Diese Arbeit wurde durch Stipendien an FZ vom NIH (R01NS064288) und der Craig H. Neilsen Stiftung unterstützt.

1. Vorbereitung der Deckgläser, Kulturmedium und Verdauungsenzyme <ol><li> Die 12-mm rund Nr. 1 Deckgläser werden für die neuronale Kultur verwendet. Die Deckgläser werden gereinigt mit 10% HCl über Nacht, gefolgt von Ultraschall-Waschung mit destilliertem und entionisiertem Wasser für 3-mal (20 min / Zeit). Die gereinigten Deckgläser in 70% Ethanol für den späteren Gebrauch gespeichert. Vor jedem Experimente sind die Deckgläser Luft getrocknet und in das Kulturmedium Platte gelegt. </li><li> Zur Beschichtung der getrockneten Deckgläser wurden 100 ul Beschichtungslösung, enthaltend 100 ug / ml Poly-D-Lysin und 10 pg / ml Laminin funktionierende Lösung wird auf jede Deckglas zugegeben und die Kultur Platte wird in eine 37 ° C Inkubator überführt. Nach 1-2 h wurde die Beschichtungslösung entfernt und die Deckgläser werden 3 mal mit sterilem 1X PBS gewaschen. </li><li> Um das Kulturmedium, das Minimum Essential Medium (MEM) herzustellen wird mit 5% fötalem Rinderserum (FBS), 1 × Penicillin-Streptomycin-Lösung (500 Einheiten Penicillin ergänztlin und 500 ug Streptomycin), 1X Glutamax I-Ergänzung, und die Reagenzien, die antimitotische 20 uM 5-Fluor-2-desoxyuridin und 20 uM Uridin (FDU / R). Für die serumfreiem Medium wird die FBS mit dem Zusatz B27. </li><li> Die Collagenase Eine Lösung wird durch Auflösen von Collagenase Ein Pulver mit MEM, um eine Arbeitskonzentration von 1 mg / ml zu hergestellt. Für die Trypsin wird das 1X TrypLE Express verwendet. </li></ol> 2. Dissection und Ernte der erwachsenen Maus DRG-Neuronen <ol><li> Nach Tötung der 6 - bis 10-Wochen alt erwachsenen Maus, entfernen Sie die Rückenhaut und schneiden Sie die gesamte Wirbelsäule. Waschen Sie die Wirbelsäule entfernt mit 1 X PBS 2-3 mal. </li><li> Stecken Sie die Wirbelsäule entfernt zum Sezieren Platte mit ventralen Seite nach oben und sorgfältig entfernt Muskeln, um die sensorischen Nerven unter einem Binokular aussetzen. Die Nerven an DRGs an der Holz-Ebene sind die dicksten und leicht zu finden. Daher ist für die meisten Experimente nur der LendenwirbelsäuleDRGs werden geerntet. </li><li> Schneiden Sie durch die einzelnen Wirbel entlang der Mittellinie mit einer kleinen Schere vorsichtig entfernen und die Bandscheiben. Mit einer Pinzette, jeden Wirbel Aufgeteilt ist das Rückenmark freizulegen. </li><li> Zu sezieren Sie die DRGs Schnittholz, Bauholz hebe jeden Nerv mit einer Pinzette und Verfolgung in Richtung Rückenmark, um die zugehörigen Lendenwirbel DRGs (aus L1 bis L6) zu lokalisieren. </li><li> Schneiden Sie jedes DRG aus angeschlossenen peripheren Nerven, dorsalen und ventralen Wurzeln mit Feder Schere, und speichern sie in Mikrozentrifugenröhrchen mit MEM-Medium auf Eis gestellt. Mehr DRGs an verschiedenen spinalen Ebenen (z. B. Brust-DRGs) kann in ähnlicher Weise, wenn notwendig, präpariert werden. </li></ol> 3. Verdauung und Dissoziation von erwachsenen Maus DRG-Neuronen <ol><li> Nach dem Sammeln aller DRGs seziert, ersetzen Sie die MEM-Medium mit 1 ml Collagenase Eine Lösung und Inkubation des Mikrozentrifugenröhrchen bei 37 ° C für 90 min. </li><li> Ersetzen Kollagenase eine Lösung mit 500 ul 1X TrypLE Express sosung und bei 37 ° C für 15-20 min. </li><li> Entfernen Sie die TrypLE Express-Lösung und waschen die DRGs mit 1 ml vorbereitete Kulturmedium (mit 5% FBS) für die 3-fache. </li><li> Fügen Sie 600 ul Kulturmedium und sanft und Abpipettieren, um die Gewebe für 20-30 mal mit einer 1 ml blau verreiben, absolvierte Pipettenspitze. </li><li> Nach Verreiben, damit die nicht-dissoziierten Gewebe zu beruhigen, um dem Boden des Mikrofuge und übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 10 ml sterilen Röhrchen. Fügen Sie eine weitere 600 ul Kulturmedium und wiederholen Sie den Vorgang, bis Verreibung den meisten Geweben dissoziiert sind. Die erhaltene Zellsuspension enthält sowohl Neuronen und nicht-neuronalen Zellen. In den meisten Fällen werden die Zellen von 6 DRGs (~ 5 × 10 4) für eine Elektroporation Reaktion verwendet. </li></ol> 4. Genetische Manipulation von Neuronen mittels Elektroporation <ol><li> Bereiten Sie die Transfektion durch Mischen der Lösung für Amaxa Nukleofektion Mausneuronen mit DNA-Plasmide (~ 10 ug) Oder siRNA Oligos (~ 0,2 nmol), um ein Endvolumen von 100 ul für jede Transfektion. </li><li> Zentrifugation der dissoziierten Zellen bei 680 UpM für 7 min bei Raumtemperatur, und entsorgen Überstand so weit wie möglich. Fügen Sie den vorbereiteten Transfektionslösung und sanft und Abpipettieren 3-4 mal mit 200 ul Pipettenspitzen zu resuspendieren die Zellen. </li><li> Übertragen der Zellsuspension mit der Transfektion Lösung des Elektroporationsküvette gemischt und Elektroporation der Zellen mit dem Amaxa Nucleofector System-Programm G-013. </li><li> Nach der Elektroporation sogleich hinzufügen, 500 ul vorgewärmtes (37 ° C) Kulturmedium, das FBS in die Küvette und übertragen die gesamte Lösung (~ 600 ul) in die beschichtete Platte bei Kultur gewünschten Zelldichten. Für das Experiment, die Resuspension und Re-Plattieren erfordert, sind Neuronen direkt auf der Kunststoff-Kulturschale mit hoher Dichte (10.000 bis 20.000 Zellen / Vertiefung) kultiviert. Für Experiment, das direkt untersucht Axonwachstum, sind Neurone vernickelt onto beschichteten Deckgläsern bei niedrigerer Dichte (3000-5000 Zellen / Well). Legen Sie die Kultur Platte in den Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Vier Stunden nach dem Ausstreichen, wenn Neuronen zu den Substraten angebracht haben, ersetzen Sie die sanft Kulturmedium (enthält die Amaxa Nukleofektion Lösung) mit 500 ul frisch und vorgewärmtes Kulturmedium, und die Platte zurück in den Inkubator für zusätzliche Kultur (37 ° C , 5% CO 2). Sowohl Kulturmedium, das FBS oder das Serum-freiem Medium kann in diesem Schritt verwendet werden. </li></ol> 5. Die Züchtung Adult DRG-Neuronen für Axonwachstum Analyse <ol><li> Für Neuronen mit DNA transfiziert, kann die Expression von Gen-von-Interesse (zB EGFP) bereits einige Stunden nach der Elektroporation beobachtet werden. Für Neuronen mit siRNAs transfiziert wir in der Regel 3-4 Tage warten, um eine ausreichende Depletion der endogenen Proteinen erlauben. Die kultivierten Neuronen kann entweder direkt zur Axonwachstum Analyse werden bei vario fixiertuns Zeitpunkten (1-4 Tage nach der Elektroporation) oder resuspendiert und erneut ausplattiert, um Axon Nachwachsen (siehe unten) zu analysieren. </li><li> Für RNAi-vermittelten loss-of-function-Studien können die kultivierten Neuronen resuspendiert werden und neu beschichtet, damit Axone von Neuronen, in denen die gezielte Proteine ​​bereits erschöpft sind wieder nachwachsen. Dazu ersetzen Sie die alte Kulturmedium der High-Density-kultivierten Neuronen mit 1 ml vorgewärmtes frisches Medium und Pipette vorsichtig nach oben und unten für 6-10 mal wieder zu suspendieren die angeschlossenen Neuronen aus der Kulturschale. Da nicht-neuronalen Zellen (zB Schwann-Zellen) zu befestigen viel enger an der Kulturschale als Neuronen, sind die resuspendierten Zellen meist Neuronen. </li><li> Übertragen Sie die resuspendiert Neuronen in ein Mikrozentrifugenröhrchen und sanft verreiben 10-15 mal neu zu distanzieren, die Zellklumpen in die einzelne Zelle Suspension. </li><li> Re-Platte die Re-dissoziierter Neuronen auf neu hergestellt Deckgläser mit geringer Dichte (3000-5000 Zellen / Well) und Kultur über Nacht (16-24 h). </li></ol> 6. Fixierung, Immunfärbung und Fluoreszenz-Imaging <ol><li> Saugen Sie das Medium, und fügen Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) (200 ul / Vertiefung), um die Zellen für 15-20 min bei Raumtemperatur zu beheben. Die fixierten Zellen werden dann mit 1 × PBS für 3-mal gewaschen. </li><li> Absaugen des PBS versetzen und Blocking-Lösung (1% Rinderserumalbumin, 0,1% Triton X-100 und 2,0% normalem Ziegenserum in PBS 1X) an die festen Neuronen für 60 min bei Raumtemperatur. </li><li> Um Etikett Axone, sind die Neuronen Immuno-gefärbt mit anti-Neurofilamente oder Anti-Tubulin-Antikörper βIII. Dazu legen Sie eine 30μl Tropfen primärer Antikörper-Lösung (1:1200 Verdünnung für die βIII-Tubulin-Antikörper) auf einem Parafilm für jedes Deckglas. Kehren Sie die Deckgläser und legt sie auf den primären Antikörper-Lösung für 60 min bei Raumtemperatur. </li><li> Zurück Deckgläser auf die ursprüngliche Kultur und Teller waschen Sie sie mit 1X PBS für 3 mal. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Sekundarstufe einskörper-. </li><li> Waschen Sie die Deckgläser mit destilliertem Wasser für 3-mal, und dann montieren Deckgläser auf Glasplättchen mit dem Montage-Lösung (zB Gold-ProLong Antifade). </li><li> Die gefärbten Neuronen mit einem Fluoreszenz-Mikroskopie mit einer Digitalkamera abgebildet werden. Die Axon-Längen werden gemessen und analysiert mit bildgebenden Analyse-Software. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse In der Abwesenheit jeglicher extrazelluläre Wachstumsfaktoren, die erwachsenen DRG-Neuronen in der Regel beginnen zu wachsen Axone 48 h nach der ersten Beschichtung. Die Axone zeigen oft verzweigten Morphologie (Abbildung 1). Im Gegensatz dazu beginnen die erneut ausplattiert Neuronen zu verlängern Axone nur wenige Stunden nach dem Ausstreichen und die Axone zu einem stark verringerten Verzweigung (2) länglich ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass neu vergoldet Neuronen ähnliche Eigenschaften teilen, zu denen der Konditionierung verletzten Neuronen. Mit diesem Ansatz haben wir vor kurzem durchgeführt Verlust-of-function-Studien, die Rolle der Axonregeneration assoziierten Transkriptionsfaktor c-Jun in Axonwachstum aus adulten DRG-Neuronen in vitro zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Elektroporation einer Gruppe von 4 verschiedenen siRNAs verschiedenen Regionen von c-Jun (ON-TARGETplus) deutlich verringert die Proteinexpression von c-Jun in adulten DRG Neuronen 3 Tage nach der Transfektion (3) 9. Wenn die Neuronen wieder ausplattiert und über Nacht waren, Axonwachstum von c-Jun-Knockdown Neuronen wurde signifikant reduziert (Kontrolle: 348,37 ± 16.21mm; Si-C-Jun: 262,32 ± 15,69 um, Abbildung 3) 9. Diese Ergebnisse zeigen, dass die kultivierten adulten DRG-Neuronen ein nützliches Modellsystem, um das Wachstum der Axone aus adulten Nervenzellen zu studieren. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig1.jpg" /> 1. Adulten Maus DRG-Neuronen mit geringer Dichte für 3 Tage kultiviert. Die Neuronen wurden mit anti gefärbt - &amp; beta; III Tubulin-Antikörper. Beachten Sie, dass die meisten Axone verzweigte Strukturen aufweisen. Maßstabsbalken: 125 um. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig2.jpg" /> Abbildung 2. Re-Plating erwachsenen Maus DRG-Neuronen nach 3 Tagen in der Kultur. (A) Erwachsene DRG-Neuronen mit hoher Dichte für 3 Tage kultiviert. (B) Re-plated erwachsenen DRG-Neuronen wurden bei niedriger Dichte für über Nacht kultiviert. Beachten Sie, dass die meisten Axone zeigen längliche Morphologien mit wenig Axon Verzweigung. Maßstabsbalken: 250 &amp;mgr; m in einem und 125 um in B. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig3.jpg" /> Abbildung 3. Rolle von c-Jun in Axonwachstum aus adulten DRG-Neuronen in vitro. (A) Western Blot Analyse von c-Jun in adulten Maus DRG-Neuronen nach der Elektroporation von c-Jun siRNAs. Das Ergebnis zeigt deutlich verringertem Gehalt an c-Jun. (B) Kontrolle Neuronen mit EGFP transfiziert wuchs lange Axone nach einer erneuten Beschichtung und-Nacht-Kultur. (C) Co-trans-fektion von c-Jun siRNAs und EGFP eingeschränkter Axonwachstum aus adulten DRG-Neuronen nach der erneuten Plattierung und-Nacht-Kultur. Rot: TuJ-1-Färbung, grün: EGFP. Maßstabsbalken: 125 um. Diese Ergebnisse wurden in Saijilafu et al veröffentlicht worden. 9.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Adult DRG-Neuronen ihre Axone regenerieren robust nach peripheren Nervenverletzungen in vivo und in vitro, wodurch ein nützliches System zu Axonregeneration bei erwachsenen Tieren zu studieren. In-vitro-Kultur von adulten DRG-Neuronen wird immer eine weit verbreitete Methode, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, mit denen Axonregeneration geregelt wird. Die In-vitro-Verfahren zur Kultivierung von adulten Maus DRG-Neuronen hier vorgestellten ermöglicht eine schnelle und eff...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> Poly-D-lysin-hydrobromid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td></tr><tr><td> 5-Fluor-2-desoxyuridin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Uridin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U3003 </td></tr><tr><td> Collagenase A </td><td> Roche </td><td> 10103578001 </td></tr><tr><td> TrypLE Express </td><td> Invitrogen </td><td> 12604-013 </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> Invitrogen </td><td> 10270-098 </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122</td></tr><tr><td> Glutamax-I (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-038 </td></tr><tr><td> Deckgläser (# 1) </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 72196-12 </td></tr><tr><td> 24-Well-Zellkulturplatte </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21 bis 040-CV </td></tr><tr><td> Sterilem, destilliertem und entionisiertem Wasser </td><td> Mediatech </td><td> 25 bis 055-CV </td></tr><tr><td> Nucleofector und Elektroporation Kits für Mäuseneuronen </td><td> Lonza </td><td> VPG-1001 </td></tr><tr><td> ON-TARGETplus siRNA gegen c-Jun </td><td> Dharmacon </td><td> L-043.776 </td></tr><tr><td> Anti - βIII Tubulin-Antikörper (TuJ-1) </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td></tr><tr><td> ProLong Gold-Antifade Montagelösung </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td></tr></tbody&gt; </table>

genetic study of axon regeneration with cultured adult dorsal root ganglion neurons

Es ist bekannt, dass ausgereifte Nervenzellen im zentralen Nervensystem (ZNS) kann sich nicht regenerieren ihre Axone nach Verletzungen durch verminderte intrinsische Fähigkeit, das Wachstum der Axone und eine feindliche Umgebung in der reifen ZNS 1,2 zu unterstützen. Im Gegensatz dazu reifen Neuronen im peripheren Nervensystem (PNS) leicht nach Verletzungen regenerieren 3. Adult Spinalganglien (DRG) Neurone sind bekanntlich robust regenerieren nach peripheren Nervenverletzungen. Jede DRG Neuron wächst ein Axon aus der Zelle soma, die verzweigt sich in zwei Äste axonalen: ein peripheres Filiale innervieren peripheren Ziele und einen zentralen Zweig, der sich in das Rückenmark. Verletzung der DRG peripheren Axone führt zu erheblichen Axonregeneration, während zentraler Axone im Rückenmark schlecht regenerieren nach der Verletzung. Allerdings, wenn die periphere axonale Schädigung tritt vor der Verletzung des Rückenmarks (ein Prozess namens der Konditionierung Läsion), die Regeneration des zentralen Axone ist greatly verbesserte 4. Darüber hinaus teilen die zentralen Axone von DRG-Neuronen der gleichen feindlichen Umgebung wie absteigend corticospinaler Axone im Rückenmark. Gemeinsam wird die Hypothese aufgestellt, dass die molekularen Mechanismen, die Axonregeneration von erwachsenen DRG-Neuronen genutzt werden, um ZNS Axonregeneration zu verbessern. Als Ergebnis findet man adulte DRG-Neuronen heute weithin als Modellsystem zur Untersuchung der regenerativen Axonwachstum 7.5 verwendet. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur adulten DRG Neuronenkultur, die für genetische Studien Axonregeneration in vitro verwendet werden können. In diesem Modell erwachsenen DRG-Neuronen sind genetisch mittels Elektroporation vermittelte Gentransfektion 6,8 manipuliert. Durch Transfektion von Neuronen mit DNA-Plasmid oder si / shRNA, ermöglicht dieser Ansatz sowohl Gewinn-und Verlust-of-function Experimente über die Rolle von jedem Gen-of-Interest in Axonwachstum aus adulten DRG-Neuronen zu untersuchen. Wenn Neuronen mit Si / shRNA transfiziert werden, ist die gezielte endogenes Proteinin der Regel nach 3-4 Tagen in der Kultur, während welcher Zeit robuste Wachstum der Axone bereits aufgetreten ist aufgebraucht, so dass die Loss-of-Funktions-Studien weniger wirksam. Um dieses Problem zu lösen, umfasst das hier beschriebene Verfahren eine Resuspension und Re-Plattierungsschritt nach der Transfektion, die Axone von Neuronen in der Abwesenheit des Zielproteins wieder wachsen können. Schließlich bieten wir ein Beispiel für die Verwendung dieser in-vitro-Modell, um die Rolle eines Axonregeneration-assoziierten Gens c-Jun, bei der Vermittlung Axonwachstum aus adulten DRG-Neuronen 9 zu studieren.

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Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell für genetische Untersuchung von Axonregeneration mit kultivierten adulten Maus Spinalganglienneuronen beschrieben wird. Das Verfahren umfasst einen Schritt zur re-suspension/re-plating Axon Nachwachsen von Neuronen unterzogen genetische Manipulation zu ermöglichen. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für die Loss-of-Funktions-Studien von Axonregeneration unter Verwendung von RNAi-basierten Protein Knockdown.

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

genetic-study-axon-regeneration-with-cultured-adult-dorsal-root

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.4K Aufrufe.  Johns Hopkins University School of Medicine. Ein In-vitro- Modell für genetische Untersuchung von Axonregeneration mit kultivierten adulten Maus Spinalganglienneuronen beschrieben wird. Das Verfahren umfasst einen Schritt zur re-suspension/re-plating Axon Nachwachsen von Neuronen unterzogen genetische Manipulation zu ermöglichen. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für die Loss-of-Funktions-Studien von Axonregeneration unter Verwendung von RNAi-basierten Protein Knockdown.

Serie: Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Dorsalwurzelganglien Neuronen und differenzierten Fettgewebe gewonnene Stammzellen: Eine<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Kultur Modell zur Regeneration peripherer Nerven Studieren

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Forschung

Neurowissenschaften

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In - vitro - Modellierung von Cancerous Neural Invasion: The Dorsalwurzelganglion Modell

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

Laminotomie LWS Dorsal Root Ganglion-Zugriff und Injektion bei Schweinen

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Ermittelnden Säugetier-Axon Regeneration: In Vivo Elektroporation von Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Schnelle Isolierung von Dorsalwurzel Ganglion Makrophagen

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, assembly and activity-dependent plasticity. Giant ankyrin-G, the master organizer of AIS, directly associates with membrane-spanning voltage gated sodium (VSVG) and potassium channels (KCNQ2/3), as well as 186 kDa neurofascin, a L1CAM cell adhesion molecule. Giant ankyrin-G also binds to and recruits cytoplasmic AIS molecules including beta-4-spectrin, and the microtubule-binding proteins, EB1/EB3 and Ndel1. Giant ankyrin-G is sufficient to rescue AIS formation in ankyrin-G deficient neurons. Ankyrin-G also includes a smaller 190 kDa isoform located at dendritic spines instead of the AIS, which is incapable of targeting to the AIS or rescuing the AIS in ankyrin-G-deficient neurons. Here, we described a protocol using cultured hippocampal neurons from ANK3-E22/23-flox mice, which, when transfected with Cre-BFP exhibit loss of all isoform of ankyrin-G and impair the formation of AIS. Combined a modified Banker glia/neuron co-culture system, we developed a method to transfect ankyrin-G null neurons with a 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, which is sufficient to rescue the formation of AIS. We further employ a quantification method, developed by Salzer and colleagues to deal with variation in AIS distance from the neuronal cell bodies that occurs in hippocampal neuron cultures. This protocol allows quantitative studies of the de novo assembly and dynamic behavior of AIS.

Here, we described a protocol to quantitatively study the assembly and structure of the axon initial segments (AIS) of hippocampal neurons that lack pre-assembled AIS due to the absence of a giant ankyrin-G.

Verwendung von primär kultivierten Hippocampus-Neuronen zur Untersuchung der Anordnung von Axon-Anfangssegmenten

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

Cokultur von Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons mit olfactory Ensheathing Glia, als In-Vitro-Modell der erwachsenen axonalen Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

In situ Visualisierung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Hirnschnittkulturen

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...