Silicon-Master Mold Fabrication Lithographie Materialien: <ul><li> 75 mm Silizium-Wafer </li><li> SU-8 2 Negative Photoresist (Microchem, Boston, MA) </li><li> N2 </li></ul> Methode: <ol><li> Entwässern Si-Wafer bei 120 ° C für 2 Stunden. </li><li> UV Ozon zu behandeln Oberfläche für 7 Minuten zu entfernen organische Stoffe. </li><li> N2 Schlag Oberfläche zu entfernen Partikel. </li><li> Bewerben SU-8 2 bis 70% der Fläche (~ 10 ml für 75 mm-Wafer) zu decken. </li><li> Spin bei 2000 rpm für 20 Sekunden mit 300 rpm / s Beschleunigung. </li><li> Legen Sie die Wafer auf einer Heizplatte und Rampe von Raumtemperatur bis 95 ° C. </li><li> Softbake der Fotolack für 15 Minuten bei 95 ° C. </li><li> Flood aussetzen Wafer für 20 bis 25 mJ/cm2 Dosis bei 365 nm (I-Linie), um die untere Schicht bilden. </li><li> Bewerben SU-8 2 für die zweite Photoresistschicht. </li><li> Spin bei 550 rpm für 20 Sekunden mit 300 rpm / s Beschleunigung für eine ca. 11 mu m Dicke Film. </li><li> Legen Sie die Wafer auf einer Heizplatte und Rampe von Raumtemperatur bis 65 ° C. </li><li> Softbake der Wafer bei 65 ° C für 5 Minuten. </li><li> Ramp der Heizplatte von 65 ° C bis 95 ° C. </li><li> Softbake der Wafer für 55 Minuten bei 95 ° C. </li><li> Coole Wafer auf Raumtemperatur für 20 Minuten. </li><li> Richten Sie mpad Maske auf den Wafer und setzen für 95 bis 100 mJ/cm2 Dosis bei 365 nm (I-Linie). </li><li> Legen Sie die Wafer auf einer Heizplatte und Rampe von Raumtemperatur bis 95 ° C. </li><li> Post-Exposure Bake der Fotolack 25 Minuten bei 95 ° C. </li></ol> Entwickeln Materialien: <ul><li> 100mm Glasschalen (5) </li><li> Propylenglykolmethylether (PGMEA) </li><li> Isopropanol (IPA) </li><li> N2 </li></ul> Methode: <ol><li> In einer chemischen Kapuze, füllen fünf Gerichte mit PGMEA (2), IPA und Hexan (2). </li><li> Halten Sie Wafer in der 1. PGMEA für 10 Sekunden </li><li> Agitieren Wafer für 50 Sekunden </li><li> Transfer-Wafer bis zum 2. PGMEA mit Meniskus PGMEA. </li><li> Agitieren für 5 Sekunden. </li><li> Transfer-Wafer zu IPA mit Meniskus PGMEA. </li><li> Man schüttelt 20 Sekunden lang. </li><li> Transfer-Wafer bis zum 1. IPA. </li><li> Agitieren für 5 Sekunden. </li><li> Transfer-Wafer bis zum 2. IPA. </li><li> Agitieren für 5 Sekunden. </li><li> Schnelles Entfernen Wafer vom 2. IPA mit Meniskus IPA und trocken mit N2 </li><li> Untersuchen Muster. </li><li> Hardbake Wafer bei 120 ° C für 14-20 Stunden, um Cross-Link-SU-8. </li><li> Dice des Wafers mit einem Diamantschneider </li><li> Montieren Sie die Wafer auf einem Glasträger mit Epoxy </li><li> Fluorosilanize der Wafer (siehe Anleitung bei der Replikation Moulding) </li></ol> Replication Formen von mPADS Negativform Materialien: <ul><li> Einweg-Aluminium mit einem Gewicht von Boot </li><li> Polydimethylsiloxan (PDMS) base &amp; Härter (Dow, Midland, MI) </li><li> Razorblade </li><li> Silane: (Tridecafluor-1 ,1,2,2-tetrahyrooctyl)-1-Trichlorsilan </li><li> Glasträger </li><li> Glas Pasteur Pipette </li></ul> Methode: <ol><li> Mix PDMS 10:1 durch Gewicht und Degas in unter Vakuum 1 Stunde, um Luftblasen zu entfernen. </li><li> Legen Silizium Master-Form in Aluminium Boot. </li><li> Gießen Sie 50 bis 60 g PDMS über Master-Form in Aluminium Boot. </li><li> Degas unter Vakuum für 30 Minuten, um Luftblasen zu entfernen. </li><li> Blow off der Oberfläche eingeschlossene Luftblasen in PDMS mit schnellen Explosion von N2. </li><li> Legen Boot in Umluftofen bei 110 ° C für 15 Minuten, bis PDMS ist fest. </li><li> Cut entfernt Aluminium-Boot. </li><li> Mit Rasierklinge, wegschneiden PDMS unter Silizium-Master. </li><li> Peel PDMS weg vom Silizium-Master langsam und mit konstanter Bewegung in eine Richtung zu vermeiden, die Zerstörung der Meister. </li><li> Überprüfen Silizium-Master für Schäden. </li><li> Cut Negativform in 4 Stücke. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1-10 für einen großen Stapel von Negativformen. </li><li> Sauerstoff-Plasma behandelt Negativform für 1,5 Minuten an die Oberfläche zu aktivieren, oder </li><li> Ozon behandeln Negativform für 10 Minuten an die Oberfläche zu aktivieren. </li><li> Legen Sie Negativformen in Exsikkator mit mpad Funktionen ausgesetzt. </li><li> Verbreiten 250-500 ul von Silan auf Objektträger aus Glas in der Mitte der Exsikkator </li><li> Legen Glas Weide Pipette mit 150-200 ul von Silan in die Spitze innerhalb Exsikkator. </li><li> Vakuumkammer Silan und Mantel Negativformen für&gt; 14 Stunden verdunsten. </li></ol> mPADS Materialien: <ul><li> Polydimethylsiloxan (PDMS) base &amp; Härter (Dow, Midland, MI) </li><li> Weithals-Einweg Transferpipetten </li><li> 2 &quot;x 3&quot; Glasobjektträger </li><li> Glass Scribe </li><li> N2 </li></ul> Methode: <ol><li> Mix PDMS 10:1 durch Gewicht und Degas in unter Vakuum 1 Stunde, um Luftblasen zu entfernen. </li><li> Spitzen silanisiert Negativformen in &#39;Kreuz&#39; </li><li> Pipette PDMS in Negativformen so, dass die Funktionen sind vollständig zu einer 1mm Dicke bedeckt. </li><li> Warten Sie 30 Minuten für alle Luftblasen in der PDMS an die Oberfläche steigen. &lt;/ Li&gt; <li> In 30 &#39;Ausfallzeiten, Staub 22x22mm (Nr. 2) Deckgläser mit einem Strom von N2. </li><li> Sauerstoff-Plasma behandelt Glasträger Hälften für 1,5 Minuten zu reinigen und zu aktivieren Glas </li><li> Blow off der Oberfläche eingeschlossene Luftblasen in PDMS mit schnellen Explosion von N2. </li><li> Sanft legte Rand des Deckglases auf PDMS mit Plasma gereinigt zugewandte Seite des PDMS. Langsam senken die Objektträger aus Glas, so dass die PDMS vollständig Kontakte der gesamten Glasoberfläche und vermeiden Sie Luftblasen immer unter dem Objektträger aus Glas gefangen. </li><li> Ort montiert Formen in Umluftofen bei 110 ° C für 20 Stunden, um vollständig zu heilen. </li><li> Entfernen Formen aus dem Ofen nehmen und abkühlen lassen auf RT. </li><li> Halten Glasträger mit einer Hand oben und ziehen Sie ihn langsam negativen weg die Negativform aus dem Boden, die mpad freizugeben. </li><li> Überprüfen Sie die mpad unter dem Mikroskop auf zusammengebrochen Beiträge. </li><li> Re-silanisieren Form über Plasma-und Silan alle vier Castings. Die Negativform Lebensdauer für gute Replikation beträgt ca. 6-20 wirft. </li></ol> Seeding Cells auf mPADS Stempeln Materialien: <ul><li> PDMS-Stempel für UCP (siehe Tien, J &amp; Chen, CS, in Methoden des Tissue Engineering, 2001, S. 113-120.) </li><li> Ethanol (100% bzw. 70%) </li><li> Sterilisiert deionisiertes Wasser </li><li> 50 ug / ml humanem Fibronectin in sterilem, deionisiertem Wasser (BD Biosciences) </li><li> 5 ug / ml DiI-Lösung mit 0,2 um Membran (D-3886, Molecular Probes, OR) gefiltert </li><li> 2% Pluronics F127 (BASF, Mount Olive, New Jersey) </li><li> 1X Phosphatpufferlösung. </li><li> 100 mm x 25 mm Petrischale (4) </li><li> 150 mm x 25 mm Petrischale (2) </li><li> Aluminiumfolie </li><li> N2 </li><li> Pinzette </li><li> Sterile Hood </li></ul> Methode: <ol><li> Schneiden Sie überschüssige PDMS von mPADs </li><li> Wenn die PDMS-Stempel hat bisher verwendet wurden, beschallen Briefmarken in 100% Ethanol für 5 Minuten zu schrubben entfernt kontaminierenden Proteinen. </li><li> In sterile Haube, halten Stempel auf ihren Seiten mit einer Pinzette und trocken mit N2 nach dem Eintauchen Briefmarken in frischen 100% Ethanol und steriles Wasser </li><li> Legen Sie in 150 mm Petrischale mit Arbeit nach oben. </li><li> Aliquot Tropfen Fibronektin-Lösung auf jeder Briefmarke. Beginnen Sie mit den Ecken auf jedem der Stempel, dann werden die Kanten und zuletzt die inneren Bereiche. Anfangs der PDMS-Oberfläche des Stempels ist hydrophob, hydrophil, sondern wird als das Protein adsorbiert wird. Working &quot;von außen nach innen&quot; ändert sich die Kontaktwinkel des PDMS, so dass ein geringeres Volumen von Fibronektin-Lösung vollständig zu beschichten der Stempel erforderlich ist. </li><li> Lassen Sie sitzen für 1 Stunde in der Motorhaube für Proteinadsorption. </li><li> Wash Briefmarken mit DI-Wasser durch Gießen in Schale und ließ den Wasserstand über die Marken steigen. </li><li> Wash Briefmarken in 100 mm Petrischale mit DI-Wasser gefüllt. </li><li> Entfernen und trocken mit N2. </li><li> Ozon behandeln mPADS für 7 Minuten an der Oberfläche zum Stempeln zu aktivieren. </li><li> Unter der Motorhaube, Stempel mPADS indem Stempel Kante auf mpad und schonend senken die volle Kontakte zu knüpfen. Leicht auf der Oberseite des Stempels mit einer Pinzette, um sicherzustellen, alle Bereiche haben einen guten Kontakt, aber vorsichtig sein, nicht zusammenbrechen den Pfosten. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Stempel mit einer Pinzette. </li><li> Tauchen mPADS in 100 mm Petrischale mit 100% Ethanol für ~ 15 Sekunden. Keep Mikronadeln von Entnetzung während der Übertragung durch die Übertragung schnell zwischen Gerichten. </li><li> Tauchen mPADS in 100 mm Petrischale mit 70% Ethanol für ~ 15 Sekunden. </li><li> Tauchen mPADS in 100 mm Petrischale mit DI-Wasser für ca. 15 Sekunden. </li><li> Tauchen mPADS im zweiten 100 mm Petrischale mit DI-Wasser für ca. 15 Sekunden. </li><li> Tauchen mPADS in 150 mm Petrischale mit DI-Wasser. </li><li> Tauchen mPADS in 150 mm Petrischale mit 100 ml DiI-Lösung. </li><li> Mit Alufolie abdecken und für 1 Stunde einweichen. </li><li> Tauchen mPADS in 100 mm Petrischale mit DI-Wasser für ca. 15 Sekunden. </li><li> Tauchen mPADS in 150 mm Petrischale mit 10 ml 2% Pluronics und 90 ml PBS für die gesamte Konzentration von 0,2% Pluronics. </li><li> Cover und genießen für 1 Stunde. </li><li> Tauchen mPADS in 100 mm Petrischale mit DI-Wasser für ca. 15 Sekunden. </li><li> Tauchen mPADS im zweiten 100 mm Petrischale mit DI-Wasser für ca. 15 Sekunden. </li><li> Tauchen mPADS im dritten 100 mm Petrischale mit PBS für ~ 15 Sekunden. </li></ol> Seeding Materialien: <ul><li> Chosen-Zelllinie </li><li> Trypsin-EDTA (0,25% Trypsin mit EDTA • 4NA, Gibco Cat. Nr. 25200-056) </li><li> Wachstumsmedium </li><li> 1X Phosphatpufferlösung. </li></ul> Methode: <ol><li> In sterile Haube Platz mPADS in 100 mm Petrischale mit 17 ml Medium zu füllen. </li><li> Legen Sie Petrischale in Inkubator auf 37 ° C erwärmen </li><li> Suspend-Zellen über Trypsin </li><li> Saugen Sie mehrmals, um aufzubrechen Zellhaufen. </li><li> Pipet Zellsuspension in die Petrischale mit dem mPADS. Hinzufügen von Zellen, wie sie einzelne Zellen (ohne Zell-Zell-Kontakte) zum Zeitpunkt der Analyse bleiben. Die genaue Höhe der Zellen, um hinzuzufügen, ist Zelltyp-spezifisch undhängt Zelle ausbreiten Bereich und Wachstumsrate. </li><li> Vorsichtig verteilen Zellen in Petrischalen mit langsamen pipettieren. </li><li> Legen Sie in Inkubator für 2 Stunden, damit Zellen, sich niederzulassen und auf Mikronadeln halten. </li><li> Überprüfen Sie mPADS zu sehen, ob Zellen ausgebreitet haben. Die Zellen aussehen wird abgeflacht und span sechs oder mehr Stellen. </li><li> Wenn Zellen verteilt sind, übertragen mPADS neue 100 mm-Petrischale mit 21 ml frisches Medium. </li><li> Die mPADS sind bereit für das Experiment. </li></ol> Beizen und Montage mPADS Festsetzung Materialien: <ul><li> Entionisiertes Wasser </li><li> Paraformeldahyde (16%) Fläschchen </li><li> 10X Phosphatpufferlösung. </li><li> 1X Phosphatpufferlösung. </li></ul> Methode: <ol><li> In einem 50 mL Zentrifugenröhrchen, 30 ml DI, 10 ml paraformeldahyde (ganze Flasche) und 4,5 ml 10X PBS für die Fixierlösung. </li><li> Add ~ 25 ml Fixierlösung zu einer 100 mm Petrischale. </li><li> Sanft tauchen mit Zellen in Befestigung Gericht mpad und lassen inkubieren für 20 Minuten. </li><li> Tauchen mPADS in 100 mm-Schale mit 1X PBS dreimal. </li><li> Ready for Immunfärbung und Montage. </li></ol> Analyse zellulärer Kräfte auf mPADS Konfokale Bildgebung Materialien: <ul><li> Konfokalmikroskop </li><li> 63X Ziel </li><li> Filter Würfel für Sekundärantikörper </li><li> Grünfilter cube (Rhodamin) für DiI Bildgebung von Mikronadeln. </li></ul> Methode: <ol><li> Legen Sie mPADs auf der Bühne und finden Einzelzellen mit 300 ms Belichtung, keine Binning. </li><li> Bild Spitzen der Mikronadeln für TOP BILD. </li><li> Mit z-control-Anzeige, Aufnahme Bild von Mikronadeln für untere Bild. </li><li> Bild jedes andere Kanäle haben Sie Flecken in (Hoechst, Phalloidin etc.) </li></ol> Image Analysis Materialien: <ul><li> MATLAB mit Image Processing Toolbox </li></ul> Methode: <ol><li> Drehen und registrieren Sie oben und unten Bilder </li><li> Messen Schwerpunkte der Unterseite (abgelenkten) und oben (abgelenkt) Positionen </li><li> Berechnen Sie die Verschiebung </li><li> Mit der Federkonstante für die Beiträge (auch bekannt, hängt von post-Geometrie), berechnen Kraftvektor bei jedem Beitrag </li><li> Fehler Analyse basiert auf der Fähigkeit, Kräfte zu lösen basiert, und ist abhängig von der Bildauflösung und Schwerpunkt-Erkennung Auflösung </li><li> Ordnen Sie die Daten gemäß Ihrer individuellen Bedürfnisse - zB Kraftgrößen und / oder Richtung, als eine Zeit natürlich viele Messungen über unterschiedliche Bedingungen etc. </li></ol>

<ol>
	<li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D., Gray, D. S., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 100, 1484-1489 (2003).</li><li>Sniadecki, N. J., Chen, C. S., Wang, Y. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Silicone+Elastomeric+Post+Arrays+for+Measuring+Traction+Forces+of+Adherent+Cells.">Microfabricated Silicone Elastomeric Post Arrays for Measuring Traction Forces of Adherent Cells.</a> Methods in Cell Biology - Cell Mechanics. 83, 313-328 (2007).</li><li>Lemmon, C. A., Sniadecki, N. J., Ruiz, S. A., Tan, J. T., Romer, L. H., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+Force+at+the+Cell-Matrix+Interface:+Enhanced+Analysis+For+Microfabricated+Post+Array+Detectors.">Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis For Microfabricated Post Array Detectors.</a> Mechanics &amp; Chemistry of Biosystems. 2, 1-16 (2005).</li></ol>

microfabricated post-array-detectors (mpads): an approach to isolate mechanical forces

In diesem Video präsentieren wir unseren Ansatz zur zellulären Zugkräfte über eine mikrostrukturierte Reihe von Stellen zu messen. Zugkräfte werden durch Myosin-Aktin-Interaktionen generiert und spielen eine wichtige Rolle in unserer Physiologie. Während der Entwicklung, ermöglichen sie Zellen von einem Ort zum nächsten bewegen, um den frühen Strukturen der Gewebe zu bilden. Zugkräfte Hilfe im Heilungsprozess. Sie sind notwendig für die ordnungsgemäße Schließung von Wunden oder die Migration von Leukozyten und kriechen durch unseren Körper. Dieselben Kräfte kann sich nachteilig auf unsere Gesundheit im Fall von Krebs Metastasen oder vaskuläre Wachstum hin zu einem Tumor. Die häufigste Methode, mit der Zellen in vitro zu untersuchen wurde ein Glas-oder Polystyrol-Schale verwenden. Allerdings macht die Steifigkeit der Substrate es unmöglich, körperlich messen Zelle Zugkräfte, und es gibt relativ wenige Methoden, um Zugkräfte zu studieren. Unser Labor hat eine Technik, um diese Einschränkungen zu überwinden entwickelt. Die Methode basiert auf einer vertikalen Anordnung von flexiblen Auslegern, die Steifheit und Größe zu skalieren, von denen so dass die einzelnen Zellen über viele Ausleger verteilen und lenken sie in den Prozess beruhen. Die Säulen wir benutzen, sind 3 mu m im Durchmesser, 10 mm hoch und werden in einer regelmäßigen Anordnung mit 9 um Mitte-zu-Zentrum-Abstand konfiguriert. Aber diese physischen Abmessungen können leicht variiert werden, um eine Vielzahl von Studien aufnehmen. Wir beginnen mit einem Silizium-Master, aber die endgültige Beiträge sind aus Silikon-Kautschuk genannt Poly (dimethylsiloxan) oder PDMS hergestellt. Wir können die Verformungen unter dem Mikroskop zu messen und berechnen Sie die Größe und Richtung der Zugkräfte erforderlich, um die beobachteten Ablenkungen zu erzeugen. Wir nennen diese Substrate mikrofabrizierten post-Array-Detektoren oder mPADs. Hier zeigen wir Ihnen, wie wir und fertigen die mPADs zu Modulationen der zellulären Kontraktilität beurteilen.

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Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

In diesem Video zeigen wir, wie in der Herstellung und Nutzung mikrofabrizierten post-Array-Detektoren (mPADs) zu Modulationen der zellulären Kontraktilität beurteilen.

Mikrofabrizierten Post-Array-Detektoren (mPADs): Ein Ansatz zur Mechanical Forces Isolate

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

microfabricated-post-array-detectors-mpads-an-approach-to-isolate

Research

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Biology

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

12.4K Aufrufe.  University of Pennsylvania. In diesem Video zeigen wir, wie in der Herstellung und Nutzung mikrofabrizierten post-Array-Detektoren (mPADs) zu Modulationen der zellulären Kontraktilität beurteilen.

Serie: Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Mit Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) zu Diagnose-Tools entwickeln

Forschung

Biologie

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Ein Ex-ovo Chicken Embryo Culture-System Geeignet für Imaging und Mikrochirurgie Anwendungen

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Ein In vivo Vernetzung Ansatz zur Proteinkomplexe Von Isolieren Drosophila Embryonen

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Ein alternativer Ansatz für die Probenvorbereitung mit geringer Zellzahl für die TEM-Analyse

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

Analyse Zelloberflächenhaftung Remodeling in Reaktion auf mechanische Spannung Mit Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Bewertung von Dictyostelium Discoideum Reaktion auf akute mechanische Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

Vorsprung-Kraft-Mikroskopie: Eine Methode, um Kräfte entwickelt von Zelle Vorsprünge zu quantifizieren

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

Eine High Output-Methode zum Isolieren von zerebralen Pericyten von der Maus

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...