Wir danken Drs. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris und Olga Tschumakowa für ihre Unterstützung. Die FlexStation 3-System ist Teil des UTHSC Cytodynamic Imaging Facility. Wir danken auch Drs. Ardem Patapoutian und Michael Bandell vom Scripps Research Institute und Genomics Institute der Novartis Research Foundation (GNF) für die Bereitstellung der HEK293-hTRPA1 stabile Zelllinie. Die Forschung wird zum Teil durch Zuschüsse aus NIH (GM081658 zu MXZ) und Texas Medical Center Digestive Diseases Center (HH) und Mission Connect / TIRR Foundation (HH) unterstützt.

1. Zellpräparationen in 96-Well-Platten Für HEK293-Zellen transient mit menschlichen TRPA1 cDNA trasfected <ol><li> HEK293-Zellen sind für 1-2 Tage in Minimal Essential Dulbecco Medium (DMEM) mit 4,5 mg / ml Glucose (Thermo Scientific, SH3002201), mit 10% Hitze-inaktiviertem fetalem Kälberserum (Invitrogen, 16000-044) ergänzt, 50 Einheiten angewachsen / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin (Invitrogen, 15140-163). Am Tag der Transfektion sollten die Zelldichte zu erreichen 70-90%. </li><li> Coat 96-Well-Platten mit einer Pipette 50 pl Poly-L-Ornithin (Sigma P3655, 20 pg / ml in sterilem destilliertem Wasser) in jede Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C für mindestens 15 min. Spülen Sie jede Vertiefung einmal mit Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) ohne Mg 2 + und Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). Die Platte kann in der Zellkultur Motorhaube für ein paar Stunden verlassen werden. </li><li> Für jede Vertiefung einer 96-Well-Platte in ein 1,5-ml Eppendorf-Röhrchen 0,2 ug cDNA in 25 ul OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070) zu verdünnen. Scale up anteilig nach der Anzahl von Brunnen, die von der gleichen cDNA transfiziert werden. Auch in einem separaten 1,5-ml Eppendorf-Röhrchen 0,4 ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) in 25 ul OPTI-MEM für jeden gut transfizieren zu verdünnen. Scale-up dieser nach der Gesamtzahl der Brunnen transfiziert werden. </li><li> Kurz Wirbel der verdünnten cDNA und Lipofectamine 2000 und lassen Sie sie bei Zimmertemperatur sitzen für ca. 5 min. </li><li> Übertragen eines gleichen Volumens der verdünnten Lipofectamine 2000 an die Röhre, die verdünnte cDNA, Wirbel enthält, und lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur stehen lassen für 15 min bis 2 Stunden. Während dieser Zeit, übertragen Sie die cDNA / Lipofectamine 2000 Mischung bei 49 ul / well auf die poly-L-Ornithin beschichteten Platte. </li><li> Trypsinize der HEK293-Zellen (Schritt 1,1), count Zelldichte mit einer Zählkammer oder Gräfin automatisierte Zellzahl (Invitrogen, C10227), und übertragen die gewünschte Menge an Zellen (in der Regel etwa ~ 125,000-150,000 Zellen / well) zu einem 15-ml sterile konisch-bottom Zentrifugenröhrchen. Bei 1000 x RPM für 5 min. Die Zellen bei ~ 1,250,00-1,500,000 Zellen / ml in DMEM Kulturmedium mit 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum, aber ohne Antibiotika. </li><li> Dispense 98 ul Zellsuspension in jede Vertiefung, dass die cDNA-Lipofectamine 2000 Mischung mit einem Mehrkanal-Pipette oder die MICROFILL Microplate Dispenser (Bio-Tek) enthält. Lassen Sie die Platte in der Haube sitzen für mindestens 30 min, bevor es auf die befeuchtete Zellkulturbrutschrank. Bei 37 ° C, 5% CO 2 für 20-44 Stunden. </li></ol> Für HEK293-Zellen stabil exprimiert TRPA1 <ol start="8"><li> Folgen Sie Schritt 1.2 zu beschichten 96-Well-Platten. </li><li> Die induzierbaren HEK293-hTRPA1 Zelllinie wurde freundlicherweise von Dr. A. Patapoutian (The Scripps Research Institute) zur Verfügung gestellt und gepflegt in dem gleichen Medium wie die Wildtyp-HEK293-Zellen (Schritt 1,1), aber ergänzt mit 5 pg / ml Blasticidin (Invitrogen, A1113902) und 50 pg / ml Hygromycin B (Invitrogen, 10687010). Wenn die Zelldichte etwa 90% erreicht, trypsinize Zellen zählen Zelldichte und zentrifugieren Sie die gewünschte Menge an Zellen bei 1000 x RPM für 5 min. Die Zellen in einer Dichte von ~ 1.000.000 Zellen / ml in der gleichen Kulturmedium mit Doxycyclin (Fisher, BP26535, 0,25 pg / ml) ergänzt. </li><li> Dispense die Zellsuspension auf Poly-L-Ornithin beschichteten Platten bei 100 ul / well mit einem Mehrkanal-Pipette oder die MICROFILL (Bio-Tek). Lassen Sie die Platte in der Haube sitzen für mindestens 30 min, bevor es auf die befeuchtete Zellkulturbrutschrank. Bei 37 ° C, 5% CO 2 für 16 bis 24 Stunden. </li></ol> 2. Lösungen <ol><li> Hanks Salzlösung (HBSS) ist als die extrazelluläre Lösung verwendet. Es enthält (in mM): 137 NaCl, 5,4 KCl, 0,25 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 1,3 CaCl 2, 1,0 MgSO 4, 1,0 MgCl 2, 10 Glucose, 10 HEPES mit pH-Wert eingestellt auf 7,4 mit 1 N NaOH). </li><li> Fluo-4-Assay-Puffer enthält 2 mM in HBSS Probenecid. Machen Sie 250 mM Lager Probenecid (Sigma, P8761) in 0,5 N NaOH. Verdünnen, um HBSS bei einem Verhältnis von 1:125. Nachstellen pH auf 7,4 mit 1 N HCl. </li></ol> 3. Zell-Beladung mit Fluo-4 AM <ol><li> 1 mg Fluo-4 AM (Invitrogen, F14202) in 912 ul wasserfreiem DMSO zu einer Stammlösung von 1 mM zu machen. Die Fluo-4 AM Stammlösung bei -20 ° C für mindestens einen Monat gelagert werden. </li><li> Mix 10 ul 1 mM Fluo-4 AM mit 10 ul Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (w / v) Lösung in DMSO) und dann den gesamten Inhalt auf 5 ml Fluo-4-Assay-Puffer (Schritt 2,2) ergänzt mit 0,1% Rinderserumalbumin (Sigma, A9418). </li><li> Wash-Zellen in 96-well-Platten kultiviert (Schritt 1,7 oder 1,10) mit HBSS auf 80 ul / well 2 mal mit einem Mikrotiterplatten-Scheibe (wie ELx405TM von Bio-Tek). </li><li> Fügen Sie die Fluo-4 AM loading-Lösung (Schritt 3,2) bei 50 ul / Vertiefung mit einem Mehrkanal-Pipette oder die MICROFILL (Bio-Tek) und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Wash-Zellen 3 mal mit dem Fluo-4-Assay-Puffer (Schritt 2.2.) Mit dem ELx405TM Mikroplatten Washer. Nach der letzten Waschung, verlassen 80 ul der Fluo-4-Assay-Puffer in jede Vertiefung. </li></ol> 4. Herstellung der Verbindung Platte <ol><li> Während der 1 Std. Zelle Belastungsdauer, bereiten eine Reihe von 3x Verdünnungen von Agonisten (oder Antagonisten) 3x des gewünschten Endkonzentrationen in der Fluo-4-Assay-Puffer. </li><li> Pipette 250-300 ul der verdünnten Verbindung Lösungen für eine 96-Well-Platte Verbindung. Ordnen Sie die serielle Verdünnungen einer Verbindung und die entsprechenden positiven und negativen Kontrollen in der gleichen Spalte der Verbindung Platte haben, wann immer es möglich ist, weil FlexStation 3 lautet einer einzigen Spalte zu einer Zeit. </li></ol> 5. Mikrotiterplatten in FlexStation 3 <ol><li> Schalten Sie das System (FlexStation 3, Computer, und die SoftMax Pro 5.2-Software) </li><li> Sparen Sie das Experiment mit einem neuen Dateinamen. Auf der Set-up, wählen FLEX-Modus und geben Sie die folgenden Werte: </li></ol> Protokoll Nr. 1, agonistische Wirkung <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table1.jpg" alt="Tabelle 1" /> Protokoll Nr. 2, Antagonist Wirkung <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table2.jpg" alt="Tabelle 2" /><ol start="3"><li> Legen Sie einen neuen Tipp-Box, Verbindung Platte und das Lesen Platte auf die entsprechenden Fächer in FlexStation 3 und klicken Sie auf &quot;read&quot;-Taste. Die FlexStation 3 wird eine Spalte in einer Zeit gelesen, und fügen Sie Verbindungen zu den vorprogrammierten Zeitpunkten ohne Unterbrechung der Lektüre. Es dauert ca. 3 min (5 min zu Protokoll Nr. 2) zu Ende lesen eine Spalte und die Maschine wird weiter in die nächste Spalte mit der Verbindung Ergänzungen durchgeführt, wie durch den Benutzer in Schritt 5.2 programmiert, bis alle Spalten gelesen werden gelesen. </li></ol> 6. Datenanalyse <ol><li> Experimentelle Daten können verarbeitet werden direkt über die SoftMax Pro 5.2 Software oder kopiert und in einem beliebigen Tabellenkalkulationsprogramm wie Microsoft Excel werden. Konzentrations-Wirkungs-Kurve eines TRPA1 Agonist Flufenaminsäure (FFA) wird unter Verwendung der folgenden kleinsten Quadrate Routine. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq1.jpg" alt="Gleichung 1" /> , Wobei Y der beobachteten Reaktion ist, Y max die normierte maximale Reaktion ist, C die entsprechenden Wirkstoffkonzentration ist, EC 50 die Konzentration, die eine halbmaximale Reaktion hervorgerufen, und n H ist die scheinbare Hill-Koeffizient. Konzentrations-Hemmung Kurve für einen vermeintlichen TRPA1 Antagonist Verbindung A wird durch die Verwendung einer festen Konzentration von FFA (100 uM), und die schrittweise Erhöhung der Konzentration der Verbindung A IC 50-Wert der Verbindung A wird von der kleinsten Quadrate, die wie folgt berechnet erhalten Gleichung. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq2.jpg" alt="Gleichung 2" /> , Wobei Y der beobachteten Reaktion und Y max ist Peak-Ansprechen normalisiert [Ant] ist die entsprechende Verbindung A die Konzentration, ist IC 50 der Antagonist-Konzentration, die eine halbmaximale Hemmung der FFA-evozierte produziert und n H ist die scheinbare Hill Koeffizient. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: TRPA1 ist ein Ca 2 +-permeable Kationen-Kanal, Aktivierung, die Calcium-Einstrom, die von der Ca 2 +-sensitiven Farbstoffs, Fluo-4 (1-2) nachgewiesen werden kann führt. Ein HEK293-hTRPA1 stabile Zelllinie wurde verwendet, um die Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen von TRPA1 Agonisten und Antagonisten zu studieren. Die Zellen wurden mit Fluo-4 AM geladen, platziert in 80 ul des Assay-Puffer und liest mit FlexStation 3. Nach der Aufnahme der Grundlinie Fluoreszenz für 30 s wurden 40 ul einer Verdünnungsreihe des TRPA1 Agonist, FFA, jeweils 3x von der gewünschten Endkonzentration, um die Zellen durch ein Multi-Channel-Pipette hinzugefügt enthalten, da ein Teil der Fluidik-Modul von FlexStation 3. Die Fluoreszenz-Änderungen wurden für weitere 180 s. überwacht (- F 0 F), wo F und F 0 sind Fluoreszenz-Werte zum Zeitpunkt der Zins-und dem Beginn der Lektüre, bzw. die relative Fluo-4 Fluoreszenz-Änderungen für jedes Well wurden als AF = ausgedrückt. Vertreter Spuren der Zeit Kurse zur Fluoreszenz Veränderungen als Reaktion auf eine Reihe von FFA-Konzentrationen sind in Abb.. 1. Hinweis für die letzten vier FFA-Konzentrationen, wobei die maximale Reaktion Ebenen ähnlich sind, die Aktivierung Kinetik deutlich schneller an der höher ist als an der unteren FFA-Konzentrationen ist. Daher unterscheiden diese Unterschiede, die Konzentration - Wirkungs-Beziehung wurde durch Messung der Anfangsgeschwindigkeiten (Steigung) der Fluoreszenz, der bei Zugabe verschiedener Konzentrationen von FFA (Abb. 2) konstruiert. Die Hälfte der maximalen Wirkungive Konzentration (EC 50) der FFA war entschlossen auf 55,4 uM (n = 3). Um zu testen, die vermeintliche TRPA1 Antagonist, Verbindung A, führten wir ein ähnliches Experiment mit dem Protokoll Nr. 2 (Schritt 2). In diesem Fall wurden eine Reihe von Verdünnungen des Antagonisten bei 30 s (40 ul von 3x gewünschten Endkonzentrationen) zugegeben und die FFA wurde 180 s später (60 l bei 300 uM für eine endgültige Konzentration von 100 pM) aufgenommen. Compound A dosisabhängig reduziert die Reaktion der Zellen auf TRPA1 FFA mit einer Hälfte der maximalen Hemmkonzentration (IC 50) von 4,3 uM (n = 3) (Abb. 2). <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Konzentrations-abhängige Aktivierung des menschlichen TRPA1 durch FFA. Die Spuren sind FFA-evozierte Anstieg der Fluoreszenz im Laufe der Zeit (nur Reaktionen in den ersten 60 s gezeigt werden zur besseren Veranschaulichung der schnellen Kinetik der FFA-evozierte Potentiale). Bitte beachten Sie, dass bei höheren Konzentrationen FFA Fluoreszenzerhöhung evoziert mit einer viel schnelleren kinetischen als bei niedrigeren Konzentrationen, obwohl der Peak-Fluoreszenz ähnlich sind. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2 Konzentration -. Wirkungs-Beziehungen für FFA-induzierte Fluoreszenz verändern und Verbindung A-induzierten Hemmung der FFA Reaktion in menschlichen TRPA1 stabil in HEK293 Zellen exprimiert. Δ, die Konzentration - Wirkungs-Beziehung der FFA wurde durch Messung der Anfangsgeschwindigkeiten (Steigung) der normierten Fluoreszenz-Anstieg bei Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von FFA bestimmt. O, Konzentrations-Wirkungs-Beziehung der Inhibition der FFA-evozierte Kalzium Antwort von einem vermeintlichen TRPA1 Antagonist Verbindung A.

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Assay Drug Dev Technol.</a> 5, 191-203 (2007).</li><li>Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Intrazelluläre Ca 2 + spielt eine wichtige Rolle in vielen physiologischen und pathologischen Bedingungen, wie die Freisetzung von Neurotransmittern (3), kardiale Aktionspotential (4), Muskelzelle Kontraktion (5), Zell-Signaltransduktion (6-7), und excitotoxic Zelltod ( 8). Die Messung der intrazellulären Ca 2 +-Spiegel hilft, funktionelle Veränderungen der Ca 2 +-permeable Kanäle in der Plasmamembran oder intrazellulären Organellen und der Beitrag der Aufklärung Ca 2 +...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> FlexStation 3 </td><td> Molecular Devices </td><td> FLEX3 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Well, FlexStation Pipettenspitzen </td><td> Molecular Devices </td><td> 9000-0912 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Well-Platten </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 655090 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Well Klare Flachbodenplatten </td><td> Costar </td><td> 3595 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12430-104 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4 AM </td><td> Invitrogen </td><td> F14202 </td><td></td></tr><tr><td> PluronicF-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-Ornithin </td><td> Sigma </td><td> P36551 </td><td></td></tr><tr><td> Probenecid </td><td> Sigma </td><td> P8761 </td><td></td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td></td></tr></tbody></table>

cell-based calcium assay for medium to high throughput screening of trp channel functions using flexstation 3

Die Molecular Devices &quot;FlexStation 3 ist ein Tischgerät Multi-Mode Mikroplatten-Reader mit einer automatisierten Fluoreszenz-Messung in Multi-Well-Platten. Es ist ideal für mittel-bis High-Throughput-Screens in einem akademischen Umfeld. Es verfügt über einen integrierten Fluid-Transfer-Modul mit einer Multi-Channel-Pipette und die Maschine liest eine Spalte in einer Zeit, zur Fluoreszenz Veränderungen einer Vielzahl von fluoreszierenden Reagenzien-Monitor ausgestattet. Zum Beispiel hat FlexStation 3 wurde verwendet, um die Funktion der Ca 2 +-permeable Ionenkanäle und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren durch die Messung der Veränderungen der intrazellulären freien Ca 2 +-Spiegel zu studieren. Transient receptor potential (TRP)-Kanäle sind eine große Familie von nicht selektiven Kationen-Kanäle, die eine wichtige Rolle spielen in vielen physiologischen und pathophysiologischen Funktionen. Die meisten der TRP-Kanäle sind Kalzium durchlässig und induzieren Calcium-Einstrom bei Aktivierung. In diesem Video zeigen wir die Anwendung der FlexStation 3, um die pharmakologische Profil der TRPA1 Kanal, einen molekularen Sensor für zahlreiche schädliche Reize zu studieren. HEK293-Zellen transient oder stabil exprimieren menschliches TRPA1 Kanäle, in 96-well-Platten kultiviert, sind mit einem Ca 2 +-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4, und Echtzeit-Fluoreszenz-Veränderungen in diesen Zellen geladen werden, vor und während der Anwendung gemessen ein TRPA1 Agonist mit dem FLEX-Modus des FlexStation 3. Die Wirkung eines mutmaßlichen TRPA1 Antagonisten wurde ebenfalls untersucht. Die Daten stammen aus der SoftMax Pro-Software übertragen, um Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen von TRPA1 Aktivatoren und Inhibitoren konstruieren.

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Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Dieses Video gibt einen detaillierten Protokoll für die Untersuchung der pharmakologischen Profil des menschlichen TRPA1 Kanäle mit FlexStation 3. Das Protokoll umfasst Einzelheiten Zellpräparation, Farbstoff Laden und Betrieb der Mikroplatten-Reader, FlexStation 3.

Zellbasierte Calcium-Assay für Mittel-bis High-Throughput-Screening von TRP-Kanal-Funktionen mit FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

cell-based-calcium-assay-for-medium-to-high-throughput-screening-trp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.0K Aufrufe.  The University of Texas Health Science Center at Houston. Dieses Video gibt einen detaillierten Protokoll für die Untersuchung der pharmakologischen Profil des menschlichen TRPA1 Kanäle mit FlexStation 3. Das Protokoll umfasst Einzelheiten Zellpräparation, Farbstoff Laden und Betrieb der Mikroplatten-Reader, FlexStation 3.

Serie: Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Forschung

Biotechnik

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) für das Hochdurchsatz-Screening-Antimykotikum

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper and cystine, with either copper nanoparticles (CNPs) or copper sulfate contributing the metallic component. Synthesis is carried out in liquid under biological conditions (37 &#176;C) and the self-assembled composites form after 24 hr. Once formed, these composites are highly stable in both liquid media and in a dried form. The composites scale from the nano- to micro- range in length, and from a few microns to 25 nm in diameter. Field emission scanning electron microscopy with energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) demonstrated that sulfur was present in the NP-derived linear structures, while it was absent from the starting CNP material, thus confirming cystine as the source of sulfur in the final nanocomposites. During synthesis of these linear nano- and micro-composites, a diverse range of lengths of structures is formed in the synthesis vessel. Sonication of the liquid mixture after synthesis was demonstrated to assist in controlling average size of the structures by diminishing the average length with increased time of sonication. Since the formed structures are highly stable, do not agglomerate, and are formed in liquid phase, centrifugation may also be used to assist in concentrating and segregating formed composites.

Here we present a protocol to synthesize novel, high-aspect ratio biocomposites under biological conditions and in liquid media. The biocomposites scale from nanometers to micrometers in diameter and length, respectively. Copper nanoparticles (CNPs) and copper sulfate combined with cystine are the key components for the synthesis.

Generation skalierbar, Metallic Hochseitenverhältnis Nanokomposite in einer biologischen Flüssigmedium

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

Hochdurchsatz-Identifizierung von Bakterien abstoßenden Polymere für medizinische Geräte

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain selection and by developing bioprocess parameters. Shake flasks have been used for this purpose. They, however, lack the capability to control the process parameters such as pH and dissolved oxygen (DO). This limitation can be overcome with the help of an automated micro-bioreactor. These bioreactors mimic cultivation at a larger scale. One of the major advantages of this system is the integration of the Design of Experiment (DOE) in the software. This integration enables establishing a design where multiple process parameters can be varied simultaneously. The critical process parameters and optimum bioprocess conditions can be analyzed within the software. The focus of the work presented here is to introduce the user to the steps involved in process design in the software and incorporation of the DOE within the cultivation run.

Here, we present a detailed procedure to run a Design of Experiment in an automated micro-bioreactor followed by cell harvest and protein quantification using a Protein A column.

Prozessoptimierung mit automatisierten Mikro-Bioreaktoren mit hohem Durchsatz in der chinesischen Hamster-Ovarialzell-Kultivierung

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

High-Throughput Identifikation der Resistenz gegen Pseudomonas syringae pv. Tomate in Tomaten mit Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...