Diese praktische und reproduzierbare Methode kann verwendet werden, um die Endothelleukozyten-Wechselwirkungen zu visualisieren, die zu einer Leukozytenrekrutierung innerhalb einer intakten Maus führen. Diese Technik stellt auch ein leistungsfähiges Werkzeug zur Überwachung physiologischer und pathophysiologischer Prozesse innerhalb der Leukozytenrekrutierungskaskade in vivo dar. Die Methode kann in verschiedenen entzündlichen und septischen Modellen angewendet werden.
Zum Beispiel haben wir vor kurzem seine Relevanz in der Studie von Muskulaturen mit übertriebener Muskel-Leukozyten-Infiltration hervorgehoben. Unser Vorschlag an andere Wissenschaftler, die erwägen, diese Technik zu verwenden, ist, so viel praktische Erfahrung wie möglich zu erhalten, da die Methode sehr anfällig für geringfügige Abweichungen ist. Demonstriert wird das Verfahren von Simon Kranig, einem Arzt und leitenden Wissenschaftler aus meinem Labor.
Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifen im anästhesierten Versuchstier, fixieren Sie die Maus in einer dorsalen Liegeposition auf einem 37 Grad Celsius Heizpad und verwenden Sie eine nicht resorbierbare sterile 6-0 Naht, um eine einfache Schleife um die Frontalzähne zu wickeln. Kleben Sie die Verbindungsenden der Naht an das Heizkissen und verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut an der Mittellinie sanft zu heben. Als nächstes machen Sie einen kreisförmigen Ein- bis zwei Zentimeter Durchmesser Schnitt über den Hals und oberen Thorax und verwenden Pinzette, um sorgfältig die umgebenden Muskel- und Fett- und Bindegewebe zu sezieren.
Legen Sie eine Naht unter die Luftröhre. Verwenden Sie eine kleine chirurgische Schere, um einen ca. 1,3 Millimeter quer in die Luftröhre geschnitten zu machen und führen Sie ein Polyethylenrohr in das kaudale Ende der Luftröhre ein, um die oberen Atemwege zu sichern. Fixieren Sie das Rohr mit einer einzigen kreisförmigen Knoten Naht und lokalisieren Sie die Halsschlagader entlang der rechten Seite der Luftröhre.
Sezieren Sie das umgebende Gewebe von der Halsschlagaderwand und passieren Sie zwei Stücke der Naht unter der Arterie. Binden Sie die erste Schädelnaht proximal an die Bifurkation der Karotisarterien und positionieren Sie die zweite Naht etwa fünf bis acht Millimeter distal von der ersten Naht ohne Bindung. Als nächstes befestigen Sie ein 30-Zentimeter-Stück Polyethylenschläuche an einer mit Einer Milliliter-Spritze gefüllten Spritzennadel und klemmen Sie die Halsschlagader mit einem sieben Millimeter langen Gefäßclip distal an die zweite Naht.
Machen Sie einen ca. 0,5 Millimeter quer geschnittenen in der Halsschlagader und führen Sie das sterile Polyethylenrohr in die Arterie ein. Sichern Sie das Rohr mit der zweiten Naht und entfernen Sie den Behälterclip. Drücken Sie dann vorsichtig den Spritzenkolben, um Dies in das Gefäß zu spülen.
Um den Cremaster-Muskel vorzubereiten, übertragen Sie die Maus auf einen maßgeschneiderten Kunststoff-Mikroskoprahmen mit dem Hodensack zur Mikroskopstufe und greifen Sie den Hodensack an seinem distalsten Ende mit einer Pinzette vorsichtig. Ziehen Sie den Hodensack sanft, entfernen Sie einen kreisförmigen Abschnitt von etwa fünf MillimeterDurchmesser der skrotalen Haut halten das offene Gewebe gut hydratisiert mit Saline. Verwenden Sie zwei Pinzette, um das lose Bindegewebe zu sezieren und beide Hoden zu lokalisieren.
Greifen Sie einen Testis distally und sanft beginnen, das Fortpflanzungsgewebe entfernen alle umgebenden Bindegewebe Schritt für Schritt. Sobald der Hoden exzessiver geworden ist, fixieren Sie das distale Ende des Gewebes an den Gummiring, der das Stadium umgibt, und hydratisieren Sie das Gewebe mit Einer Saline. Als nächstes entfernen Sie vorsichtig das Bindegewebe, ohne den darunter liegenden Cremaster-Muskel zu schädigen.
Es ist wichtig, das gesamte Bindegewebe zu entfernen, was zu verschwommenen Bildern führen würde, ohne den zugrunde liegenden Cremaster-Muskel zu schädigen. Wenn das gesamte Gewebe entfernt wurde, machen Sie einen einen Millimeter Querschnitt, um den Cremaster-Muskel zu öffnen, bevor Sie einen Längsschnitt vom sehr distalen bis zum proximalen Ende des Gewebes machen. Der Muskel sollte sich sphärisch öffnen.
Verteilen Sie den Muskel vorsichtig über die Glasbühne und heften Sie den Muskel an den Gummiring, wobei darauf geachtet wird, den zentralen Bereich des Gewebes nicht zu berühren oder zu schädigen. Dann heften Sie die restlichen Hoden an die Seite, um Den Zugang zu der Region von Interesse zu geben und hydratisieren Sie das Gewebe mit PSS. Zur intravitalen Visualisierung der Muskelvaskulatur legen Sie den montierten Cremaster-Muskel in das aufrechte Mikroskop und wählen Sie das 40X-Objektiv aus.
Führen Sie die Aufnahmen unter kontinuierlicher Superfusion mit 35 bis 37 Grad Celsius PSS durch ein Stück kleiner Schläuche durch, die auf das aufrechte Ziel des Mikroskops geklebt wurden, um ein kontinuierliches Abtropfen von PSS neben dem Objektiv auf den Muskel und das Gewebe zu ermöglichen. Identifizieren Sie die postkapillaren Venules. Messen Sie die Mikrozirkulation an Venulen mit einem Durchmesser von 20 bis 40 Mikrometern.
Dann nehmen Sie hochauflösende Bilder der Mikrozirkulation aus dem Cremaster-Muskel über einen 30-Sekunden-Zeitraum kontinuierlich Anpassung des Fokus aufgrund von leichten Veränderungen in der Kontraktion und Entspannung des Muskelgewebes auf. Überschüssiges Bindegewebe kann zu verschwommenen mikroskopischen Bildern führen. In diesem repräsentativen mikroskopischen Bild können die postkapillaren Venulen, die zwischen 20 und 40 Mikrometer Durchmesser haben sollten, durch den Zusammenfluss von zwei kleineren Gefäßen identifiziert werden.
Anhühlunglerundige und rollende Leukozyten können visualisiert werden, während zirkulierende Leukozyten nur in Zeitlupenwiedergabe von aufgenommenen Videos verfolgt werden dürfen. Eine Vielzahl von Parametern kann die Leukozytenrekrutierung in vivo beeinflussen, einschließlich der Herzleistung, des Gefäßdurchmessers, der Mittelliniengeschwindigkeit, der Wandscherrate und der Anzahl der zirkulierenden Leukozyten. Beachten Sie, dass die Mittelliniengeschwindigkeit durch Herzleistung, periphere Gefäßresistenz und Intravasalvolumen beeinflusst wird.
Zum Beispiel erhöht ein großes Volumen von Rhodamine oder einer anderen experimentellen Substanz, die über den Karotiskatheter gegeben wird, die postkapillare Mittellinie geschwindigkeit und hemmt Die Leukozytenaufnahme und das Walzen. Im Gegenteil, Herzinsuffizienz, tiefe Anästhesie oder Unterkühlung können den postkapillaren Fluss verringern. Zur Bestimmung der Mittelliniengeschwindigkeit können frei zirkulierende fluoreszierende Leukozyten verwendet werden oder die Leukozyten müssen mit fluoreszierenden Reagenzien wie Rhodamine gefärbt werden.
Beachten Sie, dass Wildtypstämme physiologische Varianz aufweisen können. Beispielsweise zeigen C57BL/6-Mäuse im Vergleich zu C57BL/10ScSn-Tieren deutlich verbessertes Leukozytenwalzen, Adhäsion und Transmigration. Die Planungs- und Standardisierungsphasen sind wichtig für die Beherrschung der Technik, insbesondere bei der Vorbereitung von Cremaster-Muskeln für die Mikroskopie.
Andere Methoden zur Visualisierung der Leukozytenrekrutierung können durchgeführt werden, um zusätzliche Informationen zu liefern und den individuellen Beitrag von Leukozyten und Endothelzellen zur Rekrutierungskaskade zu sezieren. Diese Technik bietet eine Plattform für die präklinische Bewertung von pharmakologischen Meditierenden und neuartigen immunmodulatorischen Substanzen.
