Wir danken Herrn Dr. Alan Tessler für Kommentare und Leitartikel zu helfen. Diese Arbeit wurde vom NIH NS062320 unterstützt.

1. Mikroskop aufgebaut und Imaging-Vorbereitung <ol><li> Unsere bildgebenden Einrichtung besteht aus einem Leica MZ16 fluoreszierenden Stereomikroskop mit einer schnellen Verschlusszeit und eine gekühlte CCD-Kamera von Metamorph-Software gesteuert. </li><li> Bereiten Sie einen thermostatisch geregelten Heizkissen und passen Ausgang bis 32,5 ° C zu halten das Tier seine Körpertemperatur während und nach der Operation. </li><li> Warm sterile Ringer-Lösung oder künstliche Liquor (ACSF) bis 32,5 ° C im Voraus für die Bewässerung des Rückenmarks während der Operation. </li><li> Anesthetize das Tier mit einer intraperitonealen Injektion von Xylazin (8 mg / kg) und Ketamin (120 mg / kg) Cocktail. </li><li> Shave den oberen Rücken mit kleinen Tierschermaschinen und verbreiten einen kleinen Tropfen der Haarentfernung Lotion über die rasierte Fläche mit Wattestäbchen Abstriche. Minuten später, entfernen Sie die Anwendung Lotion mit 70% igem Ethanol getränkten Gaze Schwämme. </li></ol> 2. Laminektomie und chirurgische Freilegung der L5 Spinalganglien <ol><li> Legen Sie das Tier auf einem beheizten (32,5 ° C) pad und desinfizieren die Haut mit 70% Ethanol getränkten Wattestäbchen. </li><li> Unter Hellfeldbeleuchtung auf dem Stereomikroskop, führen Sie einen Medianschnitt (2 - bis 3-cm) in der Haut des Rückens. Falls erforderlich, verwenden Wattestäbchen Abstriche, um die Blutung zu stoppen. </li><li> Spiegeln die Muskulatur der Wirbelsäule auf die zugrunde liegende Lendenwirbel aussetzen. </li><li> Setzen Sie die L3-S1 Wirbelsäulensegmente durch rechtsseitige Hemi-Laminektomie mit kleinen Rongeure. Eine partielle Laminektomie auszusetzen 4-6 Segmenten der Lenden-und sakralen Rückenmark wird durch Entfernen der rechten dorsalen Teil des L5 Wirbel auf der Ebene der dem Beckenkamm des Hüftgelenkes (Standort der L5 DRG) rostral der L2 Wirbel (2 erstellt Wirbel kaudal der letzten Rippe). Perfundieren den Hohlraum mit warmen sterile Ringer-Lösung. </li><li> Position des Tieres auf einem Stützkissen (gerollt Baumwollgaze), um die Wirbelsäule zu glätten. Verwenden Sie Einfahren Haken auf den Bereich zu erweitern. </li><li> Zu diesem Zeitpunkt (ca. 30 Minuten nach dem ersten ip Injektion von Anästhetika, eine Ergänzung (0.5X) subkutan injiziert werden, um zu halten das Tier vollständig betäubt. Alternativ-, Gas-Anästhesie (2-4% Isofluran in 0.5L/min Sauerstoff ) kann bei wiederholter Betäubung während der Bildgebung, die länger als 1 Stunde genutzt werden. </li></ol> 3. Rhizotomie / Spinalganglien crush <ol><li> Wechseln Sie zu Fluoreszenzanregung zu visualisieren YFP markierten (+) Axone. </li><li> Mit der Spitze eines Sub-Q (26ga.) Nadel, führen Sie einen kleinen Einschnitt in die Dura über der L5 Spinalganglien (DR). Perfundieren wiederholt mit Ringer-Lösung und reinigen Sie vorsichtig mit Wattestäbchen Abstriche. </li><li> Identifizieren Sie die Website zu zerschlagen werden und legen Sie eine Seite einer feinen Pinzette (Dumont Nr. 5) subdural. </li><li> Schließen Sie die Zange vorsichtig, aber fest und hält den medialen Teil des L5-Wurzel für 10 Sekunden, und dann sanft Release der Zange. </li><li> Wash wiederholt mit physiologischer Kochsalzlösung und sauber vorsichtig mit Wattestäbchen Abstriche. </li></ol> 4. Bildaufnahme und post-op Verfahren <ol><li> Erhalten Sie mehrere Bilder der gesamten exponierten Bereich einschließlich der Andrang vor Ort und die Drez vor und direkt nach der Andrang bei niedrigen und hohen Vergrößerungen. </li><li> Die Bilder werden entweder als einzelne Schnappschüsse oder als mehrere Streams von 10 bis 20 Frames innerhalb von 30 Unternehmen erworben - bis 40-ms Belichtungszeit. In-Fokus-Bilder werden dann ausgewählt und einen Überblick montage entsteht später mit Photoshop. </li><li> Zur Minimierung der Narbenbildung, dicht gelten ein Stück dünnen synthetischen Matrix-Membran (Biobrane), gefolgt von künstlichen dura gefolgt, auf der exponierten Rückenmark. Achten Sie darauf, Stücke geschnitten passgenau in die freigelegte Rückenmark Fenster, so dass sie Anhänger des Rückenmarks sind. </li><li> Schließen Sie die Muskulatur mit sterilem Nahtmaterial 5-0 und in der Nähe der Mittellinie Schnitt mit Wundklammern. </li><li> Inject Ringer-Lösung (0,3-bis 0,5-ml subkutan), und zu verwalten, Buprenorphin als postoperative Analgesie (0,05 mg / kg) subkutan alle 12 h für 2 Tage. </li><li> Halten Sie das Tier auf einem Heizkissen (34 ° -35 ° C) bis erholt. </li></ol> 5. Wiederholte Bildgebung <ol><li> Anesthetize das Tier, und entfernen Sie die Wunde Clips und Nähte. </li><li> Entfernen künstliche Dura und dünne synthetische Matrix Membranflecken und halten sie in einem sterilen Röhrchen mit Ringer-Lösung für die spätere Wiederverwendung. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die kumulierte Bindegewebe Narbe mit der gebogenen Spitze eines Sub-Q Nadel und feinen Pinzette. Perfundieren häufig mit warmen Ringer-Lösung. </li><li> Re-Setzen der operative Bereich, einschließlich crush Website und Drez, verlagern YFP + Axone in früheren Sitzungen abgebildet, und wiederholen Sie die in Abschnitt 4 beschrieben. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Wir haben beobachtet, dass, während sie nicht nach einer Durchtrennung Verletzungen regenerieren sich, fast alle YFP + Axone über die Website von wuchsenVerletzungen von 3 Tagen nach crush (Abbildung 1) 11. In der Regel am nächsten Tag nach crush, beobachteten wir sterben-zurück-Degeneration proximalen Stumpf Axonen und Fragmentierung / Degeneration der Axone gleichen distal der zerquetschen, was bedeutet, dass Axone war entsprechend beschädigt bestätigt (z. B. Abbildung 1; Tag 3 und 5) . Mehrere zusätzliche Kriterien angewendet werden, um eindeutig zu unterscheiden regenerierenden Axone von Axonen, die verschont wurden oder hatte von der Verletzung erholt. Dazu gehörten die folgenden: (1) regenerierenden Axone zeigen eine Erweiterung der nicht-fluoreszierenden Teil des YFP + Axon das Gedränge vor Ort durch proximale und distale Degeneration (im Gegensatz zu einer Verengung der unmarkierten Lücke durch fluoreszierende Zytoplasma Nachfüllen der Andrang vor Ort Wenn Axone überlebte die Verletzung), (2) regenerierenden Axonen sind viel dünner, weniger hell fluoreszierendes und mehr welligen als Axone, dass die Verletzung überlebt, (3) Regeneration Neuriten sind dünner und schwach fluoreszierenden als die degenerierenden fluoreszierenden Fragmente der Axone durch die sie verlängert, (4) im Gegensatz zu überleben oder Axonen verschont, regenerierenden Axonen an der Drez stoppen, und (5) im Gegensatz zu überleben oder Axonen verschont, regenerierenden Axonen zeigen keine Knoten Ranvier. Abbildung 1 zeigt vier oberflächlichen YFP + Axone unmittelbar nach crush (A1; farbige Pfeile). Drei Tage nach dem Gedränge, erweitern alle vier Axone einem Neuriten, dass durch das Gedränge vor Ort (A2) wächst. Fünf Tage nach crush, bleiben Neuriten stabil und es gibt keine zusätzlichen Wachstum von diesen oder anderen proximalen Axone (A3). Die Regeneration von Neuriten, dass das Gedränge vor Ort durch viel dicker und heller fluoreszierende Fragmente eines degenerierenden Axon (dh endoneuralen Rohre) längliche gekreuzt, und kommen zu dem Drez bereits 4 Tage nach der Andrang (ca. 3mm / 2 Tage) 11. Wiederholte Bildgebung dieser Axone und ihre Spitzen alle zwei oder drei Tage für zwei weitere Wochen (Abbildung 2) ergab, dass sie nicht nach vorne wachsen oder zurückzunehmen, blieb aber unbeweglich. Die einzige merkliche Veränderung wurde von den Spitzen und Wellen von einigen Axonen Schwellung. Diese Beobachtungen zeigen somit überraschend schnell und chronische Immobilisation der regenerierenden Axone bei der Drez. <img src="/files/ftp_upload/3126/3126fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1: Wiederholte Bildgebung von L5 DR YFP + Axone an der Stelle der Spinalganglien crush über 5 Tage. Der mediale Teil der L5-Wurzel war am Boden zerstört (rot Pfeilspitze) und abgebildet an den Tagen 0, 3 und 5 nach dem Gedränge. Der Bereich der Andrang ist in der rechten Panels (A1-A3) vergrößert. <img src="/files/ftp_upload/3126/3126fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2:. Wiederholte Bildgebung von Axonen kam zu dem Drez über 20 Tage nach L5-Wurzel crush Tag 4, drei Axone (farbige Pfeile) kam zu dem Drez. Die Spitzen dieser Axone bleiben in der gleichen Lage und haben ein ähnliches Aussehen in aufeinander folgenden Sitzungen an den Tagen 7, 9, 13, 15 und 20. Die Positionen der ein Axon Spitze im Vergleich zu anderen Axon Tipps und Sehenswürdigkeiten (Sternchen) wurden verwendet, um Axon Motilität zwischen Imaging-Sessions zu bestimmen.

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	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+the+neuromuscular+junction.">Watching the neuromuscular junction.</a> J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).</li><li>Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+branch+removal+at+developing+synapses+by+axosome+shedding.">Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding.</a> Neuron. 44, 651-661 (2004).</li><li>Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+visualization+of+the+growth+of+pre-+and+postsynaptic+elements+of+neuromuscular+junctions+in+the+mouse.">in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse.</a> J Neurosci. 10, 894-908 (1990).</li><li>Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia,+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li><li>Maio, D. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+dorsal+root+regeneration:+Rapid+immobilization+and+presynaptic+differentiation+at+the+CNS/PNS+border.">in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border.</a> Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Imaging DR Regeneration direkt in lebenden Mäusen ist eine besondere Herausforderung, weil es eine erhebliche dorsale Laminektomie benötigt, um Axon-Wachstum über einen weiten Bereich von mehreren invasive chirurgische und Anästhesieverfahren in aufeinander folgenden Sitzungen folgten überwachen. Mehrere Strategien dazu beigetragen, diese Herausforderungen zu meistern. Erste erfolgreiche Bildgebung erforderlich Reduzierung Maus Mortalität (ca. 25%) durch die Minimierung der Dauer der Narkose und Blutungen, und dur...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> H-Linie THY1-YFP (2-4 Monate alt, beiderlei Geschlechts) </td><td> Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) </td><td> 003782 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazin (AnaSed Injektion, sterile Lösung) </td><td> Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) </td><td> 4811 </td><td> 8 mg / kg </td></tr><tr><td> Ketamin (Ketamin-Hydrochlorid Injektion, USP) </td><td> Hospira, Inc. (Lake Forest, IL) </td><td> 2051 </td><td> 120 mg / kg </td></tr><tr><td> Buprenorphin (Buprenex injizierbare) (0,05 mg / kg) </td><td> Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. (Richmond, VA) </td><td> 7571 </td><td></td></tr><tr><td> Kleintier-Haarschneidemaschinen </td><td> Oster Professional, (McMinnville, TN) </td><td> 76059-030 </td><td></td></tr><tr><td> Haarentfernung Lotion </td><td> Church &amp; Dwight Co. (Princeton, NJ) </td><td> NAIR mit Baby-Öl </td><td></td></tr><tr><td> Gazetupfer </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 22-362-173 </td><td></td></tr><tr><td> Wattestäbchen Abstriche </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 14 bis 960-3Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml-Spritzen </td><td> Becton, Dickson and Company Franklin Lakes, NJ) </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> Subkutane (Sub-Q) Nadeln, 26ga. </td><td> Becton, Dickinson und Company (Franklin Lakes, NJ) </td><td> 305115 </td><td></td></tr><tr><td> Frühling Schere und Pinzette </td><td> Feine Science Tools, (Foster City, CA) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2,5-mm gebogene Rongeure </td><td> Feine Science Tools, (Foster City, CA) </td><td> 16221-14 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer-Laktat-Injection USP </td><td> B. Braun Medical Inc., (Irvine, CA) </td><td> BBR-L7502 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile Kochsalzlösung </td><td> APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) </td><td> 918610 </td><td></td></tr><tr><td> Thin synthetischen Matrix-Membran (Biobrane) </td><td> Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) </td><td> 62794-096-251 </td><td></td></tr><tr><td> Künstliche dura </td><td> Gore Rückweisungen MVP Dura Substitute, WL Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) </td><td> 1MVP40 </td><td></td></tr><tr><td> 5-0 Seidenfäden </td><td> Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) </td><td> K-580 </td><td></td></tr><tr><td> Wound-Clips </td><td> Perfect - Ets Bruneau, (Burnea, Frankreich) </td><td> A75 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescent Stereomikroskop </td><td> Leica Microsystems (Wetzlar, Deutschland) </td><td> MZ16 </td><td></td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> Hamamatsu (Bridgewater, NJ) </td><td> ORCA-Rx2 </td><td></td></tr><tr><td> Temperaturregler </td><td> World Precision Instruments (Sarasota, FL) </td><td> ATC 1000 </td><td></td></tr><tr><td> Metamorph-Software </td><td> Molecular Devices (Sunnyvale, CA) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Photoshop </td><td> Adobe Systems, San Jose, CA </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of dorsal root axons after rhizotomy

Die primären sensorischen Axone durch spinale Verletzungen verletzt ausfallen, um in das Rückenmark zu regenerieren, was zu chronischen Schmerzen und dauerhaften Verlust der Empfindung. Regeneration der Spinalganglien (DR) Axone in das Rückenmark an der Spinalganglien Eingangszone (Drez), die Schnittstelle zwischen dem ZNS und PNS verhindert. Unser Verständnis der molekularen und zellulären Vorgänge Regeneration bei Drez zu verhindern, ist unvollständig, zum Teil, weil komplexe Änderungen mit Nervenverletzung verbunden von postmortalen Analysen abgeleitet worden sind. Dynamische zelluläre Prozesse, wie Axonregeneration, werden am besten mit Techniken, die Echtzeit-Ereignisse mit mehreren Beobachtungen von jedem lebenden Tier einzufangen untersucht. Unsere Fähigkeit, Neuronen seriell in vivo-Monitor hat dramatisch zugenommen aufgrund revolutionäre Innovationen in der Optik-und Maus-Transgenen. Mehrere Linien der THY1-GFP transgenen Mäusen, bei denen Teilmengen von Neuronen genetisch in unterschiedlichen fluoreszierenden Farben markiert, ermöglichen individuelle Neuronen in vivo 1 abgebildet werden. Diese Mäuse wurden umfassend in-vivo-Bildgebung von Muskel 2-4 und 5-7 Gehirn verwendet, und sofern neue Einblicke in physiologische Mechanismen, die statischen Analysen nicht gelöst haben könnte. Imaging-Studien von Neuronen im Rückenmark leben erst seit kurzem. Lichtman und seine Kollegen demonstrierten ihre Realisierbarkeit durch die Verfolgung verletzt dorsalen Spalte (DC) Axone mit Weitfeldmikroskopie 8,9. Multi-Photonen-in-vivo-Bildgebung von tief positioniert DC Axone hat Mikroglia und Blutgefäße, auch schon 10 erreicht. In den letzten Jahren haben wir bei der Anwendung in-vivo-Bildgebung, um die Regeneration von Axonen DR mit Weitwinkel-Mikroskopie und H-Linie von THY1-YFP Mäusen Monitor Pionierarbeit. Diese Studien haben wir eine neuartige Hypothese darüber, warum DR Axone sind aus nachwachsenden innerhalb des Rückenmarks 11 verhindert geführt. In H-Linie von THY1-YFP Mäusen unterscheiden YFP + Axone oberflächlich positioniert, die ermöglicht, dass mehrere Axone gleichzeitig überwacht werden. Wir haben gelernt, dass DR Axone Ankunft am Drez besser in Lendenwirbelsäule als im zervikalen Rückenmarks abgebildet. In dem vorliegenden Bericht beschreiben wir verschiedene Strategien, die wir als nützlich erwiesen, um langfristig erfolgreich und wiederholte Bildgebung zu regenerieren DR Axone zu gewährleisten haben. Dazu gehören Methoden, die wiederholt Intubation und Atemwege Unterbrechung zu beseitigen, zu minimieren Chirurgie-assoziierten Stress und Narbenbildung, und erwerben stabile Bilder mit hoher Auflösung ohne Phototoxizität.

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Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Ein<em&gt; In vivo</em&gt; Bildgebungsprotokoll zu primären sensorischen Axone folgenden Spinalganglien crush-Monitor beschrieben. Die Verfahren nutzen wide-field Fluoreszenzmikroskopie und THY1-YFP transgenen Mäusen, und erlauben wiederholte Bildgebung Axonregeneration über 4 cm im PNS und Axon Wechselwirkungen mit der Oberfläche des ZNS.

Live-Imaging von Spinalganglien Axone nach Rhizotomie

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

live-imaging-of-dorsal-root-axons-after-rhizotomy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K Aufrufe.  Shriners Hospitals Pediatric Research Center and Department of Anatomy and Cell Biology. Ein In vivo Bildgebungsprotokoll zu primären sensorischen Axone folgenden Spinalganglien crush-Monitor beschrieben. Die Verfahren nutzen wide-field Fluoreszenzmikroskopie und THY1-YFP transgenen Mäusen, und erlauben wiederholte Bildgebung Axonregeneration über 4 cm im PNS und Axon Wechselwirkungen mit der Oberfläche des ZNS.

Serie: Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Chromatin Immunopräzipitation aus Spinalganglien Tissue folgende axonale Schädigung

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Forschung

Neurowissenschaften

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Live-Imaging von Nikotin induzierte Calcium Signaling und Neurotransmitterausschüttung Zusammen Ventral Hippocampus Axone

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In - vitro - Modellierung von Cancerous Neural Invasion: The Dorsalwurzelganglion Modell

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

Laminotomie LWS Dorsal Root Ganglion-Zugriff und Injektion bei Schweinen

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Dorsal Root Ganglien Isolation und Primärkultur Neurotransmitter-Freisetzung zu studieren

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its highly-organized subcellular architecture, we recently developed a new imaging modality, named spectral reflectometry (SpeRe), which enables unprecedented label-free nanoscale imaging of the live myelinated axons in situ. The underlying principle is to obtain nanostructural information by analyzing the reflectance spectrum of the multilayered subcellular structure. In this article, we describe a detailed step-by-step protocol for performing a basic SpeRe imaging of the nervous tissues using a commercial confocal microscopic system, equipped with a white-light laser and a tunable filter. We cover the procedures of sample preparation, acquisition of spectral data, and image processing for obtaining nanostructural information.

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Here, we present a step-by-step protocol for imaging myelinated axons in a fixed brain slice using a label-free nanoscale imaging technique based on spectral reflectometry.

Spektrale Reflectometric Mikroskopie auf Markhaltige Axone In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Schnelle Isolierung von Dorsalwurzel Ganglion Makrophagen

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, neurons and Schwann cells engage in a complex interaction to control the myelination of axons. Disturbances of this interaction and breakdown of the myelin sheath are hallmarks of inflammatory neuropathies and occur secondarily in neurodegenerative disorders. Here, we present a coculture model of dorsal root ganglion explants and Schwann cells, which develops a robust myelination of peripheral axons to investigate the process of myelination in the peripheral nervous system, study axon-Schwann cell interactions, and evaluate the potential effects of therapeutic agents on each cell type separately. Methodologically, dorsal root ganglions of embryonic rats (E13.5) were harvested, dissociated from their surrounding tissue, and cultured as whole explants for 3 days. Schwann cells were isolated from 3-week-old adult rats, and sciatic nerves were enzymatically digested. The resulting Schwann cells were purified by magnetic-activated cell sorting and cultured under neuregulin and forskolin-enriched conditions. After 3 days of dorsal root ganglion explant culture, 30,000 Schwann cells were added to one dorsal root ganglion explant in a medium containing ascorbic acid. The first signs of myelination were detected on day 10 of coculture, through scattered signals for myelin basic protein in immunocytochemical staining. From day 14 onward, myelin sheaths were formed and propagated along the axons. Myelination can be quantified by myelin basic protein staining as a ratio of the myelination area and axon area, to account for the differences in axonal density. This model provides experimental opportunities to study various aspects of peripheral myelination in vitro, which is crucial for understanding the pathology of and possible treatment opportunities for demyelination and neurodegeneration in inflammatory and neurodegenerative diseases of the peripheral nervous system.

In the coculture system of dorsal root ganglia and Schwann cells, myelination of the peripheral nervous system can be studied. This model provides experimental opportunities to observe and quantify peripheral myelination and to study the effects of compounds of interest on the myelin sheath.

In vitro Myelinisierung peripherer Axone in einer Kokultur von Dorsalwurzelganglienexplantaten der Ratte und Schwann-Zellen

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...