Name: spectral reflectometric microscopy on myelinated axons in situ
Uploaded: 2018-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
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Diese Arbeit wurde durch die Institute der Grundlagenforschung (IBS-R015-D1) und grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) finanziert durch das Ministerium für Bildung (2017R1A6A1A03015642) unterstützt.

Alle chirurgischen Eingriffe wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Sungkyunkwan University angenommen.
1. die Probenvorbereitung
Hinweis: Autoklav alle chirurgischen Instrumente vor dem Umgang mit Tieren. Führen Sie alle chirurgische Leistung in einem Saal zu chirurgischen Eingriffen. Sterile op Kittel und Handschuhe sollten von allen Personal im OP jederzeit getragen werden.
<ol><li>
Gewebe-Fixierung
	<ol>
<li>Bereiten Sie zwei 10 mL-Spritzen, die jeweils mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer gefüllt.</li>
		<li>7-12-Wochen alten Maus (C57BL/6J oder jede Mauslinien mit beiderlei Geschlechts) durch die Gabe von einer Mischungaus aus Zoletil und Xylazin (1:1, 20 mg/kg) oder eine andere geeignete Anästhesie Regime (z.B., Mischung von 80 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg zu betäuben Xylazin) mit einer intraperitonealen Injektion.</li>
		<li>Sobald die Maus eine chirurgische Ebene der Anästhesie (Nutzung der Zehe Pinch-Response-Verfahren) erreicht hat, setzen Sie das Herz durch das Abschneiden der Haut und den Brustkorb mit einer Schere.</li>
		<li>Schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer kleinen Schere Blut ablassen und Durchspülen der PBS und PFA Lösung nacheinander durch die linke Herzkammer mit einer Nadel (Perfusion Rate = 4 mL/min, Volumen = 10 mL für jede Lösung). Hinweis: Die Maus wird steif, wenn der Vorgang erfolgreich abgeschlossen ist. Die Verwendung von Augensalbe oder Sterilisation ist nicht notwendig, da das Verfahren terminal ist. Die Fixierung Verfahren kann übersprungen werden. Dieser Schritt wird jedoch empfohlen, strukturelle Verformungen einschließlich mechanische Gewebeschäden und ischämischen axonale Schwellung zu minimieren. Finden Sie für weitere Details über Gewebe Fixierung im Artikel von Gage, G. J. Et al. 10
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung des Gehirns Slice
	<ol>
<li>Enthaupten Sie die Maus mit einer chirurgischen Schere durch den ventralen Thorax und Abdomen.</li>
		<li>Entfernen Sie die Kopfhaut und Periost mit einer entsprechend kleinen Schere bis vollständig aussetzen des Schädels.</li>
		<li>Brechen Sie die Stirnbein und schneiden Sie das Schädeldach entlang die sagittale Naht aus dem Hinterhauptsbein mit kleine Schere mit Sorgfalt nicht auf das Gehirn schädigen.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig das Schädeldach und die Dura Mater sequenziell mit feinen Pinzette.</li>
		<li>Extrahieren Sie das Gehirn mit einem weichen Plastiklöffel, kümmert sich nicht um das Gewebe zu beschädigen.</li>
		<li>Spülen Sie und genießen Sie die extrahierte Gehirn in einer 4 % PFA-Lösung für 30 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Schneiden Sie die feste Gehirn in 100-150 µm Abschnitte mit einem Vibratome. Hinweis: Für weitere Details auf der Gewebe-Vorbereitung finden Sie im Artikel von Segev Et al. 11. für nachfolgende Verfahren, das Gewebe sollte werden in Scheiben geschnitten in Abschnitte dünner als die Dicke der Abstandhalter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage des Gehirns Slice
	<ol>
<li>Jedes Gewebe Segment 1 Objektträger und 2 quadratischen Deckgläser (22 × 22 × 0,17 mm) vorbereiten.</li>
		<li>Eines der quadratischen Deckgläser in die Hälfte geschnitten (zwei rechteckige Stücke) mit einem Glasschneider.</li>
		<li>Befestigen Sie die beiden von der halbierten Deckgläser mit einem super-Klebstoff auf die Folie-Glas. Hinweis: Der Abstand zwischen den zwei halbierte Gläser sollte etwas größer als die Größe des Segments Gewebe.</li>
		<li>Ernten Sie die Gehirn-Scheibe mit einem Pinsel oder einer Pipette zu und legen Sie das Gewebe auf der Folie Glas zwischen den Abstandhalter. Achten Sie darauf, nicht das Gewebe Falten.</li>
		<li>100 μl PBS auf der Gewebeoberfläche zu verzichten.</li>
		<li>Legen Sie das Quadrat Deckglas auf der Oberseite des Gewebes. Einschluss von Luftblasen während dieser Phase zu vermeiden.</li>
		<li>Dichtung rund um das Deckglas mit einem Nagellack (oder alternativ geeigneter Klebstoffe) zur Verdampfung des PBS und Verunreinigung durch Staub während der anschließenden Bildbearbeitung Sitzung zu verhindern. Hinweis: In diesem Stadium kann der Experimentator pausieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kalibrierung
<ol><li>Schalten Sie das Mikroskop mindestens 1 h vor der Bildgebung erlauben thermische Stabilisierung des Lasers Quelle (siehe Tabelle der Materialien). Dann schalten Sie die Software für die Spektral Scannen (siehe Tabelle der Materialien) und klicken Sie auf erfassen , auf der Oberseite GUI (Abbildung 3a).
</li>
	<li>Schalten Sie den Software-Auslöser für die Weißlicht-Laser (WLL) und Photomultiplier Tube (PMT) (Abb. 3a).</li>
	<li>Wählen Sie den xyΛ-Modus auf das Drop-Down-Liste im Kauf-Modus, dann der Laser-Eingabemodus automatisch von Konstanten Prozent auf Konstanter Leistunggeändert. Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Automatische SP-Bewegung. Und legen Sie dann die spektrale Fenster Eingabe Laser auf 470-670 nm und die spektrale Schrittweite bis 4 nm auf Λ-Erregung Lambda Scannen Einstellungen (Abb. 3 b).</li>
	<li>Legen Sie die spektrale Bandbreite PMT auf 450-690 durch einen Doppelklick oder verschieben die Schieberegler für Spektralbereich (Abb. 3 c). Hinweis: Diesem Spektralbereich gehören die komplette Bandbreite der Eingangsquelle.</li>
	<li>Wählen Sie ein Eintauchen in Wasser Objektiv passend mit hoher numerischer Apertur (NA > 0,7) und geben einen Wert an die PMT und Laser macht AOBS Konfiguration und Live-Scan -Taste aktivieren. Schalten Sie den Strahlengang durch Reflexion in der AOBS Konfiguration (Abbildung 3d) überprüfen.</li>
	<li>Einen Referenz-Spiegel zu montieren (siehe Tabelle der Materialien) auf den Mikroskoptisch. Die Spiegelfläche sollte gegen das Objektiv konfrontiert werden. Wenn es nicht einfach, den Spiegel auf den Mikroskoptisch zu setzen ist, binden Sie einen Spiegel auf den flachen Teller (z. B. Folie Glas).</li>
	<li>Kontrolle der Mikroskoptisch die Brennebene auf der Spiegelfläche ausrichten.</li>
	<li>Passen Sie die PMT-Verstärkung und die Laserleistung, die unter Berücksichtigung den dynamischen Bereich des Detektors und ändern Sie den Eingabemodus Laser von Konstanten Prozent auf Konstanter Leistung. Hinweis: Wie üblich, eine PMT einen Gewinn von 500 (V) und eine relative Laserleistung von 0,1 % dienen bei 570 nm.</li>
	<li>In einem Pseudo-Farbmodus zu überprüfen, dass es keine Sättigung im gesamten Wellenlängenbereich zu bestätigen. Wenn Sättigung beobachtet wird, senken Sie die Laserleistung (Abb. 3a).</li>
	<li>Laufen Sie mit dem Lambda zu scannen .</li>
	<li>Entfernen Sie den Spiegel von der Bühne, und wiederholen Sie den gleichen Erwerb ohne eine Probe um die dunkle Referenz (d.h. dunkle Versatz) zu erhalten.</li>
	<li>Sichern Sie die Daten in einem Multistacked TIF -Format.</li>
</ol>(3) brange Bildaufnahme
<ol><li>Legen Sie das montierte Gewebe auf Mikroskoptisch. Um etwa das Gewebe auf der Brennebene der Objektivlinse auszurichten, verwenden Sie die Weitfeld-Fluoreszenz-Modus durch ein Okular.</li>
	<li>Mit der Live-Scan auf, Kontrolle der Mikroskoptisch ausrichten die Brennebene auf die Region des Interesses im Gewebe. Um die Hintergrundgeräusche aus dem Deckglas zu vermeiden, wählen Sie die Zielregion mindestens 15 μm Tiefe aus dem Glas-Gewebe-Interface.</li>
	<li>Erwerben Sie die spektrale Bildstapel für die Zielregion mit dem gleichen Verfahren wie in 2.1-2.10 beschrieben.</li>
	<li>Sichern Sie die Daten für das Gewebe und die dunklen Offset im Multistacked TIF -Format. Hinweis: In diesem Stadium kann der Experimentator pausieren.</li>
</ol>4. Verarbeitung und Analyse von Bildern
<ol><li>Öffnen Sie die spektralen Daten (multistacked TIF) für den Referenz-Spiegel und das Hirngewebe in ImageJ.</li>
	<li>Wählen Sie die ROIs (Regionen von Interesse) für das geöffnete Bild Stacks – den zentralen Bereich für den Referenz-Spiegel und das Segment von einem Axon Faser für das Hirngewebe.</li>
	<li>Die rohen Spektren für die ausgewählten ROIs durch laufende Bild → Stapel → erwerben Plot z-Profil im Menü ImageJ.</li>
	<li>Öffnen Sie die dunklen Offset Daten, eine für den Referenz-Spiegel und die anderen besessenen für das Hirngewebe genommen.</li>
	<li>Erwerben Sie die Spektren für die dunklen Offsets von laufenden Bild → Stapel → Plot z-Profil im Menü ImageJ.</li>
	<li>Speichern Sie alle erworbenen Spektren mittels Kopieren und Einfügen -Optionen. Hinweis: Für die brange Bildgebung ist die zentrale Bildfeld einfallenden optische Aberrationen minimieren empfohlen. Die Axon-Fasern können strukturell heterogenen entlang ihrer Länge sein. Daher empfiehlt sich den ROI auf einem kleinen Axon-Segment auswählen, in der Regel < 5 µm, teilweise-Volumen Artefakt zu minimieren.</li>
</ol>5. Basislinienkorrektur und brange Signalanalyse
<ol><li>Subtrahieren Sie die Offset Spektren aus den Spektren des Referenz-Spiegels und das Hirngewebe.</li>
	<li>Jedes Spektrum durch die Aufteilung der maximalen Intensität des Spektrums zu normalisieren.</li>
	<li>Teilen Sie das normalisierte Spektrum des Axons durch die normalisierten Spektrum des Referenz-Spiegels und subtrahieren Sie DC-Offset aus dem normalisierten Spektrum.</li>
	<li>Messen Sie die Wellenzahl Frequenz durch den Einbau der erworbenen Spektrum an einer sinusförmigen Kurve (siehe Tabelle der Materialien) und dann konvertieren Sie die erworbenen Wellenzahl, Periodizität durch Einnahme von Gegenseitigkeit.</li>
	<li>Konvertieren Sie die Wellenzahl Periodizität in den Axon Durchmesser unter Verwendung der Gleichung in Abbildung 4 c.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+and+low-angle+x-ray+diffraction+studies+of+the+nerve+myelin+sheath.">Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath.</a> Journal of Cell Biology. 3, (1957).</li><li>Blaurock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spaces+between+membrane+bilayers+within+PNS+myelin+as+characterized+by+X-ray+diffraction.">The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction.</a> Brain Research. 210, 383-387 (1981).</li><li>Shim, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).</li><li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., N&#228;gerl, U. 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L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+properties+of+the+myelin+sheath.">Anisotropic properties of the myelin sheath.</a> Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+nanoscale+optical+metrology+on+myelinated+axons+in+vivo.">Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 1832 (2017).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> JoVE. (112), e54024 (2016).</li><li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14, 593-599 (2017).</li><li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).</li></ol>

Die Autoren erklären konkurrierende Interessen: J. Kwon und M. Choi sind Erfinder der zum Patent angemeldete Technologie in diesem Artikel beschrieben.

Brange ist eine neue markierungsfreie imaging-Modalität basierend auf spektrale Interferometrie, die zum ersten Mal im Leben Markhaltige Axone der nanoskaligen Informationen bietet. In der aktuellen Übernahme-Protokoll ist die räumliche Auflösung für den Axon Durchmesser des Ordens 10 nm. Darüber hinaus nutzt brange der Größenordnungen niedriger Lichtdosis im Vergleich zu anderen super-Resolution-Microscopies; Somit ist es frei von Phototoxizität und Immunofluoreszenz. Brange böte eine neue Allee für nanoskali...

In den Säugetieren Nervensystem bietet Myelin rasche Nervenleitung und axonalen Integrität durch hüllt die Axon-Fasern mit vielschichtigen häutigen scheiden. Seine vielschichtige Struktur besteht aus abwechselnd nanoskaligen Dünnschichten bestehend aus Plasmamembranen (~ 5 nm), Zellflüssigkeit (~ 3 nm), und extrazellulären Raum (~ 7 nm)1,2. Optische Mikroskopie, einschließlich der jüngsten Höchstauflösung Mikroskopie, eignen sich nicht für die Beobachtung der nanoskaligen Myelin Dynamik aufgrund ihrer unzureichenden Auflösung aufgrund der optischen Beugung3,4,5. Obwohl Elektronenmikroskopie feine Details der Myelin Nanostruktur bereitstellen können, ist es nicht kompatibel mit den lebenden biologischen Systemen aufgrund sehr invasive Probe Vorbereitungen mit chemischen Fixierung und Ultrasectioning6,7 . Bis vor kurzem gab es keine Technik anwendbar, nanoskaligen Dynamik der Markhaltige Axone in Situzu beobachten.
Schain Et Al. berichtete zuvor, dass Markhaltige Axone bunte Lichtreflexion8aufweisen. Durch die Annahme der Spektralanalyse auf das reflektierte Licht, haben wir eine neue bildgebende Modalität für nanoskalige Bildgebung Markhaltige Axone, benannt spektrale Reflectometry (brange)9entwickelt. Brange basiert auf der Dünnschicht-Störungen, die in den mehrschichtigen Aufbau der Myelinscheide (Abbildung 1). Durch optische Simulation auf verschiedenen Axone haben wir gezeigt, dass das Reflexionsvermögen-Spektrum eine periodische Funktion der Wellenzahl und seiner Periodizität ist (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq1.jpg">) ist umgekehrt proportional zu den Axon-Durchmesser (d). Diese einfache Beziehung (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq2.jpg">) bietet einfache Quantifizierung der Axon Durchmesser aus den Daten der brange. Nutzen dies, offenbart wir das vorherrschende Axon prall unter milden traumatischen Hirnverletzungen in unserem vorherigen Bericht.
Die brange System basiert auf konfokalen Mikroskopie und besteht aus einer speziellen Laserquelle und Filter (Abbildung 2). Die Eingabequelle ist ein Weißlicht-Laser, Breitband spektrale Leistung für Infrarot-Regionen sichtbar. Für die Spektral Scan, das System ist ausgestattet mit zwei Akusto-optische Geräte: ein Akusto-optischen Durchstimmbare Filter (Aventurien) für die Bereitstellung einer ausgewählten Wellenlänge von Breitband-Eingangsquelle und eine Akusto-optischen Strahlteiler (AOBS) für die Führung der ausgewählten reflektiert Wellenlänge zum Detektor. Die Software für die Hyperspektrale konfokalen Mikroskopie bietet (siehe Tabelle der Materialien) eine anpassbare spektrale Scanoption nacheinander die Reflexion Bilder bei verschiedenen Wellenlängen Eingang erwerben. Darüber hinaus können die chromatische Aberration kritisch in der spektralen Messung beeinträchtigen. Daher ist ein Apochromat Objektiv empfohlen.
Der Hinweis Weißlicht-Laser erzeugen eine ungleichmäßige spektrale Leistung und die optischen Komponenten beeinflussen auch die spektrale Profil. Daher müssen die erworbenen Spektren für die anschließende Quantitative Analyse kalibriert werden. Eine geschützte Silberspiegel dient in der Regel als Referenz, die eine nahezu konstante Reflexion (> 97 %) bietet über den vollen und sichtbaren Bereich. Die erworbenen Spektren werden dann durch die Referenz-Spektren aus dem Spiegel unterteilt.
Die spektrale Schrittweite für die Spektral Scan bestimmt die Geschwindigkeit, Erwerb; Es muss daher optimiert werden. Wie eine größere Axon eine höhere spektrale Periode wurde, erfordert es feiner spektrale Probenahme. Zum Beispiel hat ein Axon mit einem Durchmesser von 10 µm, eines der größten physiologischen Axone spektrale beträgt ca. 8 nm. Nach Nyquist Sampling Kriterien, wir Beschäftigten die spektrale Samplingintervall von 4 nm um die physiologischen Axone in die Maus Nervengewebe zu decken. Dieser Ansatz dauert in der Regel über mehrere Sekunden für eine volle spektrale Scan und damit ist nicht geeignet für in-Vivo Anwendungen, wo stört die physiologische Bewegung (z.B. Atmung und Herzschlag) stabile spektralen Erwerb. Wir lösten vorher dieses Problem durch Instrumentieren maßgeschneiderte aufrechte Mikroskop, entworfen, um das gesamte Spektrum für jeden Punkt mit einem Array Spektrometer (Erwerb Geschwindigkeit ≈ 30 ms pro Pixel) zu erwerben.
In diesem Bericht beschreiben wir ein detailliertes Protokoll auf der brange Bildgebung auf einer festen Gehirn-Scheibe, die in einem kommerziellen Hyperspektrale Mikroskop ausgeführt werden können (siehe Tabelle der Materialien). Somit kann das Protokoll von Experimentatoren ohne Fachkenntnisse in optischen Instrumenten erfolgen. Wir decken auch die potenziellen Probleme und Problembehandlung für Erfassung und Analyse von Daten der brange.

<table><tbody><tr><td>Glass cutter</td><td>-</td><td>-</td><td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>-</td><td>-</td><td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td></tr><tr><td>Apochromat objective 40&amp;times;, NA 1.1</td><td>Leica Microsystems</td><td>15506357</td><td>Water-immersion type</td></tr><tr><td>Fluoromyelin Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>F34651</td><td>Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used.</td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP8</td><td>Refer to the &quot;Configuration of microscope&quot; in Introduction Section for details.</td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS-X</td><td>-</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>Coated with protected silver.</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Life technologies</td><td>14190-136</td><td>-</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Biosolution</td><td>BP031a</td><td>4% v/v in PBS</td></tr><tr><td>Cover slip</td><td>Thermo Fisher</td><td>3306</td><td>Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm)</td></tr><tr><td>Slide glass</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>5116-20F</td><td>Thickness: ~1 mm</td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Henkel</td><td>Loctite 406</td><td>Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact.</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Brainetree Scientific</td><td>BS-8000 DUAL</td><td>-</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200S</td><td>-</td></tr><tr><td>White-light laser</td><td>NKT photonics</td><td>EXB-6</td><td>EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6.</td></tr></tbody></table>

spectral reflectometric microscopy on myelinated axons in situ

In einem Säugetier Nervensystem bietet Myelin eine elektrische Isolierung durch hüllt die Axon-Fasern in einer vielschichtigen Spirale. Inspiriert durch seine hoch organisiert subzelluläre Architektur, entwickelten wir vor kurzem eine neue bildgebende Modalität, benannt spektrale Reflectometry (brange), die noch nie da gewesenen markierungsfreie nanoskaligen Bildgebung von live Markhaltige Axone in Situermöglicht. Das Prinzip beruht auf nanostruktureller Auskunft durch die Analyse der Reflexion Spektrum der vielschichtigen subzelluläre Struktur. In diesem Artikel beschreiben wir ein detaillierte Schritt für Schritt-Protokoll für die Durchführung einer grundlegenden brange Bildgebung der nervösen Gewebe mit einem kommerziellen konfokale mikroskopische System, ausgestattet mit einem Weißlicht-Laser und einen durchstimmbaren Filter. Wir decken die Verfahren der Probenvorbereitung, Erwerb von Spektraldaten und Bildverarbeitung für nanostruktureller Informationsbeschaffung.

Nach dem Protokoll wurde eine feste Gehirn-Scheibe mit exogenen beflecken, einem Myelin-targeting Fluorophor vorbereitet (siehe Tabelle der Materialien). Brange Bildgebung erfolgte auf die Gehirn-Scheibe mit einem kommerziellen Hyperspektrale confocal Mikroskop in Verbindung mit konfokale Fluoreszenz imaging (Abb. 4a). Für brange wurde Eingangs optischen Intensität auf 5 µW/µm2 mit einer Pixel-Verweilzeit von ~ 1 µs festgelegt...

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Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Spektrale Reflectometric Mikroskopie auf Markhaltige Axone In Situ

Hier präsentieren wir Ihnen eine Schritt für Schritt Protokoll für imaging Markhaltige Axone in einer festen Gehirn-Scheibe mit imaging-Technik basierend auf spektrale Reflectometry markierungsfreie Nanobereich.

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

7.3K Aufrufe.  Sungkyunkwan University. Hier präsentieren wir Ihnen eine Schritt für Schritt Protokoll für imaging Markhaltige Axone in einer festen Gehirn-Scheibe mit imaging-Technik basierend auf spektrale Reflectometry markierungsfreie Nanobereich.

Serie: Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Akute Dissoziation von Neunauge retikulospinale Axone in den Aufnahme von der Trennfläche Membran einzelner Funktions präsynaptischen aktivieren

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Forschung

Neurowissenschaften

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Experimentelle Demyelinisierung und Remyelinisierung von Murine Rückenmark von Focal Injektion von Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

Visualisierung von motorischen Axon Navigation und Quantifizierung der Axon Arborization In Mausembryonen mit Fluoreszenz-Lichtblattmikroskopie

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Biotechnik

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

Vorbereitung und Immunostaining Myelinating organotypischen zerebelläre Slice Kulturen

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

Bildgebung und Analyse des Neurofilamenttransports in verbraucheten Maus-Tibialnerv

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Measuring Properties of the Membrane Periodic Skeleton of the Axon Initial Segment using 3D-Structured Illumination Microscopy (3D-SIM)

The axon initial segment (AIS) is the site at which action potentials initiate and constitutes a transport filter and diffusion barrier that contribute to the maintenance of neuronal polarity by sorting somato-dendritic cargo. A membrane periodic skeleton (MPS) comprising periodic actin rings provides a scaffold for anchoring various AIS proteins, including structural proteins and different ion channels. Although recent proteomic approaches have identified a considerable number of novel AIS components, details of the structure of the MPS and the roles of its individual components are lacking. The distance between individual actin rings in the MPS (~190 nm) necessitates the employment of super-resolution microscopy techniques to resolve the structural details of the MPS. This protocol describes a method for using cultured rat hippocampal neurons to examine the precise localization of an AIS protein in the MPS relative to sub-membranous actin rings using 3D-structured illumination microscopy (3D-SIM). In addition, an analytical approach to quantitively assess the periodicity of individual components and their position relative to actin rings is also described.

Measuring Properties of the Membrane Periodic Skeleton of the Axon Initial Segment using 3D-Structured Illumination Microscopy 3D-SIM

The present protocol describes a method to visualize and measure actin rings and other components of the membrane periodic skeleton of the axon initial segment using cultured rat hippocampal neurons and 3D-structured illumination microscopy (3D-SIM).

Messung der Eigenschaften des periodischen Membranskeletts des Axon-Anfangssegments mittels 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM)

The axon initial segment (AIS) is the site at which action potentials initiate and constitutes a transport filter and diffusion barrier that contribute to ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature vibrations of molecules. However, these vibrational signatures are also characteristic of molecules within anatomical tissue such as the brain, making it increasingly useful and applicable for Neuroscience applications. For example, CARS can measure lipids by specifically exciting chemical bonds within these molecules, allowing for quantification of different aspects of tissue, such as myelin involved in neurotransmission. In addition, compared to other techniques typically used to quantify myelin, CARS can also be set up to be compatible with immunofluorescent techniques, allowing for co-labeling with other markers such as sodium channels or other components of synaptic transmission. Myelination changes are an inherently important mechanism in demyelinating diseases such as multiple sclerosis or other neurological conditions such as Fragile X Syndrome or autism spectrum disorders is an emerging area of research. In conclusion, CARS can be utilized in innovative ways to answer pressing questions in Neuroscience and provide evidence for underlying mechanisms related to many different neurological conditions.

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Visualizing myelination is an important goal for many researchers studying the nervous system. CARS is a technique that is compatible with immunofluorescence that can natively image lipids within tissue such as the brain illuminating specialized structures such as myelin.

Kohärente Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS) Anwendung zur Bildgebung der Myelinisierung in Gehirnschnitten

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...