Diese Arbeit wurde von Muscular Dystrophy Association, NIH (NS062320) unterstützt.

1. Die subkutane Verabreichung von Muskarin Acetylcholin-Rezeptor (mAChR)-Antagonisten <ol><li> Bereiten Sie unter aseptischen Bedingungen die entsprechende Dosis von mAChR-Antagonist, (vgl. Tabelle), indem man das Medikament in steriler physiologischer Kochsalzlösung in 1,5 ml Reaktionsgefäß. Die folgenden Antagonisten wurden verwendet: Atropin, Methoctramin, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7. </li><li> Draw 50 ul Lösung in a1cc Insulinspritze und eine separate Spritze für jede Maus. Auch bereiten Spritzen mit physiologischer Kochsalzlösung nur für jede Maus in der Kontrollgruppe. Keep Spritzen auf Eis, bis die Injektion bereit. </li><li> Anesthetize Mäuse mit Ketamin-Xylazin-Cocktail (120 mg / kg Ketamin, 8 mg / kg Xylazin) Check für eine angemessene Narkosetiefe durch die Beobachtung Mangel an Reaktion auf Prise Zeh. </li><li> Nach ordnungsgemäßer Sedierung, rasieren Behaarung des rostralen Bereich des Kopfes bis zum kaudalen Bereich des Halses, wischen restlichen Haare weg mit 70% Ethanol. </li><li> Bewegen Sie die Maus unter Stereomikroskop, und legen Nadel parallel zur LAL Muskel während Hochziehen leicht auf die Nadel der Spritze (Abb. 1A, B). Dies gewährleistet, dass die Nadel in darüber liegenden Bindegewebes eingesetzt wird und nicht direkt beschädigt LAL Muskel selbst. Führen Sie die Nadel so, dass die Spitze deckt den kaudalen Bereich des LAL Muskel. </li><li> Ganz langsam beginnen, Lösung über das Recht LAL Muskel injizieren, während Zurückziehen der Spritze, die insgesamt Injektion sollte etwa 1 Minute. Wenn injiziert richtig, sollte die Lösung bilden eine &quot;Kuppel&quot;, die etwa 1 cm im Durchmesser ist, in die darüber liegende Haut, die für mindestens eine Stunde bleiben. Ein gleichmäßig eingespritzt Lösung deckt den gesamten rostralen und kaudalen Regionen der rechten LAL Muskel. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang alle 12 Stunden für 1 bis 7 Tagen. Für andere Studien1 benutzten wir das gleiche Protokoll zu injizieren Wachstumsfaktoren alle 12 Stunden für bis zu 21 Tage. Keine anormalen Reaktionen wurden von Mäusen mit Narkose 2x pro Tag für bis zu 21 Tage verabreicht wird. </li></ol> 2. Dissection von LAL Muskeln <ol><li> Euthanize Mäuse mit einer Überdosis Natrium-Pentobarbital (390 mg / kg). Der Tod ist durch die Beurteilung Mangel an Herzschlag nach Thorakotomie durchgeführt wird gewährleistet. </li><li> Pin Sie die Maustaste in eine Sektion Gericht, Dorsalseite mit Pin 1 in jeder Pfote und 1 Stift durch die Nase. </li><li> Machen Sie den ersten Schnitt durch die Haut nur mit kleinen Feder Schere zu schneiden entlang der linken LAL aus der Region nur proximal an das Ohr, um die Region rund um das linke Schulterblatt. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Haut in dieser Region, aber vermeiden Schneiden zu nahe an das rechte Ohr, da dies eine der Ansatzstellen für das Recht LAL Muskel. </li><li> Suchen Sie den mittig platzierten Fettgewebe Streifen Lipid entlang der Mittellinie auf der äußeren Oberfläche des Kopfes, wo rechts und links LAL Muskeln zu erfüllen. Mit kleinen Feder Schere, schnitt 1cm auf der rechten Seite das Fettgewebe (in Richtung des linken Ohres) vom proximalen Rand der linken LAL Muskel bis zum Erreichen der Schulter (Abb. 1C). </li><li> Sobald der Schnitt gemacht, Ziehen Sie die richtigen Muskeln LAL mit kleinen Zange auf die Bauchseite des Muskels freizulegen. Trim das Bindegewebe und Faszien während vorsichtiges Ziehen an der rechten LAL Muskel mit einer Pinzette (Abb. 1C). </li><li> Cut um den kaudalen Ende des rechten LAL an der Basis des Ohres. Weiter Schnitt, Bewegung in Richtung des rostralen Ende des rechten Ohres, halten das Recht LAL umgedreht (Abb. 1C).. Es ist besser, mehr Gewebe bei diesem Schritt als Gefahr der Beschädigung der LAL selbst gehören. Wenn der Muskel beginnt zu trocknen, Pipette 1X PBS in den Muskel. </li><li> Legen Sie seziert Recht LAL in 30mm Kultur Sylgard Schale mit 1X PBS, Rücken nach oben. Pin unten vier Ecken des Muskels mit kleinen Insekten Pins. </li><li> Mit Hilfe von kleinen Zangen und Scheren Frühjahr, sauber Bindegewebe aus dorsalen und ventralen Flächen der rechten LAL Muskel. Schalten Muskel wieder und wieder-pin, um sauber aus Ventralfläche. 3.2 Muskeln können in der gleichen 30mm Schale gelegt werden. </li></ol> 3. Triple-Immunfärbung von LAL NMJs: Tag 1 <ol><li> Vor Beginn der Immunfärbung, bereiten alle notwendigen Reagenzien. 1X PBS, 2% Rinderserumalbumin BSA) / PBS, 0,1 M Glycin in 2% BSA / PBS, 0,2% Triton X100 in 2% BSA / PBS und 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1X PBS benötigt werden. Pre-cool Methanol in -20 ° C Gefrierschrank. </li><li> Lassen Sie LAL Muskeln in der Schüssel Dorsalseite während dieses Prozesses merken. Discard 1X PBS-Lösung und fügen genug 4% (PFA), um den Muskel zu decken. Legen Gericht auf Schüttler gesetzt bei Drehzahl 2 oder 3 für 20 Minuten. Soweit nicht anders vermerkt, sollte das Gericht auf einem Schüttler für die folgenden Schritte gesetzt werden. </li><li> Discard 4% PFA und waschen den Muskel mit 1X PBS 3 mal, 10 &#39;jeweils. </li><li> Discard letzten 1X PBS waschen und fügen 0,1 M Glycin in 2% BSA / PBS-Lösung für 30 &#39;. </li><li> Discard 0,1 M Glycin-Lösung eined add 1X PBS mit Rhodamin-konjugiertem α-Bungarotoxin bei einer Konzentration von 1:200 für 15 &#39;. </li><li> Discard α-Bungarotoxin Lösung und waschen Muskel in 1X PBS, 3 mal 10 &#39;jeweils. </li><li> Permeabilisieren Gewebe, indem vorgekühlt Methanol und die Schale in der -20 ° C Gefrierschrank für genau 5 Minuten, kein Schütteln erforderlich. </li><li> Entfernen Methanol und 3 x waschen 10 &#39;jeweils mit 1X PBS. Discard letzten Wasch-und Block-Gewebe mit 0,2% Triton X-100 in 2% BSA / PBS für 1 Stunde. Das Waschen und Blockierung Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt. </li><li> Inkubieren Sie die Muskeln über Nacht, Zittern, bei 4 ° C in einer Mischung aus Primär-Antikörper in Blocking-Lösung (vgl. Tabelle) verdünnt. </li></ol> 4. Triple-Immunfärbung von LAL NMJs: Tag 2 <ol><li> Wash Muskeln in 1X PBS 3 mal, 10 &#39;jeweils bei Raumtemperatur. </li><li> Add-Cocktail Sekundärantikörper in Blocking-Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur (vgl. Tabelle). Die Muskeln müssen vor Licht von diesem Schritt weiter geschützt werden Foto-Bleiche von Alexa-Fluor 647-Fluoreszenz zu verhindern. </li><li> Wash Muskeln in 1X PBS 3 mal, 10 &#39;jeweils. </li><li> Reinigen Sie verbleibende Bindegewebe in 1X PBS, schneiden Sie die seitlichen Grenzen der LAL Muskeln und Montage auf Folien Dorsalseite auf, die Verwendung von Glas Deckgläschen und Montage Medien. Verwenden Sie klare Nagellack Deckglas fixieren. </li><li> Schützen Sie Folien aus Licht und bei -20 ° C bis zur Analyse bereit. </li></ol> 5. Konfokale Bildgebung von LAL NMJs <ol><li> Hochauflösende konfokale Bilder sind mit einem Leica Plan Apo 63X Öl-Objektiv (1.4NA) auf einem Leica TCS 4D konfokalen Mikroskop erreicht. </li><li> Fluorescein und Alexa 647-Signale wurden gleichzeitig mit Laserlinien 488 nm (Argon, 488 nm, 20 mW) und 633 nm (HeNe, 633 nm, 10 mW) gescannt bzw.. Sequenziell ist Rhodamine Signal wird dann mit der Laserlinie 561 nm (DPSS, 561, 20 mW) gescannt. Optische Schnitte wurden mit 0,3 &amp;mgr; Abständen gesammelt, und die Anzahl der Bilder in der z-Ebene von 60 bis 80 variiert. Die Lochkamera ist Airy 1 (107,97 um) angepasst. Das Bildformat 1024 x 1024 (X, Y), mit einem Zoom-Faktor von 1, bei 400Hz Geschwindigkeit führt zu einer Bildgröße von 234,32 um x 234,32 um und Pixelgröße von 229,05 nm x 229,05 nm. </li><li> Leica TCS-NT Software zur Erfassung wird dann verwendet, um z-Serie Bilder in maximaler Intensität Projektionen zu rekonstruieren. </li><li> Multipanel Bilder sind für Helligkeit und Kontrast mit Hilfe von Adobe Photoshop angepasst. </li><li> Für eine typische LAL Muskel, sollte man in der Lage sein ca. 75-100 en face NMJs analysieren. Synaptic Stabilität wird durch Merkmale wie räumliche Ausrichtung der prä-, peri-und postsynaptischen Elementen (zB Nerven, Schwann-Zellen und Muskeln), und Messungen der synaptischen Bereich (dh Synapse Größe) bestimmt. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Bei den erwachsenen Säugetieren NMJ, erarbeitet ein einziger Motor Axon feinen Verästelungen, die sehr differenzierte Lauben einer Nervenendigung (Abb. 2; Green) Form auf einer einzigen Muskelfaser, die genau auf postsynaptische Cluster von Nikotinsäure AChRs (Abb. 2; Red) apposed . Perisynaptically, Terminal Schwann-Zellen eng decken alle Zweige der präsynaptischen Nervenendigungen (Abb. 2, blau). Die strukturelle und funktionelle Integrität dieses dreigliedrige Organisation ist stark gestört durch die tägliche Anwendung von Subtyp-spezifischen mAChR Inhibitoren. In dem hier vorgestellten Beispiel (Abb. 3), beschwört 4-DAMP, ein mAChR-Antagonist mit hoher Affinität für M1, M3, M4 und M5 mAChR-Subtypen, selektive Eliminierung von Nervenendigungen aus zahlreichen NMJs ganzen Muskel Oberfläche (Abb. 3B, C). Darüber hinaus sind Terminal Schwann-Zellen ungewöhnlich ruhig 8 als von hellen S100 Kennzeichnung ohne Prozess-Erweiterung (Abb. 3B &quot;, 3C&quot;) belegt. Postsynaptisch sind Muskelfasern normal und es gibt keinen Verlust von nAChRs (Abb. 3B &#39;, 3C). <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Anatomische Lage und Organisation des LAL Muskel. Lage von rostral (rLAL), caudal (ClaI) und der LAL Nerv (LALn) und entsprechende Endplatte Bands gezeigt werden (A, Einschub). Die Lage und Orientierung der Nadel in Bezug auf die LAL Muskel ist für das Injektionsverfahren (B) dargestellt. Incision Punkte sind für die Dissektion Verfahren (C) gezeigt. <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Tripartite Organisation der NMJ. High-Vergrößerung konfokalen Ansichten einer Maus NMJ. Ein einzelnes Axon erarbeitet feinen Endäste (A), dicht von Terminal Schwann-Zellen und deren Prozesse (A &#39;, Sternchen zeigen Sie auf Terminaldienste Schwann Zellkörper) abgedeckt. Postsynaptisch in einer Muskelfaser, ist eine Ansammlung von Nikotinsäure AChRs genau auf die Zweige des Nervus Terminals apposedSignale und Terminal-Schwann-Zellen. <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. LAL Muskeln mit 4-DAMP, ein mAChR-Antagonisten behandelt werden. Low-und High-Vergrößerung konfokalen Blick LAL Muskeln mit Fahrzeug oder 4-DAMP behandelt. Im Gegensatz zu den Vehikel-behandelten Muskeln (A-A&#39;&#39;&#39;), zahlreichen NMJs in der 4-DAMP-behandelte Muskel fehlt Nervenendigungen (B-B&#39;&#39;&#39;, C-C&#39;&#39;&#39;). Ein boxed Bereich in Abbildung 2B ist in Abbildung 2C gezoomt.

<ol>
	<li>Wright, M. C., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+is+not+required+for+terminal+sprouting+and+compensatory+reinnervation+of+neuromuscular+synapses:+re-evaluation+of+CNTF+null+mice.">Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice.</a> Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).</li><li>Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+motor+neuron+sprouting+in+vivo+by+ciliary+neurotrophic+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor.">Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).</li><li>Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+neuronal+determinants+locally+regulate+extrasynaptic+and+synaptic+growth+at+the+adult+neuromuscular+junction.">Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).</li><li>Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+factors+regulate+AChR+subunit+mRNAs+at+rat+neuromuscular+synapses.">Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses.</a> J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).</li><li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse:+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins.">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).</li><li>Lanuza, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-+and+postsynaptic+maturation+of+the+neuromuscular+junction+during+neonatal+synapse+elimination+depends+on+protein+kinase.">Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase.</a> C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).</li><li>Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+effects+of+beta-amyloid25-35+peptide+aggregates+on+transmitter+release+in+neuromuscular+synapses.">Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).</li><li>Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+patterns+of+motor+nerve+terminal+sprouting+induced+by+ciliary+neurotrophic+factor+vs.+botulinum+toxin.">Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin.</a> J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).</li><li>Wright, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth,+but+not+compensatory+plasticity,+of+neuromuscular+synapses.">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li><li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+inhibits+chloride+channels+in+mature+mammalian+skeletal+muscle+by+activating+P2Y1+receptors.">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors.</a> J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).</li><li>Dorje, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+binding+profiles+of+five+cloned+human+muscarinic+receptor+subtypes.">Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).</li><li>Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Union+of+Pharmacology.+XVII.+Classification+of+muscarinic+acetylcholine+receptors.">International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors.</a> Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die Untersuchung von bisher nicht Rollen von Subtyp-spezifischen mAChR Signalisierung in die Stabilität und die Wartung von Säugetieren NMJs. Diese Methode wird auch nützlich sein, um die Auswirkungen von neurotrophen Faktoren und pharmakologische Wirkstoffe zu testen. Zum Beispiel fand unser Labor, dass Ciliary neurotrophen Faktor (CNTF) sprießen aus nahezu allen LAL Nervenendigungen in erwachsenen Mäusen hervorgerufen <a>1</a> . Dieses Ergebnis mit früheren Studien von C...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Hospira </td><td> NDC0409-2051-05 </td><td> Dosis: 120mg/kg </td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Lloyd Laboratories </td><td> LA33806 </td><td> Dosis: 8mg/kg </td></tr><tr><td> Atropin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0132 </td><td> (&gt; 98% Reinheit); Dosis: 0.2mg/kg - 20mg/kg </td></tr><tr><td> Atropin </td><td> Voigt Global Distribution </td><td> AT105 </td><td> Pharmazeutischer Qualität </td></tr><tr><td> Methoctramin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M105 </td><td> Dosis: 100 - 400M </td></tr><tr><td> 4-DAMP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D142 </td><td> Dosis: 2.5mg/kg </td></tr><tr><td> AFDX-116 </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 1105 </td><td> 250M </td></tr><tr><td> AFDX-384 </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 1345 </td><td> 50M - 500M </td></tr><tr><td> MT 7 </td><td> Peptide Internationalen </td><td> PMT-4340-s </td><td> 0,1 - 1M </td></tr><tr><td> 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Fischer </td><td> T353-500 </td><td> Machen Sie 10% Lösung zunächst durch Auflösen 10g/100mL entionisiertes destilliertes Wasser; machen 4% mit 1X PBS, pH-Wert einstellen auf 7,4 </td></tr><tr><td> Sodium pentobarbitol </td><td> Virbac Tiergesundheit </td><td> NDC-051311-050-01 </td><td> Dosis: 390mg/kg </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> Part # 184 </td><td> Befolgen Sie die Anweisungen, die mit Kit kommen, können mehrere große Kulturschale verwenden (30mm, 60mm, 100mm) je nach Bedarf </td></tr><tr><td> 0,1 M Glycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-7126 </td><td> Add 0.185g bis 25 mL von 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> 2% Rinderserumalbumin (2% BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-100g </td><td> Lösen 2g BSA in 100 ml 1X PBS </td></tr><tr><td> 0,2% Triton X100 in 2% BSA / PBS (Blocking Buffer) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-100 mL </td><td> Lösen Sie 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> α-Bungarotoxin </td><td> Invitrogen </td><td> T1175 </td><td> Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:200 </td></tr><tr><td> SMI-312 </td><td> Sternberger Monoklonale Antikörper </td><td> SMI312 </td><td> Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:1000 </td></tr><tr><td> SV2 </td><td> Developmental Studies Hybridoma der Bank </td><td> SV2-Überstand </td><td> Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:10 </td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td> Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:400 </td></tr><tr><td> FITC-Ziege-anti-Maus-IgG1 </td><td> Roche </td><td> 03117731001 </td><td> Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:200, aber wenn Hintergrund ist hoch, versuchen 1:400 </td></tr><tr><td> Alexa-Fluor 647 konjugierten Ziege anti-Kaninchen </td><td> Invitrogen </td><td> A21244 </td><td> Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:200 </td></tr><tr><td> Vectashield fluoreszierenden Eindeckmittel </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-1000 </td><td> Dies ist keine Hard-Set-Medium, müssen Sie das Deckglas mit klarem Nagellack zu sichern. </td></tr><tr><td> Kleine Frühling Schere </td><td> Feine Science Tools </td><td> 15002-08 </td><td></td></tr><tr><td> Dissektionszangen </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr></tbody></table>

subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice

Hinterbein Muskeln von Nagetieren, wie gastrocnemius und tibialis anterior, werden häufig für in vivo pharmakologische Studien der Signale für die Bildung und Pflege von Säugetieren NMJs verwendet. Allerdings ist eine medikamentöse Eindringen in diese Muskeln nach subkutaner oder intramuskulärer Verabreichung häufig unvollständig oder ungleichmäßig und viele NMJs können, bleiben unberührt. Obwohl die systemische Verabreichung von Geräten wie Mini-Pumpen der raum-zeitlichen Wirkungen verbessern kann, kann die invasive Natur dieses Ansatzes Ursache zu verwechseln entzündliche Reaktionen und / oder direkte Schädigung der Muskulatur. Darüber hinaus ist eine vollständige Analyse der NMJs in einem Hinterbein Muskeln schwierig, weil es zeitaufwendig serielle Schnitte und umfangreiche Immunfärbung erfordert. Die Maus LAL ist ein dünnes, flaches Blatt Muskel oberflächlich auf dem Rücken des Halses befindet. Es ist eine schnell zuckenden, dass die Funktionen auf der Ohrmuschel zu bewegen. Es enthält rostralen und kaudalen Abschnitte, die von der Mittellinie des Schädels stammen und erstrecken sich seitlich auf die knorpeligen Teil jeder Ohrmuschel. Der Muskel wird durch einen Zweig des Nervus facialis, die kaudal Projekte beim Verlassen des Foramen stylomastoideum geliefert. Wir und andere haben herausgefunden, LAL, um eine bequeme Zubereitung, die Vorteile für die Untersuchung von kurz-und langfristigen In-vivo-Wirkungen von Drogen auf NMJs und Muskeln bietet. Erstens erleichtert ihre oberflächliche Lage mehrere lokale Applikationen von Medikamenten unter leichter Betäubung. Zweitens ermöglicht seine Dünnheit (2-3 Schichten von Muskelfasern) Visualisierung und Analyse von fast allen NMJs innerhalb des Muskels. Drittens erlaubt die einfache seziert er mit seinen Nerven intakt zusammen mit dem Muster seiner Innervation ergänzende elektrophysiologische Untersuchungen in vitro 9,5. Last, und vielleicht am wichtigsten, eine kleine applizierte Volumen (~ 50 ul) leicht deckt den gesamten Muskel-Oberfläche sorgt für eine gleichmäßige und bei längerer Exposition aller NMJs auf das Medikament und eliminiert die Notwendigkeit für einen systemischen Ansatz 1,8.

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Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Wir beschreiben Verfahren für die wiederholte Gabe von Inhibitoren der Muskarin-Signalisierung an die levator auris longus (LAL) Muskel junger erwachsener Mäuse und für die anschließende Immunfärbung der neuromuskulären Synapsen (NMJs) in wholemounts. Der LAL-Muskel hat einzigartige Vorteile für die Entdeckung<em&gt; In vivo</em&gt; Pharmakologische Wirkungen auf NMJs.

Subkutane Verabreichung von Muscarinic Antagonisten und Triple-Immunfärbung der Levator Auris longus in Mäuse

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo  pharmacological studies of the signals ...

subcutaneous-administration-muscarinic-antagonists-triple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Aufrufe.  Arcadia University. Wir beschreiben Verfahren für die wiederholte Gabe von Inhibitoren der Muskarin-Signalisierung an die levator auris longus (LAL) Muskel junger erwachsener Mäuse und für die anschließende Immunfärbung der neuromuskulären Synapsen (NMJs) in wholemounts. Der LAL-Muskel hat einzigartige Vorteile für die Entdeckung In vivo Pharmakologische Wirkungen auf NMJs.

Serie: Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Assessment of Ultrasonic Vocalizations During Drug Self-administration in Rats

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and relapse. Various types of behavioral activity are commonly utilized as measures of drug motivation in animals. However, a crucial component of drug abuse relapse in abstinent cocaine users is "drug craving", which is difficult to model in animals, as it often occurs in the absence of overt behaviors. Yet, it is possible that a class of ultrasonic vocalizations (USVs) in rats may be a useful marker for affective responses to drug administration, drug anticipation and even drug craving. Rats vocalize in ultrasonic frequencies that serve as a communicatory function and express subjective emotional states. Several studies have shown that different call frequency ranges are associated with negative and positive emotional states. For instance, high frequency calls ("50-kHz") are associated with positive affect, whereas low frequency calls ("22-kHz") represent a negative emotional state. This article describes a procedure to assess rat USVs associated with daily cocaine self-administration. For this procedure, we utilized standard single-lever operant chambers housed within sound-attenuating boxes for cocaine self-administration sessions and utilized ultrasonic microphones, multi-channel recording hardware and specialized software programs to detect and analyze USVs. USVs measurements reflect emotionality of rats before, during and after drug availability and can be correlated with commonly assessed drug self-administration behavioral data such lever responses, inter-response intervals and locomotor activity. Since USVs can be assessed during intervals prior to drug availability (e.g., anticipatory USVs) and during drug extinction trials, changes in affect associated with drug anticipation and drug abstinence can also be determined. In addition, determining USV changes over the course of short- and long-term drug exposure can provide a more detailed interpretation of drug exposure effects on affective functioning.

Drug self-administration and ultrasonic vocalizations (USV) are used as behavioral assessments in animal research, but rarely in combination. The purpose of this article is to describe the advantages of recording USVs during drug self-administration procedures to assess affective responses to drug experience.

Beurteilung der Ultraschall-Vocalizations Während Drug Selbstverwaltung in Ratten

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, the olfactory bulb (OB), the dorsal motor nucleus of the vagus (DMV)3, the intermediolateral nucleus of the spinal cord 4 and the substantia nigra, providing the basis for the neuropathological staging of the disease4,5. The ENS and the OB are the most exposed nervous structures and the first ones to be affected. Interestingly, PD has been related to pesticide exposure6-8. Here we show in detail two methods used in our previous study 9. In order to analyze the effects of rotenone acting locally on the ENS, we administered rotenone using a gavage to one-year old C57/BL6 mice. Rotenone is a widely used pesticide that strongly inhibits mitochondrial Complex I 10. It is highly lipophylic and poorly absorbed in the gastrointestinal tract 11. Our results showed that the administration of 5 mg/kg of rotenone did not inhibit mitochondrial Complex I activity in the muscle or the brain. Thus, suggesting that using our administration method rotenone did not cross the hepatoportal system and was acting solely on the ENS. Here we show a method to administer pesticides using a gavage and the image analysis protocol used to analyze the effects of the pesticide in alpha-synuclein accumulation in the ENS. The first part shows a method that allows intragastric administration of pesticides (rotenone) at a desired precise concentration. The second method shows a semi-automatic image analysis protocol to analyze alpha-synuclein accumulation in the ENS using an image analysis software.

Parkinson's disease has been related to the exposure to pesticides. Here we show a method to deliver pesticides using a gastric tube at the desired concentration and a method to analyze their effect in alpha-synuclein accumulation in the enteric nervous system.

Die orale Verabreichung von Rotenon mit einem Gavage und Bildanalyse von Alpha-Synuclein Einschlüsse in den enterischen Nervensystem

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences. For instance, addiction to nicotine via tobacco smoking is a leading cause of premature death worldwide (World Health Organization) and is likely caused by an alteration of ion channel distribution in the brain1. Chronic nicotine exposure in both rodents and humans results in increased numbers of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in brain tissue1-3. Similarly, alterations in the glutamatergic GluN1 or GluA1 channels have been implicated in triggering sensitization to other addictive drugs such as cocaine, amphetamines and opiates4-6.

Consequently, the ability to map and quantify distribution and expression patterns of specific ion channels is critically important to understanding the mechanisms of addiction. The study of brain region-specific effects of individual drugs was advanced by the advent of techniques such as radioactive ligands. However, the low spatial resolution of radioactive ligand binding prevents the ability to quantify ligand-gated ion channels in specific subtypes of neurons. 

Genetically encoded fluorescent reporters, such as green fluorescent protein (GFP) and its many color variants, have revolutionized the field of biology7.By genetically tagging a fluorescent reporter to an endogenous protein one can visualize proteins in vivo7-10. One advantage of fluorescently tagging proteins with a probe is the elimination of antibody use, which have issues of nonspecificity and accessibility to the target protein. We have used this strategy to fluorescently label nAChRs, which enabled the study of receptor assembly using F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) in transfected cultured cells11.More recently, we have used the knock-in approach to engineer mice with yellow fluorescent protein tagged &alpha;4 nAChR subunits (&alpha;4YFP), enabling precise quantification of the receptor ex vivo at submicrometer resolution in CNS neurons via spectral confocal microscopy12. The targeted fluorescent knock-in mutation is incorporated in the endogenous locus and under control of its native promoter, producing normal levels of expression and regulation of the receptor when compared to untagged receptors in wildtype mice. This knock-in approach can be extended to fluorescently tag other ion channels and offers a powerful approach of visualizing and quantifying receptors in the CNS.

In this paper we describe a methodology to quantify changes in nAChR expression in specific CNS neurons after exposure to chronic nicotine. Our methods include mini-osmotic pump implantation, intracardiac perfusion fixation, imaging and analysis of fluorescently tagged nicotinic receptor subunits from &alpha;4YFP knock-in mice (Fig. 1). We have optimized the fixation technique to minimize autofluorescence from fixed brain tissue.We describe in detail our imaging methodology using a spectral confocal microscope in conjunction with a linear spectral unmixing algorithm to subtract autofluoresent signal in order to accurately obtain &alpha;4YFP fluorescence signal. Finally, we show results of chronic nicotine-induced upregulation of &alpha;4YFP receptors in the medial perforant path of the hippocampus.

We have developed a novel technique of quantifying nicotinic acetylcholine receptor changes within subcellular regions of specific subtypes of CNS neurons to better understand the mechanisms of nicotine addiction by using a combination of approaches including fluorescent protein tagging of the receptor using the knock-in approach and spectral confocal imaging.

Spectral konfokale Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Nikotinrezeptoren in Knock-in Mäusen mit chronischer Gabe von Nikotin

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol. However, ethanol is typically self-administered orally, rather than intravenously like many other drugs of abuse. The pharmacokinetics of orally administered drugs are more complex than intravenously administered drugs. Because understanding the relationship between the pharmacological and behavioral effects of ethanol requires knowledge of the time course of ethanol reaching the brain during and after drinking, we use in vivo microdialysis and gas chromatography with flame ionization detection to monitor brain dialysate ethanol concentrations over time. 
Combined microdialysis-behavioral experiments involve the use of several techniques. In this article, stereotaxic surgery, behavioral training and microdialysis, which can be adapted to test a multitude of self-administration and neurochemical centered hypotheses, are included only to illustrate how they relate to the subsequent phases of sample collection and dialysate ethanol analysis. Dialysate ethanol concentration analysis via gas chromatography with flame-ionization detection, which is specific to ethanol studies, is described in detail. Data produced by these methods reveal the pattern of ethanol reaching the brain during the self-administration procedure, and when paired with neurochemical analysis of the same dialysate samples, allows conclusions to be made regarding the pharmacological and behavioral effects of ethanol.

A method to determine the time course of ethanol concentration in the brains of rats during operant ethanol self-administration is described. Gas chromatography with flame ionization detection is used to quantify ethanol in the dialysate samples, because it has the sensitivity required for the small volumes that are generated.

Microdialysis Ethanol während operante Ethanol Selbstverwaltung und Ethanol Bestimmung durch Gaschromatographie

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol.  ...

Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord injury (SCI), and can form functional relays to re-connect spinal cord segments above and below a lesion. Previous studies grafting neural stem cells have been limited by incomplete graft survival within the spinal cord lesion cavity. Further, tracking of graft cell survival, differentiation, and process extension had not been optimized. Finally, in previous studies, cultured rat NSCs were typically reported to differentiate into glia when grafted to the injured spinal cord, rather than neurons, unless fate was driven to a specific cell type. To address these issues, we developed new methods to improve the survival, integration and differentiation of NSCs to sites of even severe SCI. NSCs were freshly isolated from embryonic day 14 spinal cord (E14) from a stable transgenic Fischer 344 rat line expressing green fluorescent protein (GFP) and were embedded into a fibrin matrix containing growth factors; this formulation aimed to retain grafted cells in the lesion cavity and support cell survival. NSCs in the fibrin/growth factor cocktail were implanted two weeks after thoracic level-3 (T3) complete spinal cord transections, thereby avoiding peak periods of inflammation. Resulting grafts completely filled the lesion cavity and differentiated into both neurons, which extended axons into the host spinal cord over remarkably long distances, and glia. Grafts of cultured human NSCs expressing GFP resulted in similar findings. Thus, methods are defined for improving neural stem cell grafting, survival and analysis of in vivo findings.

Fibrin matrices containing growth factors were used to retain grafted neural stem cells into sites of complete spinal cord transection. Grafted cells completely filled the lesion cavity and differentiated into multiple neural cell types, including neurons that extended axons into host spinal cord over long distances.

Förderung von Überleben und die Differenzierung neuraler Stammzellen mit Fibrin und Growth Factor Cocktails nach schweren Rückenmarksverletzungen

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord ...

Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons responsible for proprioception as they are detecting joint position and movement, and muscle tension. Electrical activity from crustacean proprioceptors and tension receptors is recorded by basic neurophysiological instrumentation, and a transducer is used to simultaneously measure force that is generated by stimulating a motor nerve. In addition, we demonstrate how to stain the neurons for a quick assessment of their anatomical arrangement or for permanent fixation. Staining reveals anatomical organization that is representative of chordotonal organs in most crustaceans. Comparing the tension nerve responses to the proprioceptive responses is an effective teaching tool in determining how these sensory neurons are defined functionally and how the anatomy is correlated to the function. Three staining techniques are presented allowing researchers and instructors to choose a method that is ideal for their laboratory.

Physiological and anatomical techniques are demonstrated to address function and structure for joint proprioceptors and muscle tension receptors in crustacean walking limbs.

Propriozeption und Spannungsrezeptoren in Crab Gliedmassen: Schülerlabor Übungen

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons ...

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control neuroplastic processes and correct abnormal function, or even shift functions from damaged tissue to physiologically healthy brain regions, hold the potential to dramatically improve overall health. Of the current neuroplastic interventions in development, neurofeedback training (NFT) from functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) has the advantages of being completely non-invasive, non-pharmacologic, and spatially localized to target brain regions, as well as having no known side effects. Furthermore, NFT techniques, initially developed using fMRI, can often be translated to exercises that can be performed outside of the scanner without the aid of medical professionals or sophisticated medical equipment. In fMRI NFT, the fMRI signal is measured from specific regions of the brain, processed, and presented to the participant in real-time. Through training, self-directed mental processing techniques, that regulate this signal and its underlying neurophysiologic correlates, are developed. FMRI NFT has been used to train volitional control over a wide range of brain regions with implications for several different cognitive, behavioral, and motor systems. Additionally, fMRI NFT has shown promise in a broad range of applications such as the treatment of neurologic disorders and the augmentation of baseline human performance. In this article, we present an fMRI NFT protocol developed at our institution for modulation of both healthy and abnormal brain function, as well as examples of using the method to target both cognitive and auditory regions of the brain.

The ability to induce and/or control neural plasticity may be critical in future treatments for neurologic disorders and the recovery from brain injury. In this paper, we present a protocol on the use of neurofeedback training with functional magnetic resonance imaging to modulate human brain function.

Ein Protokoll für die Verwaltung von Real-Time-fMRT Neurofeedback Training

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...

Recording Brain Electromagnetic Activity During the Administration of the Gaseous Anesthetic Agents Xenon and Nitrous Oxide in Healthy Volunteers

Anesthesia arguably provides one of the only systematic ways to study the neural correlates of global consciousness/unconsciousness. However to date most neuroimaging or neurophysiological investigations in humans have been confined to the study of &#947;-Amino-Butyric-Acid-(GABA)-receptor-agonist-based anesthetics, while the effects of dissociative N-Methyl-D-Aspartate-(NMDA)-receptor-antagonist-based anesthetics ketamine, nitrous oxide (N2O) and xenon (Xe) are largely unknown. This paper describes the methods underlying the simultaneous recording of magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) from healthy males during inhalation of the gaseous anesthetic agents N2O and Xe. Combining MEG and EEG data enables the assessment of electromagnetic brain activity during anesthesia at high temporal, and moderate spatial, resolution. Here we describe a detailed protocol, refined over multiple recording sessions, that includes subject recruitment, anesthesia equipment setup in the MEG scanner room, data collection and basic data analysis. In this protocol each participant is exposed to varying levels of Xe and N2O in a repeated measures cross-over design. Following relevant baseline recordings participants are exposed to step-wise increasing inspired concentrations of Xe and N2O of 8, 16, 24 and 42%, and 16, 32 and 47% respectively, during which their level of responsiveness is tracked with an auditory continuous performance task (aCPT). Results are presented for a number of recordings to highlight the sensor-level properties of the raw data, the spectral topography, the minimization of head movements, and the unequivocal level dependent effects on the auditory evoked responses. This paradigm describes a general approach to the recording of electromagnetic signals associated with the action of different kinds of gaseous anesthetics, which can be readily adapted to be used with volatile and intravenous anesthetic agents. It is expected that the method outlined can contribute to the understanding of the macro-scale mechanisms of anesthesia by enabling methodological extensions involving source space imaging and functional network analysis.

Simultaneous magnetoencephalography and electroencephalography provides a useful tool to search for common and distinct macro-scale mechanisms of reductions in consciousness induced by different anesthetics. This paper illustrates the empirical methods underlying the recording of such data from healthy humans during N-Methyl-D-Aspartate-(NMDA)-receptor-antagonist-based anesthesia during inhalation of nitrous oxide and xenon.

Aufnahme elektromagnetische Aktivität des Gehirns während der Verabreichung von Lachgas bei gesunden Probanden und gasförmiger Anästhetika Xenon

Anesthesia arguably provides one of the only systematic ways to study the neural correlates of global consciousness/unconsciousness. However to date most ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ex vivo preparation of the levator auris longus (LAL) is used because it is a thin muscle that provides easy visualization of the neuromuscular junction for microelectrode impalement at the motor endplate. This method allows for the recording of spontaneous miniature endplate potentials and currents (mEPPs and mEPCs), nerve-evoked endplate potentials and currents (EPPs and EPCs), as well as the membrane properties of the motor endplate. Results obtained from this method include the quantal content (QC), number of vesicle release sites (n), probability of vesicle release (prel), synaptic facilitation and depression, as well as the muscle membrane time constant (&#964;m) and input resistance. Application of this technique to mouse models of human disease can highlight key pathologies in disease states and help identify novel treatment strategies. By fully voltage-clamping a single synapse, this method provides one of the most detailed analyses of synaptic transmission currently available.

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

The protocol described in this paper uses the mouse levator auris longus (LAL) muscle to record spontaneous and nerve-evoked postsynaptic potentials (current-clamp) and currents (voltage-clamp) at the neuromuscular junction. Use of this technique can provide key insights into mechanisms of synaptic transmission under normal and disease conditions.

Levator Auris Longus Prüfungsvorbereitung der Säugetier-neuromuskulären Übertragung unter Spannung Klemme Bedingungen

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

Der Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in neuralen Stammzellen und Gehirnen von Mäusen

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...