Die Autoren möchten den Post Baccalaureate Scholars Program Office und Novartis Institutes for BioMedical Research als Ganzes für die Finanzierung dieser Studie danken.

1. Vorbereitung der Zellen
Hinweis: Dieses Protokoll, einschließlich der Datengenerierung, verwendet HEK293 Zellen mit einem Baculovirus Codierung NR1 und NR2A Zellen ausgestrahlt.
<ol><li>Die entsprechende Anzahl an HEK293 Zellen Saatgut und NR1 und/oder NR2A Virus am entsprechenden Endkonzentrationen (1,00 µL) hinzufügen. Verwenden Sie für ein 384-Well-Platte 10.000 Zellen/Brunnen in einem Endvolumen von 30 µL.</li>
	<li>Alternativ HEK293-NR1-NR2A Samenzellen über die entsprechende Zellenzahl und Volumen (für ein 384-Well-Platte, Verwendung 10.000 Zellen/Brunnen in einem Endvolumen von 30 µL). Tetracyclin in einer Konzentration von 2 µg/mL zu induzieren NR2A Ausdruck und fügen Sie den zusammengesetzten Schutz hinzufügen (100 µM MDL105, 519 oder 5 µM CGP07066724).</li>
	<li>Hinweis: Das Baculovirus Codierung NR1 und NR2 sollte eine ungefähre Titer zwischen 5 x 10-9 - 10 x 109 infektiösen Einheiten pro Milliliter24haben.</li>
</ol>2. Messung der NMDA-Rezeptor-Aktivität
<ol><li>Bereiten Sie eine 384-Well-Platte mit HEK293 Zellen mit NR1/NR2 oder HEK293-NR1-NR2A Zellen in Anwesenheit von entweder schützende Verbindung ausgestrahlt. Verwenden Sie eine klare Boden, schwarzer Rahmen, Poly-D-Lysin beschichtete Platte. Hinweis: Schutz mit 100 µM MDL105, 519 wird verwendet, um die Empfindlichkeit zu Glycin, während 5 µM verleihen CGP070667 wird verwendet, um die Empfindlichkeit gegenüber Glutamat zu verleihen.</li>
	<li>16 Stunden (über Nacht) inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 .</li>
	<li>Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und entsorgen Sie sanft die Zelle Medien durch die Verlangsamung, spiegeln die Platte über eine kompatible Bioabfälle Container. Tippen Sie die Platte auf ein Papiertuch zu reinigen die Medien Kanten der Platte und entwässern alle übrigen Medien vorsichtig an.</li>
	<li>Bereiten Sie den calcium6-Farbstoff durch Gefäss-eine Phiole mit calcium6 Farbstoff (1 Plattengröße) in 10 mL Inkubation Puffer (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM Probenecid). 2 Stunden bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren Sie Platte.</li>
	<li>Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und lassen Sie die Zellen, die für 10 Minuten auf Raumtemperatur anpassen.</li>
	<li>Gießen Sie vorsichtig, des calcium6-Farbstoffes, wie unter Punkt 2.3 beschrieben und 30 µL testpuffer (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1,8 mM CaCl2, 1 mM Probenecid).</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.6 zweimal für eine Gesamtmenge von 3 Wäschen. Lassen Sie 30 µL testpuffer auf die Zellen nach dem letzten waschen.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen für 5 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Liganden-Platte machen ein 4-fold Lager von 400 µM Glycin und 400 µM Glutamat (Endkonzentration von 100 µM; optimale Konzentration des Liganden ermittelt werden, wie unten beschrieben). Übertragen Sie ein Minimum von 25 µL des Liganden bestand in einem V-Boden-384-Well-Platte.</li>
	<li>Laden Sie die Liganden Platte und Zellplatte in FDSS (funktionelle Drug Screening-System).</li>
	<li>Die Baseline-Fluoreszenz (Fo) der Zellplatte für 30 Sekunden zu messen. Übertragen Sie 10 µL der Liganden bestand in der Zellplatte mit FDSS Abgabe Funktion und Maßnahme der Kalzium-Fluss durch die Aufnahme calcium6-Farbstoff Fluoreszenz für 5 Minuten.</li>
	<li>Berechnen Sie die maximale Fluoreszenz-Verhältnis dividiert die maximale Fluoreszenz durch die Basislinie Fluoreszenz (Fmax/fo) gewonnen.</li>
</ol>(3) Optimierung der NMDAR Ausdruck Niveaus
<ol><li>Um die optimale Menge an Baculovirus nutzen zu ermitteln, führen Sie eine Titrierung NR1 und NR2A Viren. Bereiten Sie eine 384-Well-Platte mit HEK293 Zellen (Empfehlung von 10.000 Zellen/gut, 30 µL der Medien) und umfassen Sie die Schutz-Verbindungen, wie unter Punkt 2.1 beschrieben.</li>
	<li>Fügen Sie unterschiedliche Mengen des Virus NR1 in verschiedenen Reihen der Platte (zum Beispiel: Fügen Sie 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0,5 µL 0.25 µL bzw. in den Reihen A-E). Fügen Sie Duplikate für Korrektheit der Daten.</li>
	<li>Fügen Sie unterschiedliche Mengen an das NR2A-Virus in verschiedenen Spalten der Platte (zum Beispiel: Fügen Sie 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0,5 µL 0.25 µL bzw. in den Reihen A-E). Fügen Sie Duplikate für Korrektheit der Daten.</li>
	<li>16 Stunden (über Nacht) inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 .</li>
	<li>Bestimmen Sie die optimale Verhältnis und die Höhe der NR1 und NR2A Viren durch Ausführen einer Kalzium-flussmessung FDSS (siehe oben).</li>
</ol>(4) Liganden Titration
<ol><li>Bereiten Sie die Zellen, wie unter Punkt 2.3 beschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie Verdünnungen von jeder Ligand in Anwesenheit von Sättigung Konzentrationen (100 µM vor) des anderen Liganden als eine 4-fold Stammlösung. Zum Beispiel: für eine 10 µM Abschlusstest Konzentration von Glycin, bereiten Sie eine 40 µM-Stammlösung von Glycin einschließlich 400 µM Glutamat.</li>
	<li>Fahren Sie mit der Messung von FDSS wie in Schritt 2.11 beschrieben.</li>
</ol>5. Verbindung testen
<ol><li>Bereiten Sie die Zellen, wie in Schritt 1 beschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie die Liganden-Platte mit einem 5-fold bestand der endgültigen Liganden-Konzentration in der Assay-Puffer.</li>
	<li>Bereiten Sie die Verbindungen-Platte mit dem 4-fold bestand der gewünschten Endkonzentration von Verbindungen in der Assay-Puffer. Bereiten Sie eine zusammengesetzte Endkonzentration von 10 µM in der Assay-Puffer eine Stammlösung 40 µM.<ol>
<li>Halten Sie die Konzentration von Dimethyl Sulfoxid (DMSO) konstant über alle Proben durch die Vorbereitung einer Vorverdünnung der Verbindung in DMSO vor weiteren Verdünnung in den Assay-Puffer.</li>
		<li>Bereiten Sie für eine Dosis-Antwort der Verbindung in der letzten Probe zwischen 3 und 30 µM eine Vorverdünnung der Verbindung im Bereich von 1 bis 10 mM DMSO. In der Assay-Puffer, die 4-fold Lager Konzentration zu verdünnen. Die Endkonzentration der DMSO sollte 0,5 % nicht überschreiten. Hinweis: Es wird empfohlen, jede Probe in Triplicates zu testen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laden Sie die Liganden, die Verbindung und die Zellplatte in FDSS.</li>
	<li>Messen Sie die Grundlinie Fluoreszenz für 30 Sekunden.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL des zusammengesetzten Materials und Messung der Fluoreszenz für 5 Minuten.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL des Liganden Lager und Messung der Fluoreszenz für 5 Minuten.</li>
	<li>Das Integral der Fluoreszenz-Verhältnis durch die Berechnung der Fläche unter der Kurve der fluoreszierenden Verhältnisse während der letzten 5 Minuten der Messung zu bestimmen. Hinweis: Alternativ kann das maximale Verhältnis der Fluoreszenz nach Ligand Zugabe für die Analyse verwendet werden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier:+ageing+and+microvascular+disease--systematic+review+and+meta-analysis.">Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis.</a> Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).</li><li>Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+decline+and+brain+pathology+in+aging--need+for+a+dimensional,+lifespan+and+systems+vulnerability+view.">Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view.</a> Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).</li><li>Wittchen, H. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Phosphonomethylquinoxalinediones+as+competitive+NMDA+receptor+antagonists+with+a+preference+for+the+human+1A/2A,+rather+than+1A/2B+receptor+composition.">5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).</li><li>Danysz, W., Parsons, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+and+N-methyl-D-aspartate+receptors:+physiological+significance+and+possible+therapeutic+applications.">Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications.</a> Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).</li><li>Liu, M. 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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte und nichts preisgeben.

Der Erfolg dieser Assay hängt die Gesundheit der HEK Zellen verwendet. Zellen, exponentielles Wachstum erlebt und mit niedrigen Passagenanzahl sollte verwendet werden. Dieser Test beinhaltet viele Transfers und Ergänzungen von Lösungen, also mit Vorsicht sorgt für höhere Genauigkeit des Ergebnisses. Konzentrationen von Verbindungen und alle anderen Reagenzien sollten auch abgeglichen, Fehler zu minimieren. Beim Austausch der Zelle Medien mit dem Assay-Puffer für die Kalzium-Flux-Assay sollte die Platte vorsichtig g...

Mit den aktuellen Fortschritten in der Medizin hat die Lebenserwartung deutlich zugenommen; Allerdings hat also die Prävalenz der altersbedingten Erkrankungen. Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Schizophrenie, Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit, unter anderem sind da keine Ausnahme und haben voraussichtlich in den nächsten zehn Jahren1, zu erhöhen 2 , 3. die Fehlfunktion von Ionotropic Glutamat-Rezeptoren bekannt als N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren (NMDAR), Alzheimer-Krankheit, Schizophrenie, Schädel-Hirn-Verletzungen, Schlaganfall, Diabetes und Glaukom u.a. die Optionsscheine verknüpft wurde die Ihre Biologie für die Entwicklung von wirksamen, krankheitsmodifizierende Therapien4,5,6,7studieren müssen.
NMDARs bestehen aus vier Monomeren oder Untereinheiten4,8,9. Das Strukturbild der NMDAR zeigt Entwicklungs- und regionale Streuung innerhalb der Gehirn-7,-10. NMDARs engagieren sich in Synaptische Plastizität, Kognition und die Generation der Rhythmen für Atmung und Fortbewegung11,12,13. Als Voltage-gated-Kanal, es ist weitgehend nicht leitend bei ruhenden Membranpotential (-70 mV) und wird durch Magnesium zur Verhinderung weiterer Permeation von Ionen blockiert. Der Kanal wird durch die Bindung von zwei Liganden, Glutamat und Glycin/D-Serin aktiviert, und eine gleichzeitige Depolarisation an der synaptischen Membran durch AMPA-Rezeptoren, eine andere Unterklasse von Ionotropic Glutamat-Rezeptoren vermittelt. Die Depolarisation entfernt die Magnesium-Blockade der NMDAR, so dass des Zustroms von Kationen, insbesondere Kalzium14,15,16. Obwohl die Aktivierung von NMDAR essentiell für das Überleben der Zelle ist, kann übermäßige Aktivierung zu Tod17,18,19 bis Excitotoxizität Zelle führen. Dies macht neben der komplexen Natur des Rezeptors, es schwierig durchzuführenden Studien notwendig für die Entwicklung wirksamer Therapien.
Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um die NMDAR zu studieren. Allerdings hat jeweils begleitenden Einschränkungen. Beispielsweise ist eine weit verbreitete Technik eine Fluoreszenz basierende Assays, die NMDAR-vermittelte Änderungen in intrazellulären Calcium in eine stabile Zelllinie unter der Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promotors (Tet-On)20misst. Jedoch in diesem System macht supramaximalen Konzentrationen von Liganden, die benötigt werden und die Anforderung, dass NMDAR Inhibitoren vorhanden während der Messung sind es nahezu unmöglich, Aktivität der kompetitiver Antagonist zu erkennen. In anderen ähnlichen Systemen verursacht der Ausdruck des funktionalen Rezeptors Toxizität, erfordern-Antagonisten wie Ketamin21,22 , die Zellkulturen zu bewahren. Diese Kanalblocker das Herzstück des Rezeptors sitzen und sind schwierig zu waschen, vor allem in einem Teller-basierte Format, damit sie funktionellen Studien des Rezeptors beeinträchtigt. Zu guter Letzt in elektrophysiologische Messungen wie Patch spannen, gibt es begrenzter Durchsatz, und groß angelegte Studien sind sehr teuer23. Dennoch sind die oben genannten Systeme unempfindlich gegen Glycin Stimulation; Daher wird das Studium Glycin-abhängige Aktivität von der NMDAR eine Herausforderung.
Hier beschreiben wir einen neuartigen Ansatz für das Studium NMDAR, die die besprochenen Grenzen überwindet. Unsere Technik nutzt Baculovirus Expressionssystems Rezeptor auf Funktionsebenen mit optimalem Verhältnis der Untereinheiten in weniger als 16 Stunden zum Ausdruck zu bringen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Baculovirus für einen einfachen und kombinatorische Ansatz, wonach eine breite Charakterisierung der verschiedenen rekombinanten NMDAR Untertypen. Im Gegensatz zu anderen Assays erfordert dieses Protokoll nicht-Kanal-Blocker wegen des Einsatzes von schwachen Antagonisten. Stärkste Vorteil der Methode ist, dass nach dem Auswaschen des schwachen Antagonisten, der Rezeptor reagiert empfindlich auf Modulation der einzelnen Glycin - und Glutamat-Bindungsstellen neben duale Modulation von Glycin/D-Serin und Glutamat Ligand-Bindung Seiten. Der Assay rekapituliert bekannten Pharmakologie des NMDAR-Rezeptors und die Auswirkungen seiner bekannten positiven und negativen Modulatoren. Zu guter Letzt Generation von in-vitro- zelluläre Assays überwindet die zelluläre Toxizität verursacht durch übermäßigen Kalzium Zustrom und ermöglicht funktionelle Studien des Rezeptors in einer Hochdurchsatz-Mode, die Entdeckungen der NMDAR Modulatoren beschleunigen können bei Krankheitszuständen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line</td>
			<td>ChanTest Corporation</td>
			<td>CT6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac Dual Expression Vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10712-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>R8192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L701,324</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Boston Bio Product</td>
			<td>BB-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10565018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDL105,519</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NVP-AAM077</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP070667</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput calcium-flux assay to study nmda-receptors with sensitivity to glycine/d-serine and glutamate

N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren (NMDAR) gelten als Ionotropic Glutamat-Rezeptoren und haben entscheidende Rollen in lernen und Gedächtnis. NMDAR Störung, ausgedrückt als entweder über - oder unter - activity verursacht durch Mutationen, veränderten Ausdruck, Menschenhandel oder Lokalisierung, kann zahlreiche Krankheiten, insbesondere in das zentrale Nervensystem beitragen. Daher unbedingt Verständnis der Rezeptor Biologie sowie zur Erleichterung der Entdeckung von Verbindungen und kleine Moleküle in laufenden Bemühungen zur Bekämpfung von neurologischer Erkrankungen. Aktuelle Ansätze zur Untersuchung des Rezeptors haben Beschränkungen, einschließlich niedriger Durchsatz, hohen Kosten und der Unfähigkeit, seine funktionellen Fähigkeiten durch die notwendige Anwesenheit von Kalziumkanalblocker NMDAR-vermittelten Excitotoxizität verhindern zu studieren. Darüber hinaus die bestehenden Assay-Systeme sind empfindlich auf die Stimulation durch Glutamat nur und Empfindlichkeit auf Anregung von Glycin, die andere Co Liganden der NMDAR fehlt. Hier präsentieren wir die erste Platte-basierte Assay mit hohem Durchsatz macht einen NMDA-Rezeptor mit Sensibilität für Co-Liganden, Glutamat sowohl D-Serin/Glycin zu studieren. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der verschiedenen NMDAR Untereinheit Kompositionen und funktionelle Studien des Rezeptors in Glycin und/oder Glutamat-sensitiven Modi ermöglicht. Darüber hinaus erfordert die Methode nicht die Anwesenheit von Inhibitoren während der Messung. Die Auswirkungen der positive und negative allosterische Modulatoren können mit diesem Test erkannt werden und die bekannten Pharmakologie des NMDAR in unserem System repliziert wurden. Diese Technik überwindet die Grenzen der bestehenden Methoden und ist kostengünstig. Wir glauben, dass diese neuartige Technik die Entdeckung von Therapien für NMDAR-vermittelten Erkrankungen beschleunigen wird.

Vor der Prüfung der Auswirkungen von kleinen Molekülen, muss die optimalen Ausdruck Ebenen des NMDARs sowie die optimale Liganden-Konzentrationen festgestellt werden. Wie beschrieben, HEK293 Zellen bei 10.000 Zellen pro Bohrloch in einem 384-Well-Platte ausgesät wurden, in Anwesenheit von 5 µM CGP060667, dann ausgestrahlt mit unterschiedlichen Mengen von NR1 und NR2A Viren. Nach Inkubation über Nacht, Liganden-induzierte Kalzium Flussmittel gemessen wurde (Abbild...

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A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

Eine Hochdurchsatz-Kalzium-Flux-Assay, NMDA-Rezeptoren mit Sensibilität für Glycin/D-Serin und Glutamat zu studieren

Das Ziel dieses Protokolls ist es, das Studium der NMDA-Rezeptoren (NMDAR) in einem größeren Maßstab erleichtern und ermöglichen die Prüfung der modulierende Effekte von kleinen Molekülen und deren therapeutische Anwendungen.

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.1K Aufrufe.  Novartis Institutes for BioMedical Research. Das Ziel dieses Protokolls ist es, das Studium der NMDA-Rezeptoren (NMDAR) in einem größeren Maßstab erleichtern und ermöglichen die Prüfung der modulierende Effekte von kleinen Molekülen und deren therapeutische Anwendungen.

Serie: A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain is correlated with that strain s ethanol preference, and therefore sedation is a highly relevant measure to study the genetics of alcohol responses and drinking. We demonstrate a simple way to expose flies to ethanol and measure its intoxicating effects. The assay we describe can determine acute sensitivity, as well as ethanol tolerance induced by repeat exposure. It does not require a technically involved setup, and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A simple assay to measure the sedating effects of ethanol on Drosophila flies, based on the loss of righting reflex, is described.

Ein einfacher Weg zu Ethanol Empfindlichkeit in Flies Measure

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Licht Vorlieben Assay zur angeborenen und Circadian geregelten Photobehavior in Studie<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Die Ableitung der zeitliche Verlauf der Glutamate Ausverkauf mit Dekonvolutionsanalyse von Astrozytäre Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Funktionelle Abfrage der Erotik Hypothalamus Neurogenese mit Brennradiologische Hemmung

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Assay mit hohem Durchsatz Eiablage Präferenzen der einzelnen zu untersuchen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding immunostaining (specifically for ionized calcium-binding adapter molecule 1 (IBA1), a calcium binding protein expressed by microglia) and tissue processing for electron microscopy (EM). Methoxy-X04 is a fluorescent dye that crosses the blood-brain barrier and selectively binds to &#946;-pleated sheets found in dense core A&#946; plaques. Injection of the animals with methoxy-X04 prior to sacrifice and brain fixation allows pre-screening and selection of the plaque-containing brain sections for further processing with time-consuming manipulations. This is particularly helpful when studying early AD pathology within specific brain regions or layers that may contain very few plaques, present in only a small fraction of the sections. Post-mortem processing of tissue sections with Congo Red, Thioflavin S, and Thioflavin T (or even with methoxy-X04) can label &#946;-pleated sheets, but requires extensive clearing with ethanol to remove excess dye and these procedures are incompatible with ultrastructural preservation. It would also be inefficient to perform labeling for A&#946; (and other cellular markers such as IBA1) on all brain sections from the regions of interest, only to yield a small fraction containing A&#946; plaques at the right location. Importantly, A&#946; plaques are still visible after tissue processing for EM, allowing for a precise identification of the areas (generally down to a few square millimeters) to examine with the electron microscope.

This article describes a protocol for visualizing amyloid A&#946; plaques in Alzheimer&#39;s disease mouse models using methoxy-X04, which crosses the blood-brain barrier and selectively binds to &#946;-pleated sheets found in dense core A&#946; plaques. It allows pre-screening of plaque-containing tissue sections prior to immunostaining and processing for electron microscopy.

Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie zur Untersuchung Microglial Wechselwirkungen mit β-Amyloid-Plaques

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.

Eine Hochdurchsatz-Kalzium-Flux-Assay, NMDA-Rezeptoren mit Sensibilität für Glycin/D-Serin und Glutamat zu studieren

Zusammenfassung

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