Neue Erkenntnisse haben den Beitrag von dorsalen Wurzelganglienmakrophagen zur neuropathische Schmerzentwicklung und axonalen Reparatur im Zusammenhang mit Nervenverletzungen involviert. Schnell phänotypisieren die Reaktion von dorsalen Wurzel Ganglion Makrophagen ist gewünscht, um die unbekannten Neuroimmunfaktoren zu identifizieren. Hier zeigen wir, wie unser Labor Makrophagen aus den dorsalen Wurzelganglien mithilfe eines enzymfreien mechanischen Dissoziationsprotokolls schnell und effektiv isoliert.
Dieses Protokoll ist im Vergleich zu standardenzymatischen Protokollen weit weniger zeitaufwändig und hat es routinemäßig für unsere fluoreszenzaktivierte Zellsortierungsanalyse verwendet. Vor Beginn des Experiments bereiten Sie die Arbeitslösung des Dichtegradientenmediums vor, indem Sie neun Volumen des Mediums mit einem Volumen calcium- und magnesiumfreier 10X HBSS mischen und auf Eis halten. Bestätigen Sie, dass die Maus vollständig durch die fehlende Reaktion auf die Hinterpfoten-Pinch besäugnett wird.
Beginnen Sie, indem Sie eine anästhesierte Maus in eine chemische Dunstabzugshaube in der Rückenposition mit vier Pfoten mit Klebeband gesichert. Verwenden Sie Zangen, um die Haut unter dem Brustkorb zu heben. Und dann mit chirurgischer Schere, machen Sie einen kleinen Schnitt, um die Leber und Daseinmembrane zu belichten.
Schneiden Sie mit der gleichen Schere das Zwerchfell und den Brustkorb. Und dann öffnen Sie die Pleurahöhle, um das schlagende Herz zu entblößen. Als nächstes mit Irisschere, schnell schneiden Sie die richtige Vorhof-Anhängsgut.
Sobald die Blutung festgestellt wurde, legen Sie eine 30-Spur-Nadel in das hintere Ende der linken Herzkammer und spritzen Sie langsam 10 Milliliter vorgekühlte 1X PBS, um das Tier zu durchdringen. Um eine dorsale Laminektomie durchzuführen, platzieren Sie die Maus in die anfällige Position. Verwenden Sie ein Skalpell der Größe 11, um zwei seitliche Tiefschnitte der Längsseite von der Brustregion bis in die sakrale Region zu bilden.
Dann entfernen Sie die Haut, die die dorsale Muskelschicht freisetzt. Dann mit Friedman-Pearson rongeur, schälen Sie die Bindegewebe und Muskeln, bis die lumbosakralen Wirbelsäule Prozesse und bilaterale Transversalprozesse ausgesetzt sind. Verwenden Sie zunächst einen Friedman-Pearson-Rongeur, um die dorsale Wirbelsäule vorsichtig zu öffnen, und wechseln Sie dann zwischen einer Friedman-Pearson-Rongeur- und Noyes-Federschere, um die Wirbelknochen zu entfernen, und setzen Sie das Rückenmark mit intakten Wirbelsäulennerven frei.
Sezieren Sie ipsilateralund und kontralaterale Lendendramen DRG sorgfältig. Legen Sie es in einen Milliliter eiskaltes Kalzium und Magnesium-freies 1X HBSS in einem Dounce Gewebe homogenisator. Homogenisieren Sie das DRG-Gewebe im Dounce Homogenisator 20 bis 25 Mal mit einem lockeren Stößel.
Legen Sie ein steriles 70-Mikrometer-Nylon-Zellsieb in ein steriles 50-Milliliter-Konusrohr. Verwenden Sie 800 Mikroliter Eiscode 1X HBSS, um das Zellsieb zu befeuchten. Verwenden Sie eine Pipette, um die homogenisierte Gewebesuspension vom Homogenisator auf das Nasszellensieb zu sammeln und in das 50-Milliliter konische Rohr zu sammeln.
Spülen Sie den Homogenisator zweimal mit 800 Mikrolitere eiskaltem 1X HBSS, die Flüssigkeit in das gleiche 50-Milliliter-Konikonrohr zu sammeln, um die Ausbeute zu erhöhen. Fügen Sie 1,5 Milliliter äquilibriertes eiskaltes isotonischer Dichtegradientenmedium in ein steriles Polystyrolkolbenrohr mit fünf Millilitern ein. Übertragen Sie das Zellhomogenat aus dem 50-Milliliter-Konusrohr in dieses Kolbenrohr.
Und Pipette rauf und runter, um gut zu mischen. Fügen Sie weitere 500 Mikroliter 1X HBSS hinzu, um die Oberseite zu versiegeln. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.
Den Überstand, der Myelin im Medium enthält, vorsichtig ansaugen, ohne das Zellpellet am Boden des Rohres zu stören. Fügen Sie 100 Mikroliter PBS, die 5% fetales Rinderserum enthalten, in das Pellet und setzen Sie die DRG-Zellen wieder aus. Fügen Sie dann Alpha-Maus CX3CR1 APC-Antikörper zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie im Dunkeln bei vier Grad Celsius für eine Stunde.
Waschen Sie die Zellen einmal mit fünf Milliliter PBS. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 360 mal G für acht Minuten bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie den Überstand, und setzen Sie dann das Zellpellet in 300 Mikroliter PBS für die Faktenanalyse wieder auf.
Nach intraperitonealen Injektionen von FK-bindendem Protein-Dimerisator AP in MaFIA-Mäuse zur Erschöpfung von Makrophagen gab es einen signifikanten Verlust an GFP-positiven Zellen in den DRGs der AP-behandelten Mäuse im Vergleich zu kontrollierten fahrzeugbehandelten Mäusen. Die Faktenanalyse zeigte eine erfolgreiche Erschöpfung der GFP-Hochpopulation bei AP-behandelten Mäusen und zeigte die hohe Qualität isolierter Zellen. 4 % der gesamten isolierten Zellen aus der DRG von fahrzeugbehandelten Tieren waren GFP-hohe Makrophagen.
Im Gegensatz dazu waren nur 0,4% der gesamten DRG-Zellen GFP-hohe Makrophagen in AP-behandelter Maus. Mechanisch isolierte DRG-Zellen von Wild-Mäusen wurden mit Alpha-Maus CX3CR1-APC-Antikörpern gefärbt. 6% der DRG-Zellen waren CX3CR1-positive Makrophagen.
Bei der Bewertung der Zelllebensfähigkeit mit Propidiumjodid ergab sich, dass mehr als 80 % der frisch isolierten DRG-Zellen lebensfähig waren. Wenn die unbefriedigende Zellausbeute festgestellt wird, kann eine unzureichende oder übermäßige Homogenisierung des DRG-Gewebes vermutet werden. Darüber hinaus kann die DRG-Sektion wiederholtes Üben für Anfänger erfordern.
Wahrscheinlich kann die Anwendung unseres Protokolls erweitert werden, um andere nicht-neuronale Zellen wie Satellitenzellen und T-Zellen zu untersuchen. Weitere Studien können notwendig sein, um die Wirksamkeit der Zellisolation zu bestätigen.
