This work was supported by the Committee Technology and Innovation (CTI) Switzerland grant 14796-PFLS-LSCTI. MicroPost arrays were generously provided by MicroDuits GmbH.

1. Kultivieren von Zellen auf Micropost Arrays Hinweis: Alle Schritte müssen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt, um die Sterilität zu gewährleisten. Die hier angegebenen Volumina sind für T25 Zellkulturflaschen. Das Zellkulturmedium Rezept und Zellaussaatdichte für Knochenkrebszelllinien HuO9 und M132 optimiert. <ol><li> Bereiten Sie eine Zellkultur für die Aussaat auf eine micropost Array. <ol><li> Untersuchen Sie den Zellkulturqualität, indem die Kulturflasche auf einem Standard-Lichtmikroskop. Sicherzustellen, dass die Zellen eine typische Wachstum und Morphologie durch Schätzen, wie viel von der Kulturflasche Boden bedeckt. Eine Abdeckung von 70% -80% entspricht einer gesunden Wachstumsrate. Achten Sie auf die Höhe der schwimmenden Zellen, wie sie abgestorbene Zellen und / oder einen überwucherten Kultur zu repräsentieren. </li><li> Trypsinize Zellen durch Entfernen Medium und Waschen mit 4 ml 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) -Puffer. Hinzuzufügen 0,8 ml 1x Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Inkubation bei RT, bis die Zells dislodge, die etwa 2-4 min dauert. Überprüfen Sie den Prozess mit dem Mikroskop und gelegentlich die Flasche klopfen sanft um das Verdrängen zu unterstützen. </li><li> 5 ml Zellkulturmedium (Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) / F12 mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin / Streptavidin (Pen / Strep)), um die Reaktion zu stoppen und zu waschen Restzellen, die still sitzen auf der Unterseite des Kolbens ist. Anschließend pipettiert diese Suspension nach oben und unten mehrere Male, um eine homogene Mischung zu erhalten. Sicherstellen, dass alle Lösungen in der ursprünglichen Wachstumsbereich der Flasche pipettieren, um eine effektive Verdrängen zu gewinnen. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in in ein 15 ml Röhrchen und zentrifugieren Sie es mit einem Tischzentrifuge bei 0,5 × g für 3 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Zellpellet in 5 ml Medium durch Auf- und Abpipettieren 5 mal. Achten Sie darauf, um die Erzeugung von Luftblasen zu vermeiden, während dies zu tun. </li><li> Bestimmen Sie die Zelldichte mit Hilfe eines Zellzählung Kammer und eine Licht microscope. Überprüfen Sie die Zellsuspension in Zellzählung Kammer für Zellaggregate und sorgen nur Einzelzellen für die nachfolgende Experiment haben. Pipette wieder nach oben und unten mehrere Male, wenn die Zellen dazu neigen, Aggregate, sie zu trennen bilden. </li><li> Verdünnen der Zellsuspension mit ausreichender Medium, um ein Zelllösung von 25.000 Zellen / ml zu erhalten. Gut mischen durch Invertieren des geschlossenen Rohr mehrmals. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine micropost Array für Zellaussaat. Kritische Anmerkung: auf die micropost Array Sie pipettieren nicht direkt, da dies möglicherweise die microposts schaden, vor allem, wenn unerwünschte Luftblasen eingebracht werden. Darüber hinaus stellen Sie sicher, dass die micropost Array trocknet nie aus, wie auftretende Kapillarkräfte zu Kollabieren der microposts führen. <ol><li> Legen Sie das Glassubstrat mit dem micropost Array Seite nach oben in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte mit Hilfe einer Pinzette und nass ist es durch Zugabe von 1 ml Ethanol (99%). Inkubieren bei Raumtemperatur für 20-30 sec. </li><li> Verdünnen Sie das Ethanolstufenweise durch Zugabe von ungefähr 1 ml sterilem entionisiertem Wasser (DI-Wasser) an der Bettseite und Absaugen ungefähr 1 ml unter Verwendung einer Transferpipette oder Absaugvorrichtung. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens 3 mal. </li><li> Ersetzen den DI-Wasser mit PBS-Puffer auf die gleiche Weise durch Zugabe und Absaugen von ungefähr 1 ml. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal. </li><li> Ersetzen Sie den PBS-Puffer mit mittlerer durch Zugabe und Absaugen etwa 1 ml Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal. </li></ol></li><li> Pipette 1 ml Zelllösung (25.000 Zellen) auf der jeweils vorbereitet micropost Array. Schließen Multiwellplatte und überträgt es auf einen Inkubator (CO 2 5%, 37 ° C). Lassen Sie die Zellen anhaften und wachsen auf der Oberseite des microposts für 6 -7 Std. </li><li> Untersuchen Sie den Klebeprozess gelegentlich unter Verwendung eines Licht ein Mikroskop. Überprüfen Sie, dass die meisten der Zellen erscheinen ausge über mehrere microposts verbreiten. </li></ol> 2. Fixing &amp; Färben von Zellen Hinweis: Alle Schritte undVolumina hier angegebenen sind für eine einzelne Vertiefung einer 12-Well-Platte. Es empfiehlt sich, zu einem Zeitpunkt, um ein Austrocknen der Vertiefungen nach dem Ansaugen einer Flüssigkeit, die in einem Kollabieren der microposts führt vermeiden verarbeiten nicht mehr als vier der zwölf Vertiefungen. <ol><li> Aspirat Medium aus dem Bohrloch und waschen Zellen 2x mit 1 ml PBS-Puffer. Achten Sie darauf, um eine sanfte Kraft aufzubringen, während dem Waschen mit PBS, um Zelltrümmer, die auf dem micropost Array während der Inkubation angesammelt entfernen und toten Zellen zu lösen. </li><li> Befestigen Sie die Zellen mit 0,5 ml 3,7% gepufferte Formaldehydlösung für 5 min. </li><li> Ersetzen Sie die Formaldehyd-Lösung durch Waschen der micropost Array 2x mit 1 ml sterilem DI-Wasser. </li><li> Färben die Zellen mit Farbstoff (0,05% Coomassie Brilliant Blue in 50% Wasser, 40% Ethanol und 10% Essigsäure) für ca. 90 sec. Waschen Sie überschüssige Färbelösung off 2x mit 1 ml sterilem DI-Wasser. 1 ml VE-Wasser auf Array micropost. </li><li> Überprüfen Färbungsergebnis mit einem Lichtmikroskop. Wiederholen tHE-Färbung Schritt, wenn Zellkörper ist zu schwach, um sichtbar gemacht werden. </li><li> Shop micropost Arrays mit den gefärbten Zellen auf der Oberseite in einem Kühlschrank bei 4 ° C. Stellen Sie sicher, sie unter Wasser zu allen Zeiten zu halten. </li></ol> 3. Cell Imaging Hinweis: Schritt 4 gilt nur für Mikroskope, ohne unendlich korrigierte Optik. <ol><li> 2 ml VE-Wasser in eine Petrischale mit einer dünnen Glasboden für hochauflösende Bildgebung. </li><li> Bringen micropost Array mit einer Pinzette in den bildgebenden Schale mit dem microposts nach oben zeigt. </li><li> Legen Sie die Imaging-Petrischale auf einem beweglichen Tisch eines Lichtmikroskops. </li><li> Drehen des Kompensationsrings des Objektivs zur Bilderzeugung verwendet, bis die Anzahl auf der Skala stellt die Gesamtdicke aller Materialien entlang des optischen Pfades für die Fehlanpassung der Brechungsindizes des Glassubstrats, das Siliconelastomer und der Flüssigkeit auf der Oberseite zu kompensieren. Dies sollte zu einem hellen Erscheinungsbild der microposts führenKerne. </li><li> Schließen Sie die Blende auf der Beleuchtungsseite nach unten auf 50% und keine Phasenkontrastringe zu entfernen aus dem Strahlengang ermöglicht eine gewöhnliche Hellfeld-Modus. </li><li> Richten Sie die micropost Array, das die microposts bilden eine horizontale Linie über das Beobachtungsfeld. Definieren Sie einen Startpunkt (zB links oben) und bewegen Sie die Petrischale schrittweise über die Bühne Scannen des micropost Array während der Einnahme von zahlreichen Bildern. </li><li> Nehmen Sie alle Bilder mit der höchsten Auflösungseinstellung für die Kamera mit einem 20X oder 40X-Objektiv. Ziel ist es, eine einzelne Zelle in der Mitte des Bildes haben. </li><li> Kehren entlang der z-Achse durch das Substrat, bis die micropost Spitzen scharf sind. Verwenden Sie die Feinabstimmung Fokusrad des Mikroskops und drehen Sie ihn in Richtung Konzentration auf die micropost unten für ca. 2-3 &amp; mgr; m. </li><li> Stellen Sie die Standard-Bildgebungsverfahren, indem sie Testbildreihe aus einem Feldabschnitt fegt durch die Bildaufnahmeparameter ein zu einer Zeit (zB Belichtungszeit,Blendeneinstellung, Lampeneinstellungen usw.). Analysieren Sie Bilder mit MechProfiler und bestimmen einen geeigneten Parametersatz für eine schnelle und zuverlässige Analyse. </li></ol> 4. Bildanalyse mit Open Source Software &quot;MechProfiler&quot; Hinweis: Alle Software-Funktionen können Sie mit einem Zeigegerät mit der linken Maustaste aktiviert werden. Allerdings wird ein ausgebildeter Bediener die dokumentierten Tastenkombinationen entwickelt, um auf der linken Hälfte der Tastatur, um eine effiziente zweihändige Bildverarbeitung zu ermöglichen verwenden. <ol><li> Starten Sie Bildanalyse-Software MechProfiler und öffnen Sie eine Reihe von Bildern, die durch Klicken auf &quot;Öffnen&quot;, analysiert werden müssen. </li><li> Setzen Sie alle Parameter in den &quot;Settings&quot; Abschnitt von dem Software-Entwickler gegeben. Bestimmen Sie die Parameter, die benutzerdefinierte konfiguriert werden müssen (dh Kontur Schwelle und Minimalabstand) nach den im Einzelnen von der Software Handbuch beschriebenen Pflegehinweise. </li><li> Bild zu analysierens one-by-one durch Zuschneiden sie an den Bereich von Interesse unter Verwendung &quot;Crop&quot; (klicken und ziehen Sie mit gedrückter Maustaste nach unten). Klicken Sie doppelt in der gezeichneten Rechtecks, um diese Aktion zu beenden. </li><li> Markieren jedes sichtbare Zellkontur one-by-one, indem Sie auf &quot;Draw Zell Konturen&quot; und verwenden Sie das Fadenkreuz zum Zeichnen einschließlich aller microposts die Zelle zugeordnet ist. </li><li> Entsorgen Sie alle unerwünschten microposts indem Sie auf &quot;Verwerfen Beiträge&quot; und verwenden Sie das Fadenkreuz zum Zeichnen. Schließen Sie alle microposts, die in eine Zelle außerhalb des Bildausschnitts gehören, oder dass sich aus einem anderen Grund, aber nicht von der Zelle von Interesse abgelenkt wird. </li><li> Starten Sie die Software-Unterprogramm &quot;finden Zentroide&quot; per Mausklick. Stellen Sie die Filtereinstellung direkt neben dem &quot;Suchen Zentroide&quot; drücken, bis alle microposts registriert sind, die mit einem roten Kreuz in der Mitte zu sehen ist. Wenn die Filtereinstellung zu niedrig ist microposts werden ignoriert, wenn sie zu hoch multiple Positionen werden für eine einzelne micropost markiert werden. Halten Sie die Filtereinstellung während einer Analysesitzung konstant. </li><li> Verwenden Sie die manuelle Bearbeitungsfunktion &quot;Manual Edit&quot; für die Flächenschwerpunkte mit mehreren oder verpasste micropost Positionen. Benutzen Sie die Maus, um das Fadenkreuz micropost in Frage durch Klicken und Ziehen sie über auswählen. Doppelklicken Sie innerhalb des Rechtecks ​​und legen Sie die fehlenden roten Marker in der vergrößerten Bildausschnitt, der automatisch schließt. Entsorgen eines solchen micropost wenn sie außerhalb der Zelle gezogen Kontur ist (siehe Schritt 4.5), bevor Sie fortfahren. </li><li> Finden Sie die ideale micropost Gitter durch die Aktivierung der Funktion &quot;Grid&quot; mit einem Mausklick. Achten Sie darauf, die Position entspricht der wahren micropost Kopf, durch einen blauen Ring dargestellt ist, im Inneren der Zelle gezogen Umriss. </li><li> Korrigieren Sie alle fehl am Platz Gittermacher innerhalb der Zelle Bereich, in dem über die entsprechende Funktion &quot;Manuel Edit&quot; mit einem Mausklick erforderlich. Verwenden Sie das Fadenkreuz, um die micropost in qu wählenestion durch Klicken und Ziehen sie über. Doppelklicken Sie in der erscheinenden Rechtecks ​​und legen Sie die fehlenden blauen Marker in der vergrößerten Bildausschnitt, der automatisch schließt. </li><li> Über die Schaltfläche &quot;berechnen Biegungen&quot; per Mausklick, um ein Histogramm der berechneten Ablenkungswerte auf der Basis der Differenz zwischen der Position eines micropost innerhalb des Bildausschnitts und der erzeugten idealen Raster zu erhalten. </li><li> Speichern Sie die vollständige Analyse einschließlich der Wertetabellen durch einen Mausklick auf &quot;Speichern&quot;. </li><li> Fahren Sie mit der Bildanalyse, entweder, indem Sie auf &quot;Ansicht zurücksetzen&quot; und zu analysieren, einen anderen Bildausschnitt oder Mausklick auf &quot;nächstes Bild&quot;, das bequem mit der rechten Tastatur Cursor-Taste durchgeführt werden. </li></ol> 5. Datenanalyse - Mechanoprofiling <ol><li> Öffnen Sie die Datei &quot;results.xls&quot; mit einem Büro Tabellenkalkulationsprogramm aus dem Ordner mit den analysierten Bilder. Sie enthält die Daten all berechneten Werte einschließlich aller micropost Biegungen und Standard-Derivat Maßnahmen wie Arbeit (dh Substratverformungsenergie) von der Zelle analysiert. </li></ol>

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</ol>

The lead author (NG) is co-founder of MicroDuits GmbH, the commercial supplier of the micropost arrays used in this study. No other authors have any potential conflicts of interest with this work.

Diese Arbeit zielt darauf ab, den Bereich der Traktionskraftmikroskopie durch im wesentlichen Senkung technischen und praktischen Markteintrittsschranken voraus. Diese Barrieren kommen von zwei Seiten. In erster Linie sind die zahlreichen nicht-triviale technische Herausforderungen, die überwunden werden müssen reproduzierbar herzustellen und experimentell zu beauftragen eine micropost Array werden. Zweitens ist die in ähnlicher Weise nicht-triviale Bedarf an einer zuverlässigen halbautomatische Analyse von Einzelze...

Mechano empfindlichen zellbasierte Assays ermöglichen die Untersuchung von adhärenten Zellen, mit einer breiten Palette von Anwendungen, die die zentrale Rolle, die Mechanik in der Zellbiologie spielen reflektieren. Diese Anwendungen konzentrieren sich oft auf die zugrunde liegenden Mechanismen, die subzelluläre Prozesse oder Ganzzellverhalten zu fahren. Einerseits können externe Umweltfaktoren, wie die extrazelluläre Matrixzusammensetzung oder Matrixsteifigkeit dramatischen Einfluss auf die mechanischen und biologischen Antwort der Zelle. 1 Das gleiche kann nach der Verwendung von vielen Klassen von pharmazeutisch wirksamen Verbindungen beobachtet werden, deren Wirkungen sind häufig unter Verwendung von Zellkulturmodellen charakterisiert. 2 auf der anderen Seite genotypischen Eigenschaften, wie sie durch spontane oder experimentell induzierter Genmutationen verursacht werden, können starke Änderungen Zellphänotypen, die mit Veränderungen im Zytoskelett Struktur und Funktion zugeordnet sind induzieren. 3 Diese Beispiele sind nur ein paar der vielen möglichenThemen, für die mechanische Phänotypisierung der Zellen von Bedeutung ist, und alle diese sind zweckmäßigerweise mit micropost Arrays untersucht. Zum Zeitpunkt des Schreibens dieses Artikels, haben rund 200 Artikeln veröffentlicht worden beschreiben zell micropost Interaktion. Diese Arbeiten diskutieren theoretische Aspekte der micropost Ablenkung Grundlagen sowie praktische Hinweise zu deren Herstellung. Der erste Artikel der Wechselwirkung von Zellen und flexible micropost Arrays beschreibt, wurde von Tan und Kollegen im Jahr 2003 4 veröffentlicht Im Gegensatz zu klassischen Traktionskraft-Mikroskopie (TFM), wo kontinuierliche weichen Substraten verwendet werden, um Nanonewton-Wägezelle Kontraktilität, Tan et al schätzen. ein Verfahren beschrieben, unter Verwendung von mehreren eng beabstandeten vertikalen Balken aus Silikonelastomer hergestellt. Die Hauptvorteile dieser Technik ergeben sich aus zwei Hauptfunktionen. Erstens, um die Zell-Substrat scheinbare Steifigkeit zu ändern braucht man nur die micropost Abmessungen verändern, währendDie Substratzusammensetzung ansonsten konstanten und wodurch Unterschiede in der Oberflächentopologie und Chemie. Zweite microposts handeln wie einzelne Federn, die diskret mit Kraft und räumlichen Auflösungen in der Größenordnung von einzelnen fokalen Adhäsionen untersucht werden kann und die analytischen Herausforderungen, die inhärent analoge Analyse durch Standard-TFM sind zu reduzieren. Heute ist die Palette von Anwendungen für micropost Arrays stark gerade die Abbildung der Kräfte für ein paar Einzelzellen überschreitet. So berichtet Akiyama die Verwendung eines isolierten Rückengefäß Gewebe von einem Falter Raupe als Aktuator für eine micropost Array, um ein Insekt mit Muskelkraft betriebene autonome Mikroroboter zu entwickeln. 5 Allerdings haben die meisten Veröffentlichungen zur microposts auf Studien von Erkrankungen wie Infektionen oder Krebs. Zum Beispiel haben micropost Arrays verwendet, um die Krafterzeugung von gebündelten Typ IV-Pili von Neisseria gonorrh studierenOEA Kolonien, die mit Signalkaskaden Verbesserung Infektion assoziiert ist. 6 Andere haben microposts verwendet, um Brustkrebszellen mit pharmazeutischen Verbindungen zur Förderung der Zytoskelett behandelt zu studieren. 7 Ablenkung eines micropost wird oft mit klassischen Balkentheorie beschrieben, für einen Freischwinger mit einem Ausgabeaufschlag unter der Annahme der Zelle misst nur auf die Spitze der micropost. Hier wird die aufgebrachte Kraft F, die eine Durchbiegung δ verursacht, hängt von der micropost des &quot;Biegesteifigkeit&quot; k und wird berechnet durch: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq1.jpg" /> (1) mit E, I, und L der Elastizitätsmodul, Flächenträgheitsmoment und Strahllänge auf. Allerdings ergibt sich aus dieser Gleichung geben nur einen allgemeinen Angleichung der Kräfte am Werk, da Strahl Scher- und Biege sowie Substrat Verziehen nicht in ac getroffenGraf. In Anbetracht, dass microposts werden typischerweise aus weichen Materialien wie Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellt -basierte Silikonkautschuk müssen diese Faktoren einbezogen werden. . Schoen et al gezeigt, daß es eine solche Korrekturfaktor auf der Basis des Seitenverhältnisses des micropost (L / D) und der entsprechenden Polymer Poissonzahl v 8 Es wird durch gegeben.: <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq2.jpg" /> (2) Mit T-Neigung (v) ein Neigungskoeffizienten, die Anpassungsparameter a = 1,3, wie in dem gleichen Artikel gefunden werden enthält: <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq3.jpg" /> (3) Das bedeutet, dass ein micropost korrigiert Steifigkeit k corr ist das Produkt aus dem reinen Biegesteifigkeit k = k Kurve und der Korrekturfaktor Korrgegeben durch: <img alt="Gleichung 4" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq4.jpg" /> (4) Daher sollten Zellkraftberechnungen unter Verwendung des verfeinerten Variante der Gleichung (1) gerade lesen werden: <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq5.jpg" /> (5) Die Auswirkungen der Korrektur offensichtlicher, sobald typische Werte für micropost Abmessungen eingesetzt werden. Zum Beispiel ein 15-Mikron lang micropost mit einem kreisförmigen Querschnitt und einem Durchmesser von 5 um aus PDMS-basierten Silikonkautschuk führt zu einem Korrekturfaktor von 0,77 und somit eine korrigierte Berechnung würde der ausgeübten Kräfte Zelle um 23% zu überschätzen. Dies wird umso schwerer für microposts mit kleineren Seitenverhältnisse. Traditionell wurde micropost Bildanalyse auch auf idealisierten Strahlbiegetheorie basiert. Im Jahr 2005 die Gruppe, die die Verwendung von MICR-Pionieropost Arrays veröffentlichte eine Bildanalyse-Software für micropost Analyse geeignet 9 Die Software benötigt eine Software-Lizenz und der Benutzer muss drei Bilder für jede Position zu nehmen. jeweils einer aus oberen und unteren Ebenen der micropost im Sendemodus und ein anderer in der Fluoreszenzmodus mit dem gefärbten Zelle. Nach einem Vergleich der oberen und unteren Positionen für jede micropost die Software bestimmt einen Kraftvektor Feld und berechnet damit verbundenen Parameter wie Kraft pro Beitrag. Andere Softwarepakete bestehen und deren Analyse Prinzipien werden kurz in die entsprechenden Artikel, die sie beschreiben, erwähnt, aber diese Analysesoftwarepakete sind in der Regel nicht öffentlich verfügbar. 10,11 Die micropost Anordnungen zum Abbilden von Zellkräften konstruiert werden kann als welche entweder in einer orthogonalen micropost Layout oder einem hexagonalen ein, von denen die letztere den Vorteil haben äquidistanten Abstände zwischen allen benachbarten microposts klassifiziert werden. Typische microposts have einen runden Querschnitt und ihre Abmessungen im Bereich von 1,0 um bis 10 um im Durchmesser und 2 bis 50 um in der Länge. 4 jedoch microposts mit elliptischen oder quadratischen Querschnitt haben ebenfalls berichtet. 12,13 Die Verwendung von PDMS-basierten Silikon-Mischungen als micropost Material ermöglicht zum Addieren Nanopartikel in der Mischung. Zum Beispiel das Hinzufügen Cobaltnanostäbe ermöglicht eine magnetische Aktivierung des micropost und somit gibt einen weiteren Freiheitsgrad, um mögliche experimentelle Designs. 14 Die meisten Gruppen auf flachen starren Substraten wie Deckglas oder in einer Petri-Schale produzieren ihre micropost Arrays. Allerdings Mann und Mitarbeiter berichteten kürzlich über eine micropost Array auf einem dehnbaren Membran gebildet. 15. Dies ermöglicht die Anwendung von Zelldehnungskräfte an anhaftenden Zellen während des Studiums lebenden Zellen subzellulären dynamischen Reaktionen in Bezug auf Zellkontraktilität. Die breite Anwendung und die meisten Established Verfahren zur Herstellung micropost Arrays auf Weich-Lithographie, wie in den Protokollen der aufschluss Sniadecki und Kollegen. 16-18 Kurz Standardreinraumprozesse beschrieben werden, verwendet werden, um die Mikrostrukturen auf einem Siliziumwafer unter Verwendung von Fotolack SU8 Ganzes erzielt. Dies wird durch ein Kopierverfahren, bei dem der Silikonkautschuk über die Strukturen ihre Übertragung in Formen gegossen, gefolgt. In einem zweiten Schritt diese Formen werden verwendet, um die anfängliche Mikrostruktur unter Verwendung von Silikonkautschuk auf einem gewählten Substrat replizieren. Doch trotz der großen und wachsenden Zahl von Publikationen, um ihre Anwendung beziehen, zur Schaffung einer Herstellungsprozess für microposts nimmt sehr viel Zeit sogar für Mikrotechnik-Experten; es gibt viele Prozessschritte, die Optimierung und Anpassung an die spezifischen Testumgebung und micropost Layout benötigen, um ein akzeptables Qualitätsniveau zu liefern. Kommerzielle micropost Arrays sind jetzt in einer ready-t verfügbaro-Nutzung (&quot;off-the-shelf&quot;) Format mit einer gleichbleibend hohe Qualität. Als solche sind sie eine Alternative zu dem Vor-Ort-Erzeugung erforderlichen komplizierten und langwierigen Herstellungsprozess. In dieser Arbeit wurde ein im Handel erhältlicher micropost Array zur Abbildung zellulärer Kräfte mit einem einzigen Bild Hellfeldmikroskopie verwendet. Noch wichtiger ist in diesem Artikel beschrieben und dokumentiert eine voll funktionsfähige Open Source-Software mit dem Namen MechProfiler, die zum Download als Begleitmaterial zu diesem Manuskript zur Verfügung steht. Eine aktiv gepflegte Version der Software finden Sie auch bei http://www.orthobiomech.ethz.ch gefunden werden. Die Kombination aus einem &quot;off-the-shelf&quot; Assay und einem kompatiblen Open-Source-Analyse-Software deutlich senkt die Eintrittshürde, um genaue TFM Experimenten zu erreichen. Forscher ohne Zugang zu entweder Reinraumanlagen oder Software-Entwicklungskompetenz können zelluläre Kräfte erfolgreich zu analysieren. Es einem Benutzer ermöglicht, auf den mechanos konzentrierenensitivity Assay Ausgangs anstatt die Technologie selbst, und macht Zugkraftmessungen zur Verfügung, um eine breitere Gemeinschaft. Darüber hinaus ist dies ein wichtiger Schritt, um den Weg zur vollautomatischen Überprüfungen micropost Arrays zu ebnen. Die MechProfiler Analyse-Software verarbeitet Bilder in Dateiformat TIFF, PNG, BMP und JPG. Bilder können unter Verwendung von Fluoreszenz, Phasenkontrast und Hellfeld-Lichtmikroskopie genommen werden. Die Standalone-Programm läuft zusammen mit dem freien Matlab Compiler Runtime (verfügbar unter: Abbildung 12) und die zugrunde liegenden Algorithmen erlauben schlanke Bildverarbeitung, die dem Benutzer ermöglicht, Bilder mit einzelnen oder mehreren Zellen in etwa 1 min zu verarbeiten. Ferner können diese Zellen entweder lebenden oder &quot;fixiert&quot;. Die MechProfiler Software kann die Datenanalyse Durchsatz stark zu erhöhen, indem sie sich auf die Reproduzierbarkeit der Qualität kommerzieller micropost Anordnungen, genauer gesagt, die Standard &amp; #8220; nicht abgelenkten &quot;Position jeder Eintrag in der Anordnung gegen ein ideales Raster ausgegangen werden (für das Gitter in der für diese Studie verwendeten Arrays Fertigungsabweichungen betrugen weniger als 100 nm). Kurz öffnet man eine Auswahl von Bilddateien für die Analyse, schneidet sie in den Bereich von Interesse definiert, die Beiträge von Zellen bedeckt oder die verworfen werden müssen, bestimmt die Postpositionen, berechnet die Durchbiegungen / Kräfte gegen idealen Rasters und schließlich speichert alle zellspezifischen Daten mit der Möglichkeit für den Export, darunter zu einem Standard-Office-Tabellenkalkulation.

<table><tbody><tr><td>T25 cell culture flasks</td><td>Nunc</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS-buffer</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Medium DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>FBS South America</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 100x</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge vials</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin</td><td>MicroDuits</td><td>MPA-col1/FN</td><td>Micropost dimensions: &amp;Oslash;=6.4&amp;#160;&amp;micro;m, l=18.2 &amp;micro;m; grid=13 &amp;micro;m, k&lt;sub&gt;corr&lt;/sub&gt;=2.87&amp;#160;nN/&amp;micro;m</td></tr><tr><td>Ethanol abs p.A.</td><td>Merck</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Nunc</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td><td>Sigma</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Blue G-250</td><td>Sigma</td><td>27815</td><td>Coomassie blue</td></tr><tr><td>Methanol ACS p.A.</td><td>Merck</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dish</td><td>WillCo Wells BV</td><td>GWSb-3522</td><td>35 mm diameter, aperture 22&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>T-100 Eclipse</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Inverted microscope</td></tr><tr><td>D3-L3</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Camera controler</td></tr><tr><td>DS Fi2</td><td>Nikon</td><td></td><td>Camera</td></tr></tbody></table>

easy and accurate mechano-profiling on micropost arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Der Hauptvorteil der beschriebenen Technik liegt in seiner Einfachheit und das Potenzial für eine schnelle und effektive Integration in die Routinelaborarbeiten. Die Kombination von hochwertigen kommerziellen Sensoranordnungen gepaart mit Open-Source-Software bietet Informationen über mechanisch-Empfindlichkeit, die sonst benötigt würde den Zugang zu Reinraumausstattung und vertiefte Kenntnisse der Bildanalyse und Softwareentwicklung. 1 veranschaulicht den Workflow des vorgestellten Verfahrens. Es b...

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Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Einfache und genaue Mechanotherapie Profilierung Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

easy-and-accurate-mechano-profiling-on-micropost-arrays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K Aufrufe.  Balgrist University Hospital. Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost. 

Serie: Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Forschung

Biotechnik

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated through myosin-actin interactions and play an important role in our physiology.  During development, they enable cells to move from one location to the next in order to form the early structures of tissue.  Traction forces help in the healing processes.  They are necessary for the proper closure of wounds or the migration and crawling of leukocytes through our body.  These same forces can be detrimental to our health in the case of cancer metastasis or vascular growth towards a tumor.  The most common method by which to study cells in vitro has been to use a glass or polystyrene dish.  However, the rigidity of the substrates makes it impossible to physically measure cell traction forces, and there are relatively few methods to study traction forces.  Our lab has developed a technique to overcome these limitations.  The method is based on a vertical array of flexible cantilevers, the stiffness and size scale of which are such that individual cells spread across many cantilevers and deflect them in the process.  The pillars we use are 3 &mu;m in diameter, 10 &mu;m tall, and are configured in a regular array with 9 &mu;m center-to-center spacing.  But these physical dimensions can be readily varied to accommodate a variety of studies.  We start with a silicon master, but the final posts are made out of silicone rubber called poly (dimethyl siloxane), or PDMS.  We can measure the deflections under a microscope and calculate the magnitude and direction of traction forces required to produce the observed deflections.  We call these substrates microfabricated post-array-detectors, or mPADs.  Here, we will show you how we fabricate and use the mPADs to assess modulations of cellular contractility.

Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

In this video, we demonstrate how to fabricate and utilize microfabricated post array detectors (mPADs) to assess modulations of cellular contractility.

Mikrofabrizierten Post-Array-Detektoren (mPADs): Ein Ansatz zur Mechanical Forces Isolate

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

Biologie

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Hohle Mikronadel-basierten Sensor für Multiplex Transdermale elektrochemische Nachweis

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

High Resolution Physical Characterization of Single Metallic Nanoparticles

Individual molecules can be detected and characterized by measuring the degree by which they reduce the ionic current flowing through a single nanometer-scale pore. The signal is characteristic of the molecule&#39;s physicochemical properties and its interactions with the pore. We demonstrate that the nanopore formed by the bacterial protein exotoxin Staphylococcus aureus alpha hemolysin (&#945;HL) can detect polyoxometalates (POMs, anionic metal oxygen clusters), at the single molecule limit. Moreover, multiple degradation products of 12-phosphotungstic acid POM (PTA, H3PW12O40) in solution are simultaneously measured. The single molecule sensitivity of the nanopore method allows for POMs to be characterized at significantly lower concentrations than required for nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. This technique could serve as a new tool for chemists to study the molecular properties of polyoxometalates or other metallic clusters, to better understand POM synthetic processes, and possibly improve their yield. Hypothetically, the location of a given atom, or the rotation of a fragment in the molecule, and the metal oxidation state could be investigated with this method. In addition, this new technique has the advantage of allowing the real-time monitoring of molecules in solution.&#160;

Here, we present a protocol to detect discrete metal oxygen clusters, polyoxometalates (POMs), at the single molecule limit using a biological nanopore-based electronic platform. The method provides a complementary approach to traditional analytical chemistry tools used in the study of these molecules.

Physikalische Charakterisierung einzelner metallischer Nanopartikel in hoher Auflösung

Individual molecules can be detected and characterized by measuring the degree by which they reduce the ionic current flowing through a single ...

Chemie

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polymeren Mikronadelanordnung Fabrication durch Photolithographie

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various spheroid production methods such as non-adhesive surfaces, spinner flasks, hanging drops, and microwells have been used in studies of cell-to-cell interaction, immune-activation, drug screening, stem cell differentiation, and organoid generation. Among these methods, microwells with a three-dimensional concave geometry have gained the attention of scientists and engineers, given their advantages of uniform-sized spheroid generation and the ease with which the responses of individual spheroids can be monitored. Even though cost-effective methods such as the use of flexible membranes and ice lithography have been proposed, these techniques incur serious drawbacks such as difficulty in controlling the pattern sizes, achievement of high aspect ratios, and production of larger areas of microwells. To overcome these problems, we propose a robust method for fabricating concave microwells without the need for complex high-cost facilities. This method utilizes a 30 x 30 through-hole array, several hundred micrometer-order steel beads, and magnetic force to fabricate 900 microwells in a 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. To demonstrate the applicability of our method to cell biological applications, we cultured adipose stem cells for 3 days and successfully produced spheroids using our microwell platform. In addition, we performed a magnetostatic simulation to investigate the mechanism, whereby magnetic force was used to trap the steel beads in the through-holes. We believe that the proposed microwell fabrication method could be applied to many spheroid-based cellular studies such as drug screening, tissue regeneration, stem cell differentiation, and cancer metastasis.

This manuscript introduces a robust method of fabricating concave microwells without the need for complex high-cost facilities. Using magnetic force, steel beads, and a through-hole array, several hundred microwells were formed in a 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrate.

Eine gekoppelte Wulst und Magnet-Array zum Formen von Mikroschälchen mit variabler konkave Geometrie

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

Parallele aktive Cantilever-Arrays im AFMS für Inspektionen mit hohem Durchsatz

Active Probe Atomic Force Microscopy with Quattro-Parallel Cantilever Arrays for High-Throughput Large-Scale Sample Inspection

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. However, due to their limited imaging throughput, AFMs have not been widely adopted for large-scale inspection purposes. Researchers have developed high-speed AFM systems to record dynamic process videos in chemical and biological reactions at tens of frames per second, at the cost of a small imaging area of up to several square micrometers. In contrast, inspecting large-scale nanofabricated structures, such as semiconductor wafers, requires nanoscale spatial resolution imaging of a static sample over hundreds of square centimeters with high productivity. Conventional AFMs use a single passive cantilever probe with an optical beam deflection system, which can only collect one pixel at a time during AFM imaging, resulting in low imaging throughput. This work utilizes an array of active cantilevers with embedded piezoresistive sensors and thermomechanical actuators, which allows simultaneous multi-cantilever operation in parallel operation for increased imaging throughput. When combined with large-range nano-positioners and proper control algorithms, each cantilever can be individually controlled to capture multiple AFM images. With data-driven post-processing algorithms, the images can be stitched together, and defect detection can be performed by comparing them to the desired geometry. This paper introduces principles of the custom AFM using the active cantilever arrays, followed by a discussion on practical experiment considerations for inspection applications. Selected example images of silicon calibration grating, highly-oriented pyrolytic graphite, and extreme ultraviolet lithography masks are captured using an array of four active cantilevers (&#34;Quattro&#34;) with a 125 &#181;m tip separation distance. With more engineering integration, this high-throughput, large-scale imaging tool can provide 3D metrological data for extreme ultraviolet (EUV) masks, chemical mechanical planarization (CMP) inspection, failure analysis, displays, thin-film step measurements, roughness measurement dies, and laser-engraved dry gas seal grooves.

Autor im Rampenlicht: Einführung in die Rasterkraftmikroskopie mit aktiven Sonden mit quattro-parallelen Cantilever-Arrays

Large-scale sample inspection with nanoscale resolution has a wide range of applications, especially for nanofabricated semiconductor wafers. Atomic force microscopes can be a great tool for this purpose, but are limited by their imaging speed. This work utilizes parallel active cantilever arrays in AFMs to enable high-throughput and large-scale inspections.

Rasterkraftmikroskopie mit aktiven Sonden mit quattroparallelen Cantilever-Arrays für die Inspektion von Großproben mit hohem Durchsatz

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. ...

Einfache und genaue Mechanotherapie Profilierung Micropost Arrays

Zusammenfassung

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Polymeren Mikronadelanordnung Fabrication durch Photolithographie

Eine gekoppelte Wulst und Magnet-Array zum Formen von Mikroschälchen mit variabler konkave Geometrie

Rasterkraftmikroskopie mit aktiven Sonden mit quattroparallelen Cantilever-Arrays für die Inspektion von Großproben mit hohem Durchsatz

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Rasterkraftmikroskopie mit aktiven Sonden mit quattroparallelen Cantilever-Arrays für die Inspektion von Großproben mit hohem Durchsatz