4-Kammer (100 x 15 mm) Petrischale mit Kühl Bildgebung Pufferlösung. Füllen Sie jede Kammer mit mindestens 5 ml Lösung. Vorsichtig mischen die verdünnte Proteinlösung mit der Spitze auf Mikropipette befestigt. </li><li> Anwenden 200 ul der verdünnten Proteinlösung auf der Oberfläche von Glimmer bereits vorbereitet. Nach 30 sec, holen die Protein / Glimmer-Oberfläche mit den kreisförmigen Pinzette (Plattengreifer). Halten Sie die Probe parallel zu dem Labortisch. </li><li> Während die Probe hält, tauchen sofort die Probe in der im ersten Quadranten der Petrischale (Schritt 4.2) enthaltenen Pufferlösung, während sichergestellt wird, dass die Probe parallel zum Becken der Petrischale ist. Nach 1 sec, entfernen Sie die Probe. </li><li> Weiter, um die Probe parallel zum Becken haltender Petrischale, wiederholen Sie Schritt 4.5 für die restlichen drei Quadranten. </li><li> Legen Sie die Festplatte auf einem trockenen staubfreien Tuch zu tanken überschüssige Feuchtigkeit und übertragen Sie die Festplatte auf die Bühne des Mikroskops. Die eigentliche Oberfläche nicht berühren mit dem Tuch. Erlauben nicht die Probe zu trocknen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,6 bis 3,16. </li></ol> 5. Imaging Proteine ​​auf Glimmer- <ol><li> Klicken Sie auf Prüfparameter-Box auf der linken Seite des Bildschirms. Frühling Größe und Spitzenradius sollte basierend auf der Spitze eingesetzt eingestellt werden. </li><li> Klicken einrasten. Ähnlich wie bei der bildgebenden Verfahren Glimmer (Schritt 3.17), beobachten die z-Piezo-Fenster, wie die Spitze Ansätze. </li><li> Lassen Sie den Scanner, um Bild die gleiche Fläche für mindestens zwei aufeinander folgenden Durchgängen. Klicken Sie auf die kontinuierliche Aufnahme, jede gesammelt Bild zu speichern. </li><li> Bewegen Sie den Scanner an einen neuen Region und / oder ändern Sie die Bildgröße nach Wunsch. </li><li> Nach der automatisierten Software Einstellen des fertig istScan-Parameter für eine bestimmte Bildgröße, drehen Sie die Software aus. </li><li> Manuell einstellen Scanrate, Z-Limit, die Anzahl der Zeilen und die Spannung, um die Feineinstellung des Fokus des Bildes. Wenn das Bild wird zu weit aus dem Fokus, drehen Software zurück auf die ursprüngliche Ausgangsposition zurück. Um die Auflösung eines Bildes beim Zoomen auf einem Protein zu erhöhen, verringern Sie die Scan-Rate und erhöhen die Anzahl der Linien proportional. </li><li> Nach dem Versuch, reinigen Sie die Flüssigkeit-Zelle mit 100% Ethanol und spülen Sie mit DI H 2 O. Lassen Sie die Flüssigkeit Zelle vollständig trocken. </li><li> Öffnen Sie die Daten Software, um Rohdaten-Bilder verarbeiten. Erste, glätten Sie das Bild durch Klicken auf die Flatten-Symbol. Wählen Sie Null-ter Ordnung und klicken Sie auf Ausführen. Je nach Bild kann eine Ebene passen notwendig sein, eine entsprechend flache Bild zu erhalten. In diesem Fall wählen Sie die Ebene fit Symbol und ziehen Sie eine Ebene einer flachen Bereich des Bildes mit dem Cursor. Klicken Sie auf Ausführen. Bei Bedarf wiederholen </li><li> Select die Registerkarte Querschnitt, um die Dimensionen des Proteins messen. Ziehen Sie eine Linie mit dem Cursor bewegen Sie ihn über das Molekül oder Bereich analysiert werden. Wiederholen für mehrere Bereiche und die Software wird eine Überlagerung zu erzeugen. Exportieren Sie das Bild oder die verwendet werden, um Bild in einem Format kompatibel zu anderen Software-und Zeichenprogrammen erzeugen Daten. </li></ol>

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+engineering+enhances+a+phytochrome-based+infrared+fluorescent+protein.">Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein.</a> J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).</li><li>Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-transfer+and+hydrogen-bond+interactions+determine+fluorescence+quantum+yield+and+photochemical+efficiency+of+bacteriophytochrome.">Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pymol+Molecular+Graphic+System+v.1.5.0.1.">The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1.</a> , .</li><li>Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=structure+of+the+chromophore+binding+domain+of+an+unusual+bacteriophytochrome,+RpBphP3,+reveals+residues+that+modulate+photoconversion.">structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).</li><li>Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+Pseudomonas+aeruginosa+bacteriophytochrome:+photoconversion+and+signal+transduction.">Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).</li><li>Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+X-ray+Crystallographic+and+Structural+Analyses+of+a+Bacteriophytochrome+from+Stigmatella+aurantiaca.">Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca.</a> The FASEB Journal. 25, 928 (2011).</li><li>Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+structure+of+Deinococcus+bacteriophytochrome+yields+new+insights+into+phytochrome+architecture+and+evolution.">High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution.</a> J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).</li><li>Wagner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+Deinococcus+radiodurans+bacteriophytochrome+reveals+key+amino+acids+necessary+for+the+photochromicity+and+proton+exchange+cycle+of+phytochromes.">Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes.</a> J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).</li></ol>

There are no competing financial interests or conflicts of interest.

AFM ist ein Rastersondenmikroskopie Verfahren vollständig in der Lage Abbildung von Proteinen und anderen biologischen Makromolekülen in physiologisch relevanten Bedingungen. Im Vergleich zu Röntgenkristallographie und NMR, eine Begrenzung der AFM ist ihre Unfähigkeit, die gleiche Auflösung, insbesondere die laterale Auflösung zu erzielen. Bei der Verwendung von AFM, ein Molekül auf einer Oberfläche zu analysieren, müssen die Auswirkungen der Oberfläche und der Sonde auf dem Bild des Moleküls auch bei der Dat...

Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist ein sehr wichtiges Werkzeug für die Untersuchung der strukturellen und mechanischen Eigenschaften von Oberflächen, dünne Filme und Einzelmoleküle seit seiner Erfindung im Jahr 1986 (Abbildung 1). 1-3 Verwendung einer flüssigkeits Zelle hat das Verfahren werden in einem physiologisch relevanten Umwelt besonders nützlich in Studien von biologischen Makromolekülen und sogar lebende Zellen. 4-10 Tapping-Mode-AFM ist traditionell für die Abbildung von weichen Materialien oder locker gebundenen Moleküle an die Oberfläche, da der Kontakt-Modus AFM verwendet worden ist in der Regel nicht geeignet aufgrund auf die Schäden, die durch die seitlichen Kräfte verursacht auf die Probe ausgeübt durch den Freischwinger. Tapping-Modus 11 AFM wesentlich reduziert diese Kräfte, indem er die Spitze weise die Oberfläche berühren und nicht in ständigem Kontakt. In diesem Modus wird der Ausleger an oder nahe seiner Resonanzfrequenz normal zu der Oberfläche in Schwingungen versetzt. Ähnlich wie bei Kontaktmodus AFM ist Topographie analdurch Auftragen der Bewegung der Z-Piezo als eine Funktion der xy-(Abstand) yzed. Die Ausleger Dynamik bei oder nahe der Resonanz sehr instabil; daher sind sie sehr schwierig, außerhalb eines &quot;steady-state&quot; Situation zu automatisieren. Genauer gesagt, diese Dynamik hängen sowohl von der Probeneigenschaften und Scan-Umgebung. Für eine weiche Molekül auf eine Fest (er) Oberfläche adsorbiert, kann eine gut abgestimmte Rückkopplungsschleife für das Molekül zu Rückkopplungsschwingung für die Oberfläche führen. Betrieb in Fluid erschwert die Abstimmung des Auslegers. Änderungen der Temperatur oder Flüssigkeitsstände erfordern ständige Nachjustierung der Sollwert, Gewinne und andere Bildparameter. Diese Anpassungen sind in der Regel sehr zeitaufwendig und anspruchsvoll für die Nutzer. Spitzenkraft Quantitative Nano Property Mapping (PF-QNM), wie Tapping Mode AFM, vermeidet lateralen Wechselwirkungen von intermittierend Kontaktieren der Probe (Abbildung 2). 12-15 &lt;/ Sup&gt;, arbeitet jedoch PF-QNM in nicht-resonanten Modus und Frequenzen viel niedriger als Tapping-Mode-AFM. Dadurch entfällt die Abstimmung Herausforderungen Tapping-Mode-AFM, insbesondere durch das Vorhandensein der Flüssigkeit verstärkt. Mit PF-QNM werden Bilder, indem sie eine Kraft-Antwort-Kurve an jedem Kontaktpunkt gesammelt. Mit dem Zusatz von ScanAsyst Software können 15 Einstellung der Scan-Parameter automatisiert werden und ein hochauflösendes Bild in einer Angelegenheit von Minuten mit dem auch unerfahrene Benutzer erhalten. Sobald der Benutzer mehr mit dem AFM wird, können einige oder alle der automatisierten Parameter zu jeder Zeit, die die Bildqualität der Experimentator manuell ermöglicht die Feineinstellung deaktiviert. Seit seiner Gründung PF-QNM wurde angewandt, um Bakteriorhodopsin, ein Membranprotein und andere native Proteine ​​auf der submolekularen Ebene abzubilden. 16-18 Für Bakteriorhodopsin, gibt es eine direkte Korrelation zwischen Proteinflexibilität und Röntgenkristallstrukturen. PF 12 -QNM ist verwendet worden, lebende Zellen mit einer hohen Auflösung zu untersuchen. 19,20 Darüber hinaus hat PF-QNM Daten aufgeklärt wichtige Verbindungen zwischen Struktur und Mechanik in der Erythrozytenmembran, die für die Zellintegrität und Funktion sind. 21. Wir haben Rastersondenmikroskopie (SPM) Verfahren eingesetzt, darunter 22 AFM, 23, um die Struktur der Rotlicht-Photorezeptoren genannt Bakteriophytochrome (BphPs) zu studieren. 24,25 Sie bestehen aus einer Lichtsensormodul kovalent an eine Signal-Effektor-Modul verlinkten Histidin-Kinase (HK). 26 Die Lichterfassungsmodul enthält typischerweise einen Bilin-Chromophor, der bei der Absorption eines Photons strukturelle Umwandlung erfährt, mit einer Reihe von strukturellen Veränderungen Erreichen der Signal-Effektor-Modul und die zu einer globalen Transformation des gesamten Proteins . 24,27-29 Basierend auf dieser Transformation gibt es zwei unterschiedliche Lichtabsorptions sTates von BphPs, einem roten und dunkelrotem Licht absorbierenden Zustand, als Pr und Pfr bezeichnet. Pr ist thermisch stabil, dunkeladaptierten Zustand für die meisten BphPs. 28. Die molekularen Grundlagen der Pr / Pfr-Photo nicht vollständig aufgrund der begrenzten Strukturwissen dieser Proteine ​​zu verstehen. Mit Ausnahme einer Struktur von D. durans, sind 30 alle veröffentlichten Röntgenkristallstrukturen dieser Proteine ​​in der dunkeladaptierten Zustand und Effektor-Domäne fehlt. Die intakten BphPs sind zu groß, um wirksam durch Kernspinresonanz (NMR) untersucht werden und sind notorisch schwierig in ihrer intakten Form kristallisieren (insbesondere in der Licht adaptierten Zustand) für Röntgen-Kristallographie. BphPs wurden vor kurzem als Infrarot-Fluoreszenzproteinmarker entwickelt worden (IFP). 31. Strukturelle Charakterisierung dieser Proteine ​​kann Hilfe in effektive IFP Design zu fördern. 32-36 Der Schwerpunkt dieses Artikels ist es, ein Verfahren für präsentierenAbbildung BphPs mit Flüssig-Zelle über AFM PF-QNM. Das Verfahren wird durch Untersuchungen der licht adaptierten Zustand des Bakteriophytochrom RpBphP3 (P3) aus dem Photosynthesebakterium R. nachgewiesen palustris. Das hier vorgestellte Verfahren AFM ist bequem und einfacher Ansatz zur Darstellung von Proteinen und anderen biologischen Makromolekülen. Mit diesem Verfahren können strukturelle Einzelheiten der einzelnen Moleküle in einem kurzen Zeitraum, ähnlich einer oberen Ebene Wissenschaft natürlich Laborsitzung gesammelt werden. Über Messquerschnitte und Erfüllen weiteren eindimensionalen Analysen können experimentelle Daten, um nützliche Rechenmodelle verglichen werden. 37-42

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog #</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O4997-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode 8 AFM</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>492-008-011</td>
			<td>equipped with Nanoscope V controller and J scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>SNL-10, ScanAsyst-Fluid+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapping Mode Fluid Cell</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>MTFML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica V-4 Grade</td>
			<td>SPI supplies</td>
			<td>1150503</td>
			<td>25 x 25 x .26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample support disk</td>
			<td>nanoSurf</td>
			<td>BT02236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Plasta-Medic, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>100 mm x 15 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipettors</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>XL 3000i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RpBphP3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared according to cited references</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoscope software</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light</td>
			<td>Digital Instruments Inc.</td>
			<td>F0-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco AFM Disc Gripper</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>1668</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>102-ST1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>C2171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1</td>
			<td>Schrodinger, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy of red-light photoreceptors using peakforce quantitative nanomechanical property mapping

Rasterkraftmikroskopie (AFM) verwendet eine Pyramidenspitze auf einem Ausleger angebracht ist, um die Kraftantwort der Oberfläche zu untersuchen. Die Auslenkungen der Spitze kann durch einen Laser und Detektor in Sektoren, die Topographiebild umgerechnet werden können gemessen werden, um ~ 10 pN. Amplitudenmodulation oder &quot;Tapping Mode&quot; AFM umfasst die Sonde so intermittierenden Kontakt mit der Oberfläche beim Oszillieren bei seiner Resonanzfrequenz, um ein Bild zu erzeugen. In Verbindung mit einer Fluidzelle verwendet, Tapping-Mode-AFM ermöglicht die Abbildung von biologischen Makromolekülen, wie Proteinen in physiologisch relevanten Bedingungen. Tapping-Mode AFM erfordert manuelle Abstimmung der Sonde und häufige Anpassungen aus einer Vielzahl von Scan-Parameter, die schwierig sein kann für unerfahrene Anwender. Um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten, sind diese Anpassungen die meiste Zeit. Peakforce Quantitative Nano Property Mapping (PF-QNM) erzeugt ein Bild durch die Messung einer Kraft Verantse Kurve für jeden Berührungspunkt mit der Probe. Mit ScanAsyst Software können PF-QNM automatisiert werden. Diese Software passt den Sollwert, Antriebsfrequenz, Abtastrate, Gewinne und andere wichtige Scan-Parameter automatisch für eine bestimmte Probe. Nicht nur, dass dieses Verfahren zum Schutz sowohl zerbrechlich Sonden und Proben, es reduziert die erforderliche Zeit, um Bilder mit hoher Auflösung zu erhalten. PF-QNM ist für AFM in Flüssigkeit kompatibel; Daher war es umfangreiche Anwendung zur Abbildung biologisch relevanten Materialien. Die in diesem Papier vorgestellte Methode beschreibt die Anwendung von PF-QNM, um Bilder von einer bakteriellen Rotlicht-Photorezeptor, RpBphP3 (P3) zu erhalten, aus photo R. palustris in seinem Licht-adaptierten Zustand. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden einzelne Protein Dimere von P3 und Aggregate von Dimeren auf einer Glimmer-Oberfläche in Gegenwart eines bildgebenden Puffer beobachtet. Mit entsprechenden Anpassungen an die Oberfläche und / oder der Konzentration der Lösung, wobei dieses Verfahrenkann allgemein auch für andere biologisch relevante Makromoleküle und weichen Materialien angewendet werden.

Vertreter AFM-Bilder von einem Photorezeptor-Protein, P3, in seinem Licht-adaptierten Zustand sind in den 3 und 4 dargestellt. Ein frisch geschnittenen Glimmer-Substrat (3A) ist eine geeignete, ebene Fläche für Protein-Adsorption. Sammeln eines Bildes saubere Glimmer als Negativkontrolle ist aus mehreren Gründen wichtig. Zunächst versichert es der Flüssigkeitszelle ist sauber und keine Reststoffe aus früheren Experimenten wird die Oberfläche verunreinigen. Zweite...

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Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

Atomic Force Microscopy von Red-Light Photorezeptoren Mit Peakforce Quantitative Nanomechanische Eigenschaftenzuordnung

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

atomic-force-microscopy-red-light-photoreceptors-using-peakforce

Research

JoVE Journal

Engineering

11.6K Aufrufe.  Northeastern Illinois University. A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface. 

Serie: Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Preparation and Friction Force Microscopy Measurements of Immiscible, Opposing Polymer Brushes

Solvated polymer brushes are well known to lubricate high-pressure contacts, because they can sustain a positive normal load while maintaining low friction at the interface. Nevertheless, these systems can be sensitive to wear due to interdigitation of the opposing brushes. In a recent publication, we have shown via molecular dynamics simulations and atomic force microscopy experiments, that using an immiscible polymer brush system terminating the substrate and the slider surfaces, respectively, can eliminate such interdigitation. As a consequence, wear in the contacts is reduced. Moreover, the friction force is two orders of magnitude lower compared to traditional miscible polymer brush systems. This newly proposed system therefore holds great potential for application in industry. Here, the methodology to construct an immiscible polymer brush system of two different brushes each solvated by their own preferred solvent is presented. The procedure how to graft poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) from a flat surface and poly(methyl methacrylate) (PMMA) from an atomic force microscopy (AFM) colloidal probe is described. PNIPAM is solvated in water and PMMA in acetophenone. Via friction force AFM measurements, it is shown that the friction for this system is indeed reduced by two orders of magnitude compared to the miscible system of PMMA on PMMA solvated in acetophenone.

The methodology to perform friction force microscopy experiments for contacting brushes is presented: Two polymer brushes that are grafted from (a) substrates and (b) colloidal probes are slid to show that, by using two contacting immiscible brush systems, friction in sliding contacts is reduced compared to miscible brush systems.

Vorbereitung und Reibungskraftmikroskopie Messungen mischbar, Entgegenpolymerbürsten

Solvated polymer brushes are well known to lubricate high-pressure contacts, because they can sustain a positive normal load while maintaining low ...

Forschung

Ingenieurwesen

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Untersuchung von Einzelmolekül Haftung durch Rasterkraftspektroskopie

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Dynamic Pore-scale Reservoir-condition Imaging of Reaction in Carbonates Using Synchrotron Fast Tomography

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve geologic seals and allow CO2 to escape. However, the dissolution processes at reservoir conditions are poorly understood. Thus, time-resolved experiments are needed to observe and predict the nature and rate of dissolution at the pore scale. Synchrotron fast tomography is a method of taking high-resolution time-resolved images of complex pore structures much more quickly than traditional &#181;-CT. The Diamond Lightsource Pink Beam was used to dynamically image dissolution of limestone in the presence of CO2-saturated brine at reservoir conditions. 100 scans were taken at a 6.1 &#181;m resolution over a period of 2 hours. The images were segmented and the porosity and permeability were measured using image analysis and network extraction. Porosity increased uniformly along the length of the sample; however, the rate of increase of both porosity and permeability slowed at later times.

Synchrotron fast tomography was used to dynamically image dissolution of limestone in the presence of CO2-saturated brine at reservoir conditions. 100 scans were taken at a 6.1 &#181;m resolution over a period of 2 h.

Dynamische Pore-Skala Reservoir-Zustand Abbildung von Reaktions in Karbonate mit Synchrotronstrahlung Schnelle Tomography

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

Sub-Nanometer Auflösung Belichtung mit Amplituden-Modulation der Rasterkraftmikroskopie in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

An Efficient Method for Selective Desalination of Radioactive Iodine Anions by Using Gold Nanoparticles-Embedded Membrane Filter

Here, we demonstrate a detail protocol for the preparation of nanomaterials-embedded composite membranes and its application to the efficient and ion-selective removal of radioactive iodines. By using citrate-stabilized gold nanoparticles (mean diameter: 13 nm) and cellulose acetate membranes, gold nanoparticle-embedded cellulose acetate membranes (Au-CAM) have easily been fabricated. The nano-adsorbents on Au-CAM were highly stable in the presence of high concentration of inorganic salts and organic molecules. The iodide ions in aqueous solutions could rapidly be captured by this engineered membrane. Through a filtration process using an Au-CAM containing filter unit, excellent removal efficiency (&gt;99%) as well as ion-selective desalination result was achieved in a short time. Moreover, Au-CAM provided good reusability without significant decrease of its performances. These results suggested that the present technology using the engineered hybrid membrane will be a promising process for the large-scale decontamination of radioactive iodine from liquid wastes.

An efficient method for the rapid and ion-selective desalination of radioactive iodine in several aqueous solutions is described by using gold nanoparticles-immobilized cellulose acetate membrane filters.

Eine effiziente Methode zur selektiven Entsalzung von radioaktivem Jod Anionen mit Gold-Nanopartikel eingebettet Membranfilter

Here, we demonstrate a detail protocol for the preparation of nanomaterials-embedded composite membranes and its application to the efficient and ...

Surface Mapping of Earth-like Exoplanets using Single Point Light Curves

Spatially resolving exoplanet features from single-point observations is essential for evaluating the potential habitability of exoplanets. The ultimate goal of this protocol is to determine whether these planetary worlds harbor geological features and/or climate systems. We present a method of extracting information from multi-wavelength single-point light curves and retrieving surface maps. It uses singular value decomposition (SVD) to separate sources that contribute to light curve variations and infer the existence of partially cloudy climate systems. Through analysis of the time series obtained from SVD, physical attributions of principal components (PCs) could be inferred without assumptions of any spectral properties. Combining with viewing geometry, it is feasible to reconstruct surface maps if one of the PCs are found to contain surface information. Degeneracy originated from convolution of the pixel geometry and spectrum information determines the quality of reconstructed surface maps, which requires the introduction of regularization. For the purpose of demonstrating the protocol, multi-wavelength light curves of Earth, which serves as a proxy exoplanet, are analyzed. Comparison between the results and the ground truth is presented to show the performance and limitation of the protocol. This work provides a benchmark for future generalization of exoplanet applications.

The protocol extracts information from light curves of exoplanets and constructs their surface maps. It uses light curves of Earth, which serves as a proxy exoplanet, to demonstrate the approach.

Oberflächenkartierung erdähnlicher Exoplaneten mit Single-Point-Lichtkurven

Spatially resolving exoplanet features from single-point observations is essential for evaluating the potential habitability of exoplanets. The ultimate ...

Optimizing Magnetic Force Microscopy Resolution and Sensitivity to Visualize Nanoscale Magnetic Domains

Magnetic force microscopy (MFM) enables mapping local magnetic fields across a sample surface with nanoscale resolution. To perform MFM, an atomic force microscopy (AFM) probe whose tip has been magnetized vertically (i.e., perpendicular to the probe cantilever) is oscillated at a fixed height above the sample surface. The resultant shifts in the oscillation phase or frequency, which are proportional to the magnitude and sign of the vertical magnetic force gradient at each pixel location, are then tracked and mapped. Although the spatial resolution and sensitivity of the technique increases with decreasing lift height above the surface, this seemingly straightforward path to improved MFM images is complicated by considerations such as minimizing topographical artifacts due to shorter range van der Waals forces, increasing the oscillation amplitude to further improve sensitivity, and the presence of surface contaminants (in particular water due to humidity under ambient conditions). In addition, due to the orientation of the probe's magnetic dipole moment, MFM is intrinsically more sensitive to samples with an out-of-plane magnetization vector. Here, high-resolution topographical and magnetic phase images of single and bicomponent nanomagnet artificial spin-ice (ASI) arrays obtained in an inert (argon) atmosphere glovebox with &lt;0.1 ppm O2 and H2O are reported. Optimization of lift height and drive amplitude for high resolution and sensitivity while simultaneously avoiding the introduction of topographical artifacts is discussed, and detection of the stray magnetic fields emanating from either end of the nanoscale bar magnets (~250 nm long and &lt;100 nm wide) aligned in the plane of the ASI sample surface is shown. Likewise, using the example of a Ni-Mn-Ga magnetic shape memory alloy (MSMA), MFM is demonstrated in an inert atmosphere with magnetic phase sensitivity capable of resolving a series of adjacent magnetic domains each ~200 nm wide.

Magnetic force microscopy (MFM) employs a vertically magnetized atomic force microscopy probe to measure sample topography and local magnetic field strength with nanoscale resolution. Optimizing MFM spatial resolution and sensitivity requires balancing decreasing lift height against increasing drive (oscillation) amplitude, and benefits from operating in an inert atmosphere glovebox.

Optimierung der Auflösung und Empfindlichkeit der Magnetkraftmikroskopie zur Visualisierung nanoskaliger magnetischer Domänen

Magnetic force microscopy (MFM) enables mapping local magnetic fields across a sample surface with nanoscale resolution. To perform MFM, an atomic force ...

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

Rasterkraftmikroskopie Cantilever-basierte Nanoindentation: Messungen mechanischer Eigenschaften auf der Nanoskala in Luft und Flüssigkeit

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Parallele aktive Cantilever-Arrays im AFMS für Inspektionen mit hohem Durchsatz

Active Probe Atomic Force Microscopy with Quattro-Parallel Cantilever Arrays for High-Throughput Large-Scale Sample Inspection

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. However, due to their limited imaging throughput, AFMs have not been widely adopted for large-scale inspection purposes. Researchers have developed high-speed AFM systems to record dynamic process videos in chemical and biological reactions at tens of frames per second, at the cost of a small imaging area of up to several square micrometers. In contrast, inspecting large-scale nanofabricated structures, such as semiconductor wafers, requires nanoscale spatial resolution imaging of a static sample over hundreds of square centimeters with high productivity. Conventional AFMs use a single passive cantilever probe with an optical beam deflection system, which can only collect one pixel at a time during AFM imaging, resulting in low imaging throughput. This work utilizes an array of active cantilevers with embedded piezoresistive sensors and thermomechanical actuators, which allows simultaneous multi-cantilever operation in parallel operation for increased imaging throughput. When combined with large-range nano-positioners and proper control algorithms, each cantilever can be individually controlled to capture multiple AFM images. With data-driven post-processing algorithms, the images can be stitched together, and defect detection can be performed by comparing them to the desired geometry. This paper introduces principles of the custom AFM using the active cantilever arrays, followed by a discussion on practical experiment considerations for inspection applications. Selected example images of silicon calibration grating, highly-oriented pyrolytic graphite, and extreme ultraviolet lithography masks are captured using an array of four active cantilevers (&#34;Quattro&#34;) with a 125 &#181;m tip separation distance. With more engineering integration, this high-throughput, large-scale imaging tool can provide 3D metrological data for extreme ultraviolet (EUV) masks, chemical mechanical planarization (CMP) inspection, failure analysis, displays, thin-film step measurements, roughness measurement dies, and laser-engraved dry gas seal grooves.

Autor im Rampenlicht: Einführung in die Rasterkraftmikroskopie mit aktiven Sonden mit quattro-parallelen Cantilever-Arrays

Large-scale sample inspection with nanoscale resolution has a wide range of applications, especially for nanofabricated semiconductor wafers. Atomic force microscopes can be a great tool for this purpose, but are limited by their imaging speed. This work utilizes parallel active cantilever arrays in AFMs to enable high-throughput and large-scale inspections.

Rasterkraftmikroskopie mit aktiven Sonden mit quattroparallelen Cantilever-Arrays für die Inspektion von Großproben mit hohem Durchsatz

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. ...