Wir möchten Andrea Tedeschi für Hilfe bei der Einstellung der anfänglichen Chip-Experimente im Labor und Ricco Lindner für seinen Beitrag zur Feinabstimmung der Bedingungen für ChIP. Diese Arbeit wurde von der Hertie-Stiftung unterstützt, die Fortune-Grant, Universität Tübingen und der DFG DI 1497/1-1 Zuschüsse (alle Simone Di Giovanni gewährt).

1. Ischias &amp; dorsalen Säule Nervenverletzung <ol><li> Das Tier befindet sich auf einem OP-Tuch gelegt und unter eine Thermopad ist während des gesamten Verfahrens anwesend halten die Körpertemperatur der Maus bei 37 ° C. Alle Tiere werden anästhesiert für Chirurgie mit einer kontinuierlichen Isofluran / O 2-Administration. Chirurgische Instrumente sind vor dem Eingriff autoklaviert. </li><li> Für Ischias-Verletzung, sind beide Hinterhand sorgfältig rasiert und Enthaarung mit generischen Haarentferner vor der Reinigung der Haut mit Alkohol Betadyne 3 mal gefolgt abgeschlossen. </li><li> Der Ischiasnerv ist, indem Sie einen 4 mm Inzision posterior und parallel zum Femur der Mitte des Oberschenkels durch die Haut und durch die Verbreitung der Muskeln mit Ausnahme des Bizeps femoris mit feinen Pinzetten ausgesetzt. </li><li> Die exponierte Ischiasnerv wird dann verletzt, und die Haut wird mit zwei Klammern für chirurgische Nähte verschlossen. </li></ol> HINWEIS: Die gleichen Schnitt gemacht, um den Ischiasnerv aussetzen, aber die Wunde wird vernäht Verlassen der Nerv intakt für die Schein-Verletzungen. <ol start="5"><li> Für dorsalen Säule Verletzungen, ist die Rückseite der Maus sorgfältig rasiert und Enthaarung mit generischen Haarentferner vor der Reinigung der Haut mit Alkohol Spray / Swipe abgeschlossen. </li><li> Das Rückenmark ist, indem eine 2,5 cm lange Inzision von etwa T7 bis T13 ausgesetzt. Die Haut wird abgesehen, zu verbreiten und das Bindegewebe wird entlang der Wirbel von T9 bis T11 entfernt. </li><li> Eine Laminektomie ist bei T10-Ebene durchgeführt </li></ol> HINWEIS: Für die meisten Experimente, die Laminektomie gilt als die Sham Verletzungen. <ol start="8"><li> Ein paar Tropfen Xylocain sind, um das Gewebe hinzugefügt, um das Kabel zu betäuben, und die Dura mater entfernt ist, achten nicht auf das Rückenmark zu berühren. </li><li> Die dorsale Säulen sind verletzt und der Muskel ist zu schließen, vernäht wieder Aufmerksamkeit nicht auf das Rückenmark zu berühren. Schließlich ist die Haut vernäht mit Klammern für chirurgische Nähte. Buprenorphin (0,1 mg / kg Körpergewicht) sollte zweimal täglich für 48 Stunden oder bis sie nicht mehr benötigt, verabreicht. </li></ol> 2. Die Vernetzung <ol><li> Dissect L4 und L5 DRG von verletzten Mäusen nach euthanization. Sammle insgesamt 16 DRG in eiskaltes HBSS + Protease-Inhibitoren-Cocktail (2 Verletzte und 2 sham DRG von jedem Tier für insgesamt 4 Tiere). </li><li> Kurz zentrifugieren DRG, dann vorsichtig den HBSS und fügen 500 ul 1% Formaldehyd in PBS + Protease-Inhibitoren-Cocktail und inkubieren Sie die Probe für 30 Minuten bei 37 ° C. </li></ol> Entscheidender Schritt. Verwenden Sie frische, Molekularbiologie Formaldehyd. <ol start="3"><li> Add 125 mM Glycin, um die Fixierung und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur zu stoppen. </li><li> Kurz zentrifugieren, absaugen Puffer, und waschen Sie das Gewebe zweimal mit 500 ul eiskaltem PBS + Protease-Inhibitoren-Cocktail. </li></ol> 3. Kerne Vorbereitung und Chromatin Scheren <ol><li> Absaugen PBS, fügen Sie 400 ul SDS Lysepuffer, Transfer zu einem vorgekühlten Mikrozentrifugenröhrchen und stören das Gewebe mit ca. 30 Schläge mit dem Mikropistill. </li></ol> Entscheidender Schritt. Lysis und Störungen des Gewebes sind entscheidend für eine gute Ausbeute an vernetztem Chromatin. <ol start="2"><li> Mit Ultraschall die Probe mit 8 Impulse, 10 Sekunden jeweils bei 70% Leistung (Bandelin, Sonoplus GM70). </li></ol> VORSICHT. Die Scherung des Chromatins müssen für Ihre speziellen Beschallung optimiert werden eingerichtet und richtige Fragmentierung des Chromatins sollten, bevor Sie die tatsächliche IP-Experiment überprüft werden (siehe Abschnitt 3). HINWEIS. Fragmentierung des Chromatins könnte auch durch Mikrokokken-Nuclease (MNase) Verdauung durchgeführt werden. Als Faustregel gilt, ist die Fragmentierung durch Beschallung für feste Gewebe bevorzugt, während MNase Verdauung für native Gewebe Chromatinimmunpräzipitation begünstigt wird. Cross-linked kann geschert Chromatin bei -80 ° C bis zu 2 Monate gelagert werden, aber vermeiden Sie wiederholte Frost / Tau-Zyklen. 4. Analyse von Chromatin-Verdauung (empfohlen) <ol><li> Entfernen 10 pl Ihrer geschert Chromatin Probe für die Analyse. Add 200 mM NaCl auf die Probe und umgekehrt die Cross-Link durch Inkubation bei 65 ° C für 2h. </li><li> Purify DNA (siehe Abschnitt 8) und führen Sie ein 1% Agarosegel. DNA sollte eine Länge von ca. 200-1000 bp (Abbildung 1) fragmentiert. </li></ol> VORSICHT. Over-Fragmentierung von Chromatin kann zu einer verminderten Signal führen, während unvollständige Fragmentierung zu einer verminderten Auflösung und erhöhter Hintergrund führen wird. 5. Immunpräzipitation <ol><li> Bestimmen Sie die Anzahl der Immunpräzipitation Reaktionen (siehe Hinweis unten), und teilen Proben zu gleichen Teilen in neuen Schläuchen. Bringen Sie die Lautstärke der einzelnenbis zu 500 ul mit ChIP-Puffer + Protease-Inhibitoren-Cocktail. </li><li> Entfernen 5 ul der verdünnten Probe und Überführung in eine neue Röhre. Dies ist Ihr 1% Eingangs-Sample, und es wird bei -20 ° C gelagert werden, bis sie benötigt (§ 7). </li><li> Für jede Immunpräzipitation, fügen Sie entsprechende Antikörper oder normalen IgG-Steuerung und inkubieren Sie bei 4 ° C über Nacht mit einer Rotation. </li></ol> HINWEIS. Bei der Bestimmung der Anzahl der Immunpräzipitation, eine positive Kontrolle (zB Histone H3 Antikörper) und eine negative Kontrolle (Normal IgG) in Betracht gezogen werden. Die Menge der Antikörper für jedes IP verwendet wird, variiert zwischen Antikörpern und muss empirisch ermittelt werden. Allerdings ist es in der Regel innerhalb eines Bereichs von 2-10? G / Immunpräzipitation. <ol start="4"><li> Um Immunopräzipitat Ihren Antikörper / Protein / DNA-Komplex, fügen Sie 30 ul ChIP Grade Protein G Magnetic Beads und Inkubation für 2 h bei 4 ° C mit Rotation. </li></ol> 6. Waschen <ol><li> Um Pull-Down-gebunden Chromatin-Bead-Komplex, platzieren Sie den Schlauch auf die magnetischen Rack. Warten Sie, bis die Lösung klar ist und dann vorsichtig entfernen Sie Ihre Überstand. </li><li> 1 ml salzarme waschen (ChIP-Puffer), die Perlen und inkubieren Sie bei 4 ° C für 3-5 Minuten mit einer Rotation, dann Pull-Down-Perlen und absaugen waschen, wie in Schritt 6.1. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt 3 Wäschen. </li><li> 1 ml der hohen Salz-Waschpuffer (ChIP-Puffer + 350 mM NaCl), die Perlen und Inkubation für 3-5 Minuten mit einer Rotation, dann Pull-Down-Perlen und absaugen waschen, wie in Schritt 6.1. </li></ol> 7. Elution und Umkehrung der Vernetzung <ol><li> Nehmen Sie Ihre Eingabe Proben aus der -20 ° C, fügen Sie 150 ul ChIP Elutionspuffer und beiseite stellen bei Raumtemperatur bis Step 7.5. </li><li> Add 150 ul 1x ChIP Elutionspuffer für jede IP-Probe aus Schritt 6.3. </li><li> Legen Sie die Rohre in einem Thermomixer und eluieren das Chromatin aus den Kügelchen durch Inkubation Proben bei 65 ° C für 30 Minuten unter leichtem Vortexen. </li><li> Pull-Down-Perlen auf dem magnetischen Rack und transferieren es vorsichtig in den eluierten Chromatin (Überstand) in neue Schläuche. </li><li> Um alle Rohre, einschließlich Ihrer Eingabe Proben, fügen Sie 200 mM NaCl und 40 ug / Reaktion der Proteinase K und Inkubation bei 65 ° C für 2 Stunden. </li></ol> HINWEIS. Die Elutionsschritt kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden, auch, aber es wäre nicht so effizient. 8. DNA-Gewinnung <ol><li> Add 1 Volumen Phenol / Chloroform Ihre Proben aus Schritt 7,5 und Vortex für 30 Sekunden. </li><li> Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur für 5 Minuten. </li><li> Sorgfältig wieder die wässrige (obere) Phase in neue Schläuche, fügen Sie 1 Volumen Chloroform in die wässrige Phase und Vortex für 30 Sekunden. </li><li> Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur für 5 Minuten. </li><li> Sorgfältig wieder die wässrige (obere) Phase in neue Schläuche, dann fügen Sie 300 mM NaOAc, 20 ug / Reaktion von Glykogen und 2,5 Volumina eiskaltem 100% Ethanol. </li></ol> VORSICHT. Die Zugabe von einem Träger, wie zB die Glykogen, ist notwendig, um die Fällung von relativ kleinen DNA-Fragmenten zu verbessern. <ol start="6"><li> Inkubation bei -80 ° C für 2 Stunden zur Fällung DNA. </li></ol> HINWEIS. Die Fällung kann auch über Nacht bei -20 ° C durchgeführt werden <ol start="7"><li> Zentrifugieren Sie die Proben bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge für 20 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und wäscht das gefällte DNA-Pellets mit 300 ul eiskaltem 70% Ethanol. </li><li> Zentrifugieren Sie die Proben bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge für 10 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig soviel Überstand wie möglich und lassen Sie die Pellets an der Luft trocknen. </li><li> Resuspendieren in 20 ul sterilem H 2 O. Die Proben sind nun bereit für die PCR oder die DNA kann bei -20 ° C gelagert werden </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse Ein repräsentatives Ergebnis einer ChIP Experiment in DRGs folgenden Ischias-Läsion wird angezeigt (Abb. 1 und 2). Zuerst zeigen wir, fragmentierte DNA auf einer Länge von ca. 200-1000 bp (Abbildung 1). Zweitens zeigen wir, eine PCR-Signal folgende Chip von der proximalen Promotors des Wachstums associated protein-43 (GAP-43) nur auf Ischiasnerv Verletzungen (Spur 4, Abbildung 2, 5 &quot;). Kein PCR-Signal vorhanden ist, wenn das Tier eine Farce Verletzungen empfängt nur (Spur 3), und bei der Verwendung von normalen IgG-Serum für die IP (Bahn 5 und 6). Um zu testen, für die Spezifität der Antikörper, analysierten wir die gleichen DNA-Proben, sondern verwendet eine Steuerung Primer, die eine Region erkennt in der 3&#39;-UTR unserer Gen von Interesse, wo keine Belegung erwartet. PCR-Signale fehlen in allen Gassen (Spuren 3-6, Abb. 2, 3 &#39;), außer für das Eingangssignal, was Nicht-IP-DNA-Proben als Standard-PCR-Kontrolle (Spur 1-2, Figure 2). Dieser Chip Verfahren kann entweder nach ischiadicus oder Rückenmarks Spalte Verletzungen durchgeführt werden wie folgt zusammengefasst in einer schematischen (Abbildung 3). <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Agarosegel der umgekehrten vernetzten DNA, die durch Beschallung wurde auf den richtigen Bereich der Fragmentlängen geschert. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Semi-quantitative PCR-Ergebnisse aus DRG Gewebe nach Ischiasnerv Läsion zeigen, dass p53 acetylierten der GAP-43 proximalen Promotor-Region 48 Stunden nach der Verletzung des Ischiasnervs bindet. Kontroll-PCR aus der gleichen DRG Gewebe zeigen, dass p53 acetylierten nicht zu einer Kontrolle DNA-Region in der 3&#39;-untranslatierten Region (UTR) der GAP-43-Gen (S = Sham, I = Verletzte) befindet sich zu binden. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Eine allgemeine Diagramm, das den Ort der Läsion Standorte auf den Ischiasnerv und der dorsalen Säule.

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	<li>Beirowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+analysis+of+Wallerian+degeneration+using+restricted+axonal+labelling+in+YFP-H+mice.">Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).</li><li>Carey, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).</li><li>Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(&amp;mu;ChIP.">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (&amp;mu;ChIP.</a> Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation:+optimization,+quantitative+analysis+and+data+normalization.+Plant+Methods.">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods.</a> 11, 3-11 (2007).</li><li>Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Makwana, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+successful+peripheral+regeneration.">Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration.</a> Febs J. 272, 2628-2638 (2005).</li><li>Tedeschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+p53-CBP/p300+transcription+module+is+required+for+GAP-43+expression,+axon+outgrowth,+and+regeneration.">A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).</li><li>Teng, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regeneration+in+adult+CNS+neurons--signaling+molecules+and+pathways.">Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways.</a> J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).</li></ol>

Dieses Protokoll bietet eine Methode, um direkt über die Chromatin-Umgebung stellen während der axonalen Regeneration im adulten Nervensystem folgende axonale Schädigung. Es enthält die DRG Verletzungen Modell mit Chromatin-Immunopräzipitation der Transkriptions-und epigenetische Umgebung im Anschluss an eine Verletzung des PNS oder ZNS entweder Sonde. Es ist besonders nützlich für die Ermittler, die gerne putative Bindungsstellen für ihre Lieblings-Transkriptionsfaktor zu charakterisieren, und würde, um festzu...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> 10x ChIP Buffer </td><td> Cell Signaling </td><td> 7008 </td></tr><tr><td> 2x ChIP Elutionspuffer </td><td> Cell Signaling </td><td> 7009 </td></tr><tr><td> ChIP Grade Protein G Magnetic Beads </td><td> Cell Signaling </td><td> 9006 </td></tr><tr><td> Magna Grip Rack (8 gut) </td><td> Millipore </td><td> 20-400 </td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> MERCK </td><td> UN 1888 </td></tr><tr><td> 37% Formaldehyd </td><td> ROTH </td><td> CP10.1 </td></tr><tr><td> 10x Glycin-Lösung </td><td> Cell Signaling </td><td> 7005 </td></tr><tr><td> Glykogen </td><td> Sigma </td><td> G1767 </td></tr><tr><td> 10x HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> Histone H3 Antikörper (Kaninchen) </td><td> Cell Signaling </td><td> 2650 </td></tr><tr><td> Normal Rabbit IgG </td><td> Cell Signaling </td><td> 2729 </td></tr><tr><td> Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol </td><td> ROTH </td><td> A156.1 </td></tr><tr><td> Protease-Inhibitoren Cocktail Tabletten </td><td> Roche </td><td> 04 693 116 001 </td></tr><tr><td> Proteinase K (20 mg / ml) </td><td> Cell Signaling </td><td> 10012 </td></tr><tr><td> SDS-Lysepuffer </td><td> Upstate </td><td> 20-163 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Benötigte Ausrüstung </th></tr><tr><td> Sonicator </td></tr><tr><td> Micropistill </td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td></tr><tr><td> Thermomixer </td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury

Axone im zentralen Nervensystem (ZNS) nicht regenerieren, während die in das periphere Nervensystem (PNS) regenerieren zu tun, um in begrenztem Umfang nach einer Verletzung (Teng et al., 2006). Es wird anerkannt, dass transkriptionelle Programme unerlässlich für Neuriten und axonale Auswachsen nach Verletzungen im PNS (Makwana et al., 2005) reaktiviert werden. Doch die Werkzeuge zur Verfügung, um neuronale Genregulation in vivo zu analysieren sind begrenzt und oft eine Herausforderung. Die Spinalganglien (DRG) bieten eine hervorragende Verletzungen Modellsystem, weil beide das ZNS und PNS durch eine gegabelte Axon, die aus dem gleichen soma innerviert. Die Ganglien stellen eine diskrete Ansammlung von Zellkörpern, wo alle transkriptionelle Ereignisse auftreten, und somit eine klar definierte Region transkriptionelle Aktivität, die sich leicht und reproduzierbar aus dem Tier entfernt werden kann. Verletzung von Nervenfasern im PNS (zB Ischiasnerv), wo axonale Regeneration auftritt, sollte man ein Set von Transkriptions-Programme, die sich von denen der Reaktion auf eine ähnliche Verletzung im ZNS, in denen eine Regeneration nicht stattfindet (z. B. Rückenmark ). Websites für Transkriptionsfaktorbindungsstellen, Histon-und DNA-Modifikation aus der Verletzung entweder PNS oder ZNS charakterisiert Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) werden. Hier beschreiben wir eine ChIP-Protokoll mit festen Maus DRG Gewebe nach axonalen Verletzungen. Diese leistungsstarke Kombination bietet ein Mittel zur Charakterisierung der pro-Regeneration Chromatin Umfeld für die Förderung der axonalen Regeneration.

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Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Wir stellen eine Methode zur Chromatinimmunpräzipitation aus Spinalganglien Gewebe nach axonalen Verletzungen. Der Ansatz kann verwendet werden, um spezifische Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen und epigenetische Modifikation von Histon-und DNA wichtig für die Regeneration von verletzten Axonen sowohl in den peripheren und zentralen Nervensystems zu identifizieren.

Chromatin Immunopräzipitation aus Spinalganglien Tissue folgende axonale Schädigung

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

chromatin-immunoprecipitation-from-dorsal-root-ganglia-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.1K Aufrufe.  University of Tuebingen. Wir stellen eine Methode zur Chromatinimmunpräzipitation aus Spinalganglien Gewebe nach axonalen Verletzungen. Der Ansatz kann verwendet werden, um spezifische Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen und epigenetische Modifikation von Histon-und DNA wichtig für die Regeneration von verletzten Axonen sowohl in den peripheren und zentralen Nervensystems zu identifizieren.

Serie: Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Live-Imaging von Spinalganglien Axone nach Rhizotomie

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Forschung

Neurowissenschaften

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Intravital Imaging von Axonal Wechselwirkungen mit Mikroglia und Makrophagen in einem Maus-Rücken Spalte Quetschverletzung

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Dorsalwurzelganglien Neuronen und differenzierten Fettgewebe gewonnene Stammzellen: Eine<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Kultur Modell zur Regeneration peripherer Nerven Studieren

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

Hydraulische Extrusion des Rückenmarks und Isolierung von Dorsalwurzelganglien in Nagetiere

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

Laminotomie LWS Dorsal Root Ganglion-Zugriff und Injektion bei Schweinen

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Dorsal Root Ganglien Isolation und Primärkultur Neurotransmitter-Freisetzung zu studieren

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Optimierung der Capture-Laser Mikrodissektion für die Isolierung der enterischen Ganglien aus menschlichem Gewebe Tiefkühlfrische

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Schnelle Isolierung von Dorsalwurzel Ganglion Makrophagen

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...