Die Autoren erkennen die Research Foundation Flanders (FWO-Vlaanderen, Belgien, G.0601.11) und der KU Leuven Research Foundation GOA/11/002. IB, TJ und LT profitieren von einem Stipendium der FWO-Vlaanderen.

Hinweis: Alle Aktionen, bei denen Zellen beteiligt sind, sollten in einer sterilen Umgebung durch Arbeiten in einer laminaren Strömung durchgeführt werden. 1. Wartung der Zelllinie HEK293T <ol><li> Wachsen die HEK293T-Zellen in einem T-75-Kolben bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator. </li><li> Durchgang, wenn die Zellen eine Konfluenz von 80% erreicht ist. Hinweis: Diese dauert in der Regel 3 bis 4 Tage. Zellen in kontinuierlicher Kultur erlauben 20-25 nutzbare Kanäle für Screening. <ol><li> Platzieren Sie die Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, PBS-Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (500 ml PBS, ergänzt mit 10 ml Trypsin-EDTA-Lösung und 4,5 ml 4% EDTA) und Wachstumsmedium (500 ml Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium - hohe Glukose [DMEM] mit 10% fetales Rinderserum [FBS] und 1 mM Penicillin-Streptomycin [PS]) bei Raumtemperatur eine halbe Stunde im Voraus ergänzt. </li><li> Entfernender alte Wachstumsmedium von den Zellen. Spülen Sie tote Zellen mit 3 ml PBS und entfernen Sie das PBS wieder. </li><li> 3 ml PBS-Trypsin-EDTA, nach 1 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie die Lösung Hinweis: Die Morphologie der Zellen ändert sich von sternförmig zu Sphäre förmig. </li><li> Lösen Sie die Zellen aus dem Boden des Kolbens durch leichtes Klopfen und sammeln die Zellen durch Spülen der Boden mehrmals mit 10 ml frischem Wachstumsmedium. </li><li> 1 ml der Zellkultur in einen neuen T-75-Kolben mit 14 ml frischem Wachstumsmedium, und Inkubation bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator. </li></ol></li></ol> 2. Transiente Transfektion von HEK293T-Zellen <ol><li> Wachsen die HEK293T-Zellen in einem T-75-Kolben 3 Tage vor dem eigentlichen Test Calcium-Mobilisierung stattfindet. Achten Sie darauf, drei T-75-Flaschen, eine für die Transfektion mit dem Rezeptor-Konstrukt, eine für die Transfektion mit einem leeren Expressionsvektor, als negative Kontrolle und o verwendenne für die Transfektion Kontrolle. Hinweis: Die Passage der Zellen durchgeführt wird, wie in Schritt 1.2 beschrieben. Wenn mehrere 96-Well-Platten müssen untersucht werden, können T-150-Kolben verwendet werden, um eine höhere Ausbeute an Zellen (dies zu tun, Doppel alle aufgeführten Mengen in den Schritten 1.2.5, 2.3, 3.1.3 und 3.1.4) erhalten . </li><li> Die Kolben werden bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator für 20-24 Stunden, bis die Zellkulturen nähern 50-70% Konfluenz. </li><li> Co-Transfektion von einer Population von Zellen mit dem Expressionsvektor, der GPCR von Interesse und der Ga-16-Konstrukt, den zweiten Kolben, der mit dem leeren Vektor und dem Ga-16-Konstrukt, und die dritte mit der Transfektion Steuerung und der Ga-16-Konstrukt kodiert. Anmerkung: In diesem Protokoll wurde das Drosophila sNPF Rezeptors in einem Säugetier-Expressionsvektor pcDNA3.1 13 kloniert. JetPRIME wurde verwendet, um die Transfektion durchzuführen, aber andere Transfektionsreagenzien können ebenso verwendet werden. <ol><li> Hinzufügen beiotal von 7,8 pg DNA (3,9 ug Rezeptor-Konstrukt oder leeren Vektor und 3,9 ug Ga-16-Expressionskonstrukt) in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 500 ul der jetPRIME Puffer. Durch Vortexen mischen die Röhre, und Spin-Down kurz. </li><li> In 37,5 ul der jetPRIME Reagenz, Vortex-und Spin-down für 1 min bei 14.000 x g. Inkubieren Transfektionsgemisch 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Füge das Transfektionsgemisch tropfenweise zu dem Zellkulturmedium und sicherstellen, um direkt in das Medium Vermeidung von Kontakt mit den Wänden der Kulturflasche pipettiert. Die Kolben werden bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator für 20-24 Stunden. </li></ol></li></ol> 3. Calcium Mobilisierung Assay <ol><li> Sammeln Sie die transfizierten Zellen und Saatgut sie in 96-Well-schwarz-walled, klare Bodenplatten. <ol><li> Platzieren des PBS, PBS-Trypsin-EDTA und DMEM Übertragungsmedium (500 ml DMEM mit 10% dialysiertem FBSund 1% PS) bei Raumtemperatur eine halbe Stunde im Voraus. </li><li> Bestreichen Sie die 96-Loch-schwarz-walled, klare Bodenplatten mit 60 ul PBS mit Fibronektin (0,0025%) pro Well (5,85 ml PBS und 150 ul Fibronektin [0,1%] pro Platte). Die Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit dem Deckel auf. Entfernen der Lösung aus den Vertiefungen und Inkubieren der Platten erneut 1 h ohne Deckel bei Raumtemperatur. Alternativ ist es möglich, vorbeschichteten Platten für erhöhte Zellbindung zu verwenden. </li><li> Nehmen Sie den alten Wachstumsmedium von den Zellen und spülen toten Zellen mit 3 ml PBS und entfernen Sie das PBS. </li><li> 3 ml PBS-Trypsin-EDTA, nach 1 min, dann entfernen Sie die Lösung. Hinweis: Die Morphologie der Zellen ändert sich von sternförmig um kugelförmig. </li><li> Lösen der Zellen vom Boden des Kolbens durch leichtes Klopfen und sammeln sie durch Abspülen mehrmals mit 10 ml DMEM Übertragungsmedium. Übertragen der Zellen in ein 50 ml-Falcon-Röhrchen. </li><li> Graf dieAnzahl der Zellen pro ml (mit einer NucleoCounter hier durchgeführt, aber ein Burker Kammer ist zulässig). 100 ul der Zellkultur in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 100 l Lysepuffer zugeben und durch Antippen der Röhre. 100 l Stabilisierungspuffer und mischen durch Antippen. </li><li> Füllen Sie eine NucleoCassette mit der Zellsuspension und zählen Sie die Zellen mit dem Zähler. Multiplizieren die Anzahl der Zellen, die durch drei, als die Zellen um einen Faktor drei bei der Zugabe der Lyse und Stabilisierungspuffer in Schritt 3.1.6 verdünnt. </li><li> Verdünne die Zellen auf eine Endkonzentration von 600.000 Zellen / ml und Saatgut 150 ul der Zellen pro Vertiefung in den beschichteten Platten um eine Zelldichte von etwa 90.000 Zellen pro / Vertiefung zu erhalten. Vermeiden Sie Luftblasen und tippen Sie auf die Platte, um die Zellen gleichmäßig verteilt, um eine zusammenhängende Zellschicht zu erhalten. Die Inkubation bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator für 16-24 Stunden. </li></ol></li><li> Laden der Zellen mit dem fluoreszierenden Farbstoff und Vorbereitung des Zusammenmpound Platte. <ol><li> Bereiten Hank-Salzlösung (HBSS) / HEPES / Ca 2 + / Rinderserumalbumin (BSA) Puffer: in 165 ul CaCl 2 Stammlösung (1 M CaCl 2 in destilliertem Wasser [dH 2 O] - Öffnungs bei Raumtemperatur), 500 ul HEPES-Stammlösung (1 M HEPES in dH 2 O, pH 7,4 - bei Zimmertemperatur), und 0,05 g BSA auf 50 ml HBSS. Beachten Sie, dass fettsäurefreies BSA für Calcium-Assays verwendet werden, wie Fettsäuren können spezifische Rezeptoren aktivieren, die Calcium-Signal des interessierenden Rezeptor beeinträchtigen. </li><li> Bereiten Probenecid-Lösung (100x 250 mm): 0,71 g Probenecid aufzulösen in 5 ml NaOH (1 M) und 50 ul HEPES-Stammlösung und 5 ml HBSS / HEPES / Ca 2 + / BSA-Puffer - immer eine neue Lösung. Hinweis: Probenecid hemmt anorganischen Anionen-Transporter, die Fluo-4 aus dem Zytoplasma zu verdrängen können, wodurch das Fluoreszenzsignal zu reduzieren. Es wird empfohlen, die Farbstoffbeladung in durchdie Anwesenheit und Abwesenheit von Probenecid zu bestimmen, ob anorganisches Anion-Transporter ein potenzielles Problem in bestimmten Zelllinien untersuchten Probenecid sogar die Agonist-vermittelten Signals zu verringern. </li><li> Vorbereitung Waschpuffer: in 500 ul Probenecid Lösung auf 50 ml HBSS / HEPES / Ca 2 + / BSA-Puffer, der pH-Wert auf 7,4 und der Pufferlösung zu filtrieren. Immer frisch zubereiten Puffer und 50 ml Puffer pro Platte erforderlich ist. </li><li> Bereiten Sie 10% Pluronsäure Lösung: mix 50 ul Pluronsäure (20% w / v in Dimethylsulfoxid [DMSO]) mit 50 ul DMSO - wenn Kristallisation auftritt, Hitze bis 37 ° C und immer eine neue Lösung. </li><li> Bereiten Fluo-04.00-Lösung (1 mM): add 44 ul 10% Pluronsäure Lösung in eine Ampulle, die 50 ug Fluo-4 AM-und Wirbel enthält, bis es vollständig gelöst ist. Vermeiden Sie Licht, um ein Ausbleichen der Fluorophore zu verhindern. </li><li> Bereiten Ladepuffer: in 8,8 ml DMEM Supplemented mit 10 mM HEPES und 2,5 mM Probenecid (pH 7,4) zu der Fluo-4.00-Lösung (44 ul) und Wirbel. Immer frische Puffer. </li><li> Entsorgen Sie das Medium aus den Zellen, waschen Sie die Zellen mit 200 ul PBS pro Vertiefung und entfernen PBS. </li><li> In 55 ul Ladepuffer pro Vertiefung und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur. Wickeln Sie die Platte in Alufolie, um die Exposition der Platte mit Licht zu verhindern. </li><li> Achten Sie darauf, die Verbindungen vor dem Bildschirm zu trocknen, wenn sie in Lösungsmitteln, die schädlich (zB Acetonitril) sind für die zelluläre Expressionssystem gelöst sind. </li><li> Solubilisierung die Peptide in Waschpuffer in silikonisierten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe, um eine Konzentrations-Wirkungs-Analyse durchzuführen und die EC 50-Wert eines Liganden zu bestimmen. In 70 ul des Liganden in der entsprechenden Vertiefung der Verbindung Platte (V-96-Well-Platten) und sind positive (endogene Agonist) und Negativkontrollen (Waschpuffer) auf jeder Platte. Nicht<html> E: Wenn eine Verbindung nicht löslich in der Waschpuffer kann man andere Lösungsmittel, die für die untersuchten Zellen schädlich sind, wie Wasser oder Lösungen, emulgieren und Solubilisierung von Ölen und anderen wasserunlöslichen Substanzen (zB Kolliphor EL) versuchen . </li><li> Messen Sie alle Proben in dreifacher Ausfertigung. Beachten Sie, dass 50 ul eines Liganden aus der Verbindung Platte wird mit 100 ul Waschpuffer von der Zellplatte während des Tests in eine gut übertragen werden, so bereiten die Verbindungen bei 3x ihre gewünschte endgültige Konzentration. </li><li> Entsorgen Sie die Ladepuffer aus der Zellplatte und 100 ul Waschpuffer in jede Vertiefung. Die Platte 15 min Inkubation bei Raumtemperatur und vermeiden Belichtung. </li><li> Entsorgen Sie den Waschpuffer aus der Zellplatte und 100 ul neue Waschpuffer in jede Vertiefung. </li><li> Inkubation des Zellplatte, die die Verbindung Platte und eine Spitzengestell (96-well, Stationseinrichtung Pipettenspitzen) für 15 min bei 37 ° C </li></ol></li></ol>Titel &quot;&gt; 4. Assay auf der Station Geräte <ol><li> Erstellen und laden Sie die gewünschte Protokoll-Datei mit der Software und den Temperaturregler aktivieren für den Leseraum. Hier messen Kalzium Reaktionen bei 37 ° C für 2 min eine Zeile in einer Zeit mit 1,52 Sekunden Intervall zwischen aufeinanderfolgenden Messungen (Mess eine komplette 96-Well-Platte dauert ca. 25 min) bei 525 nm auf. Stellen Sie die Anregung der Fluo-4 488 nm und übertragen ein Gesamtvolumen von 50 ul-Verbindung zu der Zellplatte, 18 Sekunden nach dem Lesestart, mit dem Spendegeschwindigkeit bei 26 ul / s eingestellt und einer Pipette Höhe von 135 ul. </li><li> Positionieren Sie die Verbindung und Zellplatte, und die Spitze Rack in die entsprechenden Schubladen des Stationseinrichtung. </li><li> Führen Sie einen einzelnen Lese der Zellplatte in der gleichen Anregungs-und Emissionswellenlänge in der Endpunkt-Modus, bevor mit dem eigentlichen Bildschirm in FLEX-Modus. Hinweis: Dieses Maß gibt die relative Fluoreszenzeinheitswerte (RFU) und erlaubt Variabilität zwischen Erkennen wirlls der Platte. Werte zwischen 20.000 und 40.000 als akzeptabel betrachtet. </li><li> Sollte die Probe und die Daten mit der Software zu analysieren. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay wurde erfolgreich angewendet, um die funktionelle Charakterisierung des Drosophila sNPF peptidergen Signalisierungssystem, das bereits von Mertens et al wurde bestätigt. mit einem Biolumineszenz-Assay und von Feng et al. mit einer elektrophysiologischen Assay 13,15. Die EC 50-Werte mit der Fluoreszenz-Assay in HEK293T-Zellen erhalten werden, sind etwa 10-mal weniger als die mit dem Biolumineszenz-Assay in CHO-Zellen (Drome-sNPF-1 durchgeführt, erhalten: fluo = 2.04 nM, Leuchten = 51 nM; Drome-sNPF- 2: Fluo = 5,89 nM, Leuchten = 42 nM; Drome-sNPF-3: fluo = 5,55 nM, Leuchten = 31 nM; Drome-sNPF-4: fluo = 0,50 nM, Leuchten = 75 nM). Diese Variationen können durch verschiedene Faktoren, einschließlich der Tatsache, daß eine der verwendeten Expressionssysteme können für die funktionelle Expression eines bestimmten Rezeptors besser geeignet sein, oder die Faltung des bestimmten Rezeptoren in c weniger effizient erklärtertain Zelltypen. Die EC 50-Werte von allen vier Drome sNPF-Peptide sind im nanomolaren Bereich, wenn auf ihren Rezeptor getestet sowohl mit dem Fluoreszenz-und Biolumineszenz-Assay, im allgemeinen die Unterstützung der physiologischen Relevanz der Peptid-Rezeptor-Interaktion in vivo. Beachten Sie, dass keine Kontrolle der Transfektion mit einem Rezeptor, für die die aktivierende Liganden ist bekannt, wurde in der hier vorgestellten Bildschirm enthalten, da die Drosophila sNPF Signalsystem ist in der Regel der Steuer Transfektion in Versuchsaufbauten. Die positive Kontrolle mit einem endogenen Liganden der HEK293T-Zellen (PAR-1) und die Negativkontrolle (Waschpuffer) wurden in dem Bildschirm enthalten. Die Ergebnisse der PAR 1 zeigte, dass die Zellen in einem guten Zustand. Die Negativkontrolle (Waschpuffer) nicht ein Fluoreszenzsignal zu entlocken, was darauf hindeutet, dass das Medium, in dem die Peptide gelöst sind, war frei von Verunreinigungen, die inf könnteluence die Ergebnisse. Die zuvor gekennzeichnet Drosophila sNPF Signalsystem wurde hier verwendet, um die Fluoreszenz-basierten Assays Kalziummobilisierung zu erklären. Zu diesem Zweck wurden Konzentrationsreihen der aktivierenden Liganden sofort getestet. Wenn jedoch ein Orphan-Rezeptor ist mit Überexpression in einem Screening-Test, um eine Bibliothek mit Hunderten von Verbindungen zu testen gebracht, es zum ersten Bildschirm mit einer relativ hohen Endkonzentrationen der Liganden (z. B.., 10 oder 1 &amp;mgr; M) empfohlen wird. Nach der Detektion eines Aktivierungsverbindung kann eine Verdünnungsreihe dieser Verbindung, um eine Konzentrationsantwortkurve zusammenzustellen und um den EC 50-Wert zu bestimmen, untersucht werden. Sobald die Aktivierungsliganden eines Rezeptors bestimmt wird, kann die intrazelluläre Signalwegs durch die Anpassung des Protokolls untersucht werden. Der Assay kann wie oben beschrieben, aber ohne Co-Transfektion des G ^5, 16-Untereinheit. Wenn ein Calcium-Reaktion gemessen wird, bedeutet dies, dass die Rezeptor-Paare mit einem endogenen G &amp;agr; q-Untereinheit des zellulären Expressionssystem. Wenn kein Fluoreszenzsignal beobachtet wird, kann Protokolle Änderungen der Konzentration anderer sekundärer Botenstoffe (z. B.., CAMP) Messung angewendet werden. Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR)-Studien können durchgeführt werden, um Kernsequenz des Peptids für die Rezeptoraktivierung notwendig zu definieren. Zunächst werden trunkierte Sequenzen bewertet, um die minimale Aminosäuresequenz des Peptids, die noch in der Lage ist, den Rezeptor zu aktivieren, zu definieren. Weiter können Peptide getestet werden, bei dem systematisch jede Aminosäure für einen Alanin-Rest ersetzt wurde. Testen synthetischen Alanin-Substitutionsreihe auf dem Rezeptor ermöglicht, die Bedeutung von jeder der Aminosäuren für die Rezeptoraktivierung 24,25 bestimmen. Trotz der häufigen Verwendung und bewährte Effizienzsamkeit, ist zu betonen, dass die hier beschriebene Assay müssen einige Anpassungen, um optimale Ergebnisse für spezifische Rezeptoren von Interesse zu gewinnen. Die Ga-16-Untereinheit hat den Vorteil, dass es für die meisten GPCRs bindet, kann aber auch eine dominant-negative Wirkung auf Rezeptoren haben, die endogen Paar über Ga-22 q. In diesem Fall kann es nützlich sein, verschiedene Kombinationen von G-Proteinen während der Optimierung eines neuartigen Calcium-Assay getestet und die Ergebnisse für G &amp;agr; q-gekoppelten Rezeptoren in Abwesenheit oder Anwesenheit von G &amp;agr; 16 zu vergleichen. Alternative Assays, die unabhängig von der G-Protein interagieren, um die Rezeptoraktivierung zu detektieren sind, können ebenfalls durchgeführt werden, wie die Translokation von GFP-markiertem Arrestin oder den Nachweis von Änderungen des Membranpotentials (z. B.. Durch FLIPR Membrane Potential Assay Kit). Neben der Fluo-04.00 hier verwendet wird, eine breite Palette von anderen Calcium-sensitiven Fluorophoren, jede mit ihrer eigenen spektralen und chemical Eigenschaften zur Verfügung. Die am besten geeigneten Fluorophor auf der Basis des GPCR, Zelltyp und der zur Verfügung stehenden Plattenlesegerät ausgewählt werden, aber experimentelle Verifikation erforderlich ist. Die Mengen der transfizierten DNA und der DNA / Transfektionsreagenz Verhältnis Notwendigkeit, für jeden Rezeptor-Transfektionsreagenz-Zelllinie Kombination bestimmt werden. Schließlich sollte beachtet werden, dass die Zellen in einer kontinuierlichen Kultur erlauben nur 20-25 verwendbar Passagen, die Screening-Assays durchzuführen.

G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) bilden eine der größten und vielfältigsten Familien unter allen Zelloberflächenproteine. Ihre Anwesenheit bei Wirbeltieren, Wirbellose, Pflanzen, Hefe und Schleimpilz, als auch in Protozoen und frühestens diploblastic Metazoa zeigt an, dass GPCRs gehören zu den ältesten Moleküle mit Signaltransduktion 1 verbunden. Ihre natürliche aktivierenden Liganden umfassen eine große Vielfalt von äußeren Reizen einschließlich Peptide, biogene Amine, Geruchsstoffe, Glykoproteine, 2 und Photonen. Als solche sind diese Rezeptor-Ligand-Signalsysteme in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt. Das breite Funktionsspektrum macht sie ideal für die Entwicklung von Therapeutika, die eine Vielzahl von Krankheiten des Menschen zu decken. Über 50-60% der aktuellen Drogenziele werden durch GPCRs 3,4 vertreten. Neben ihrer großen Bedeutung in der pharmazeutischen Industrie sind GPCRs auch im Rampenlicht für die Entwicklung einerneue Generation von Spezies-spezifische Insektizide und Pestizide 5,6 im Allgemeinen. Da die natürlichen Liganden von vielen GPCRs sind noch nicht identifiziert, werden sie als Waise GPCRs eingestuft. Die deorphanization dieser Rezeptoren wird das Verständnis der physiologischen Funktionen in Organismen zu verbessern und kann vermeintlichen Ziele für neue Arzneimittelanwendungen 7 aufzudecken. Da die genomische Zeit wird die Rückwärts pharmakologischen Strategie häufig für die deorphanization von GPCRs 8 angelegt. Der Ansatz impliziert, dass ein Orphan-Rezeptor wird als &quot;Haken&quot; zu &quot;Fisch aus&quot; seiner aktivierenden Liganden aus einem biologischen Extrakt oder aus einer Bibliothek von synthetischen Verbindungen verwendet. Die GPCR von Interesse ist daher kloniert und anschließend in einem zellulären Expressionssystem transfiziert. In den am häufigsten verwendeten Verfahren wird die Rezeptoraktivierung durch Messung der Veränderungen in der Konzentration des zweiten Botenmoleküle bestimmt 9 </sup&gt;. Die Haupt Rezeptor-Screening-Assays beruhen auf Calcium-sensitiven biolumineszierende Proteine ​​(zB Aequorin) 10 oder fluoreszierenden Calcium-Indikatoren (z. B. Fluo-4) 11. Die Fluoreszenz-basierten Assays, in dem Rezeptor-exprimierenden Zellen mit einem Fluoreszenz-Calciumindikator vor der Liganden-Screening geladen wird, haben den Vorteil, dass sie ermöglichen Hochdurchsatz-Screening durch ihre einfache Bedienung, kurze Lesezeit und die Flexibilität des Screening mehrere Orphan-Rezeptoren auf einer einzigen Platte 12. Hier wird die Fluoreszenz basierenden Assay Calciummobilisierung gründlich beschrieben und durch die deorphanization Verfahren der Drosophila melanogaster kurzen Neuropeptid F (sNPF)-Rezeptor dargestellt. Diese neuropeptidergic Signalsystem wurde ursprünglich von Mertens et al aus. 2002 13 mit einem Calcium-Biolumineszenz-Assays in chinesischen Hamstereierstock-(CHO)-Zellen durchgeführt,14 und von Feng et al. Im Jahr 2003 mit einer elektrophysiologischen Test unter Verwendung von Xenopus Oozyten 15. Die Anwesenheit des sNPF Signalisierungssystem scheint der zu dem Stamm der Arthropoda, wo es in einer Vielzahl von Verfahren, einschließlich der Regulierung der Zufuhr, des Wachstums, Stressreaktionen, Fortbewegung, und zirkadiane Rhythmen beteiligt 16 begrenzt. Forschung an neuropeptidergic Signalsysteme bei Insekten nicht nur auf neue Ziele für die Entwicklung von Insektiziden führen, aber das Wissen um ihre Funktion kann auch auf andere Organismen wie viele Signalsysteme sind in der Regel gut im Laufe der Evolution konserviert 17 hochgerechnet werden. In den letzten zehn Jahren große Fortschritte in der deorphanization Prozess der Insektenneuropeptid GPCRs gemacht worden. Trotz dieser Bemühungen haben nur eine geringe Anzahl von Rezeptoren auf ihrer zugehörigen Liganden abgestimmt und Lasten der Sequenzinformation fürneuen Orphan-GPCRs hat sich aufgrund der boomenden Genomik 18 zur Verfügung. Die Verfügbarkeit der Mittel / Hochdurchsatz-Screening-Methoden, wie die Fluoreszenz-basierten Assays Calcium-Mobilisierung, die sich als ein weithin angewandte Technik 9,18 zu können, ist daher von unschätzbarem Wert. Die Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay, wie hier beschrieben wird in der menschlichen embryonalen Nieren 293T (HEK293T-Zelllinie) durchgeführt und verwendet eine fluoreszierende Sonde, um Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration auf die Rezeptoraktivierung zu bestimmen. Um hohe Expressionsniveaus und Translation der Rezeptor zu garantieren, wird eine Kozak-Consensus-Sequenz 19 an das 5&#39;-Ende des Rezeptor-kodierende Sequenz, die anschließend in einen Expressionsvektor (z. B. pcDNA Vektorreihe für Säugerzelllinien) kloniert zugegeben. Da es schwierig ist, die endogenen G-Protein-Kopplung eines verwaisten GPCR basierend auf Sequenzinformation vorherAllein die Second-Messenger-Moleküle (z. B. Calcium-oder cAMP), die nach Rezeptoraktivierung moduliert werden, bleiben oft unbekannt vor Ligand Identifikation. Um dieses Problem zu umgehen, Promiskuität G-Proteine ​​der G q-Familie (zB Maus-Ga-Ga-15 oder Menschen 16 verwendet [hier]) oder chimäre G-Proteine ​​(zB Ga-qi5), die mit den meisten GPCRs interagieren und induzieren die Freisetzung von Kalzium kann coexprimiert 20,21,22 werden. Bei Bindung des Liganden an seinen Rezeptor, der GPCR eine Konformationsänderung, die die Aktivierung von spezifischen intrazellulären Signalwege führt. Die Guanosindiphosphat (BIP)-Molekül, unter Ruhebedingungen zu dem Ga-16-Untereinheit gebunden ist, wird von einem Guanosin-Triphosphat (GTP)-Molekül ersetzt werden. Dies provoziert die Dissoziation des heterotrimeren G-Proteins in einer G &amp;agr; 16 und Gβγ-Untereinheit. Die Ga-16-Untereinheit aktiviert Phospholipase C &amp;# 946; (PLC &amp;bgr;), die wiederum hydrolysiert das membrangebundene Phosphatidylinositol-bisphosphat (PIP 2), was zu Diacylglycerol (DAG) und Inositol-Triphosphat (IP 3). IP 3 wird während der gesamten Cytoplasma verteilt und aktiviert IP 3-abhängigen Calcium in der Membran des endoplasmatischen Retikulums, die die Freisetzung von Calcium in das Zytoplasma induziert vorhandenen Kanäle. Die Calcium-Freisetzung auf Rezeptor-Aktivierung erfolgt innerhalb von Sekunden und kann durch Laden von Zellen vor der Screening-Test mit einem Calcium-sensitiven Farbstoff, wie Fluo-4 acetoxymethyl (AM) 11 erfasst werden. Die AM-Ester-Gruppe ermöglicht die Fluorophore, die Zellmembran zu durchqueren und wird durch zytoplasmatische Esterasen einmal im Inneren der Zelle gespalten. Folglich werden die negativen Ladungen der Fluoreszenzfarbstoff demaskiert, diffundiert aus der Zelle und ermöglicht es, mit Calciumionen in Wechselwirkung verhindert. Das Fluoreszenzsignal of Fluo-4 ist unter Ruhebedingungen nur Calciumkonzentrationen enthalten, im nanomolaren Bereich vernachlässigbar in den Zellen. Wenn jedoch Calcium auf die Rezeptoraktivierung freigesetzt wird, kann das Signal konzentrationsabhängig auf mehr als das 100fache zu erhöhen, hierdurch gewährleistet ein großes Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Fluo-4 zeigt auch einen großen Dynamikbereich für die Meldung [Kalzium] um einen K d (Calcium) von 345 nM, so dass es geeignet, physiologisch relevanten Kalzium Änderungen in einer Vielzahl von Zellen zu messen. Die Anregung von Fluo-4 tritt bei 488 nm und die Emissionsfluoreszenz bei 525 nm 11 gemessen. Fluorimetern wie die Fluoreszenz-Imaging-Plattenlesegerät (FLIPR) 23, der Novostar oder der Flexstation (Station-Gerät) 12 Medium / High-Throughput-Systeme, die gleichzeitige Verbindung Addition und die Erfassung der Fluo-4-Rezeptor-Signal bei Aktivierung für jeden gut zu ermöglichen in einer Testplatte. Die hier beschriebene Calcium-Mobilisierung Assay beruht auf der StationGerät 96-Well-Mikroplatten-System. Die SoftMax Pro-Software (Software) wird verwendet, um die Station Einrichtung sowie für die Datenanalyse zu betreiben. Das Programm zeigt sofort die Ergebnisse als Grafiken in 96-Well-Format. Mehrere Vertiefungen gleichzeitig ausgewählt, um das Ergebnis dieser Vertiefungen auf derselben Grafik zu vergleichen. Die relative Fluoreszenzeinheit (RFU) Werte von Vertiefungen in jeder Spalte gleichzeitig für einen Zeitraum von zwei Minuten gemessen, beginnend vor der Zugabe der Verbindungen zu den Vertiefungen und weiterhin nach der Messung des Fluoreszenzsignals nach Rezeptoraktivierung. Typischerweise ist die Tendenz eines Agonisten Kurve ausgerichtet ist, bis die Grundlinie eine aktivierende Verbindung zu den Zellen zugegeben, was zu einem raschen Anstieg des Fluoreszenzsignals. Die Peakhöhe wird mit der endgültigen Konzentration des Agonisten in der gut korreliert. Nach dem Höhepunkt, fällt das Fluoreszenzsignal langsam in Richtung der Grundlinie Niveau. Die RFU Messungen ca.n in Konzentrations-Wirkungs-Kurven umgewandelt, um den EC 50-Wert (halbmaximale effektive Konzentration) eines Liganden zu bestimmen. Im Allgemeinen mindestens drei unabhängigen Bildschirmen, die jeweils drei Replikate einer Konzentrationsreihe, durchgeführt werden sollte, um eine zuverlässige Konzentrationsantwortkurve zu komponieren. Es wird empfohlen, mehrere positive und negative Kontrollen in der Versuchsanordnung umfassen. Erstens, eine Transfektion Steuerung, dh die Umsetzung eines Rezeptors mit einem bekannten Liganden getestet werden. Dies ermöglicht die Überprüfung, ob das Transfektionsmittel Betrieb war. Einbau von einem Kontrollexperiment mit einem Agonisten für einen endogenen Rezeptor der Zelllinie und einer Negativkontrolle (z. B. Waschpuffer) werden ebenfalls empfohlen, um die Gesundheit und Lebensfähigkeit der Zellen zu überwachen und die Möglichkeit, dass der Waschpuffer wurde mit kontaminierten auszuschließen ein Faktor, der eine Auto-fluore entlocken konnteDuft Antwort. Häufigsten verwendeten Agonisten sind ein Peptid, das von der Protease-aktivierte Rezeptor 1 (PAR-1), die als eine PAR 1-selektiven Agonisten oder Carbachol, die die Acetylcholin-Rezeptor aktiviert wirkt abgeleitet. Zellen, die mit einem leeren Expressionsvektor transfiziert sollten auch getestet werden, um auszuschließen, dass Wirkstoffe interagieren mit endogenen Rezeptoren der Zelle. Optimierung von mehreren in der unten beschriebenen Protokoll-Parameter für unterschiedliche Signalsysteme erforderlich. Eine schematische Abbildung der gesamten Fluoreszenz basierenden Calciummobilisierungsassay ist in Abbildung 1 dargestellt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1.jpg" /> Abbildung 1. Insgesamt Schema der Fluoreszenz-basierten Assays Calcium-Mobilisierung. Automatisierte Liquid Handling und gleichzeitigen Fluoreszenzmessungen werden mit der Station durchgeführtMikroplatten-Lesegerät, von der Software angesteuert. Die Station Gerät enthält drei Schubladen: eine für die Zellplatte, Verbundplatte und Spitze Rack. Die build-in-Pipette Transfers Verbindungen, die aus einer Spalte der Verbindung Platte an die entsprechende Spalte der Zelle Platte (Schritt 1). Jede Vertiefung der Zellplatte enthält eine Monolage von HEK293T-Zellen, die mit dem GPCR von Interesse und den Promiscuous Ga-16-Untereinheit co-transfiziert wurden. Wenn eine Verbindung, die den Rezeptor aktiviert, wird die Ga-16-BIP gebunden durch GTP ersetzt. Die G &amp;agr;-Untereinheit 16 anschließend dissoziiert von der Gβγ-Komplex und aktiviert Phospholipase C &amp;bgr; (PLC &amp;bgr;), die wiederum hydrolysiert Phosphatidylinositol bisphosphat (PIP 2), was zu Diacylglycerol (DAG) und Inositol-Triphosphat (IP 3). IP 3 aktiviert IP 3-abhängigen Calcium in der Membran des endoplasmatischen Reticulums Kanälen induzieren die Freisetzung von Calcium into das Zytoplasma. Die Wechselwirkung von Kalzium mit Fluo-4 (bei dem die Zellen vor der Zugabe Verbindung geladen ist) führt zu einem Fluoreszenzsignal (Schritt 2). Die Software stellt die Ergebnisse als relative Fluoreszenzeinheit-Werte (RFU) in Abhängigkeit von der Zeit, und die Peakhöhen korreliert mit der Ligandenkonzentration in einer konzentrationsabhängigen Weise. Diese Daten können dann in einer Konzentration-Antwort-Kurve umgewandelt, um den EC 50-Wert eines Ligand-Rezeptor-Paares (Schritt 3) zu bestimmen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trypsin-EDTA solution (0.25%)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:109px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">195173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose&#160; (DMEM)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7524</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicillin-Streptomycin (P-S)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:215px;">jetPRIME</td>
			<td style="width:109px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-01</td>
			<td style="width:167px;">FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX &#38; Plus Reagent (Life technologies)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0392</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent A100, Lysis buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent B, Stabilizing buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">CaCl2</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEPES</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">HBSS buffer: Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Probenecid</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NaOH (1 M)</td>
			<td>Vel</td>
			<td>2781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pluronic acid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-3000MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dimethyl-sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td style="width:167px;">Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1,.. (Invitorgen)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z707503 and Z707554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">FlexStation device</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">655090</td>
			<td style="width:167px;">Corning 96 well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCassette</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">941-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCounter NC-100</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes, siliconized</td>
			<td style="width:109px;">BioCision</td>
			<td style="width:119px;">BCS-2470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Polystyrene V-shaped 96-well plates</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>651101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">96-Well, FlexStation Pipet Tips</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td>9000-0912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Soft Max Pro software</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of g protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay

Seit mehr als 20 Jahren hat sich umgekehrter Pharmakologie war die herausragende Strategie, um die aktivierende Liganden von Orphan-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) zu entdecken. Das Einsetzen eines Reverse Pharmakologie Assay ist die Klonierung und anschließende Transfektion eines GPCR von Interesse in einem zellulären Expressionssystem. Das heterologe exprimierten Rezeptor wird dann mit einer Verbindungsbibliothek von Kandidaten-Liganden in Frage, um die Rezeptor-aktivierende Ligand (en) zu identifizieren. Rezeptoraktivierung durch Messung der Veränderungen in der Konzentration des zweiten Botenreportermoleküle, wie Calcium-oder cAMP geprüft. Die hier beschriebene Fluoreszenz-basierten Calciummobilisierungsassay ist ein häufig verwendetes Medium-Durchsatz Rückwärts pharmakologischen Test. Der Orphan-GPCR wird vorübergehend in humanen embryonalen Nieren 293T (HEK293T-Zellen) exprimiert und ein Promiscuous Ga-16-Konstrukt kotransfiziert. Nach Ligandenbindung, die Aktivierung der G &amp;agr;-Untereinheit 16 induziert die Freisetzung von Calcium-fROM Die endoplasmatischen Retikulum. Vor der Liganden-Screening werden die Rezeptor-exprimierenden Zellen mit einem fluoreszierenden Calciumindikator Fluo-4 Acetoxymethyl geladen. Das Fluoreszenzsignal von Fluo-4 vernachlässigbar ist in Zellen, die unter Ruhebedingungen, kann aber mehr als eine 100-fache bei der Wechselwirkung mit Calciumionen, die nach Rezeptoraktivierung freigesetzt werden, verstärkt werden. Das beschriebene Verfahren erfordert nicht die zeitaufwendige Errichtung von stabil transfizierten Zelllinien, in denen die transfizierte genetische Material in das Wirtszellgenom integriert. Stattdessen wird eine transiente Transfektion, Erzeugen temporärer Expression des Zielgens, ist ausreichend, um die Screening-Assay durchzuführen. Der Aufbau ermöglicht Mitteldurchsatz-Screening von Hunderten von Verbindungen. Co-Transfektion der Promiscuous G &amp;agr; 16, die Paare zu den meisten GPCRs ermöglicht die intrazellulären Signalweges in Richtung der Freisetzung von Calcium umgeleitet werden, unabhängig von der nativen Signalweges der endogenen Pflastergen. Die HEK293T-Zellen sind leicht zu handhaben und haben ihre Wirksamkeit im Laufe der Jahre in deorphanization Rezeptor-Assays nachgewiesen. Jedoch kann die Optimierung des Assays für spezifische Rezeptoren notwendig bleiben.

Konzentrationsreihe von 50 uM bis 0.001 nM wurden für alle vier Drosophila sNPF Peptide (: AQRSPSLRLRFamide, Drome-sNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-sNPF-3: PQRLRWamide, Drome-sNPF-4: PMRLRWamide Drome-sNPF-1) getestet auf HEK293T-Zellen, die transient exprimieren das Drosophila sNPF Rezeptor und den Promiscuous Ga-16-Untereinheit. Die GPCR wurde von allen vier Peptiden in Endkonzentrationen bis zu 0,1 nM aktiviert, und die Rezeptoraktivierung war konzentrationsabhängig. Fig. 2 zeigt die Kurven entsprechend einer der drei Kopien der Drome sNPF-1-Konzentrationsreihe. Die Negativkontrolle (Waschpuffer) nicht ein Fluoreszenzsignal zu induzieren, während die positive Kontrolle (PAR 1 - 1 uM) ausgelöste starke Aktivierung der endogenen Protease-aktivierten Rezeptor-1, was zu einer hohen Fluoreszenzsignal (± 30.000 RFU). Es sollte angemerkt werden, dass eine Abweichung vondie typische Kurve kann Anomalien zeigen. Zum Beispiel könnte ein kontinuierlicher Anstieg der Kurve ohne Rückkehr auf die Grundlinie von nicht-rezeptorvermittelte Signale, wie die Anwesenheit von Calcium-Ionophore oder einem gestörten Lipiddoppelschicht verursacht Calcium Lecks verwandt. Die Software ermöglicht die Eingabe von Formeln, den Prozentsatz der Aktivierung oder die Standardfehler der verschiedenen Konzentrationen unter anderem bestimmen. Die resultierenden Daten werden verwendet, um vorläufige Konzentrationsantwortkurven zu komponieren, um die EC 50-Werte zu ermitteln, da für die vier Drome-sNPF Peptide in Abbildung 3 dargestellt. Die Kurven der Fig. 3 sind auch die Daten für die Negativkontrolle, wo die Konzentrationsreihe die Drome-sNPF Peptide wurden HEK293T-Zellen mit einem leeren pcDNA3.1 Vektor transfiziert getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe der Peptide an diese Zellen keine Wirkung auf die endogene Rezeptoren, aber in der Tat aktivaß den Rezeptor von Interesse. Die Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay wurde dann dreimal unabhängig wiederholt. Auf Basis der vorläufigen Konzentrations-Wirkungs-Kurven der Anfangsbildschirm wurden die getesteten Konzentrationen angepasst, um den Dynamikbereich der Kurve (Abbildung 4) zu decken. Die EC50-Werte von Drome-sNPF-1 (2,04 ± 1,48 nM [95% Konfidenzintervall]), Drome-sNPF-2 (5,89 ± 3,74 nM), Drome-sNPF-3 (5,55 ± 3,95 nM) und Drome-sNPF- 4 (0,50 ± 1,01 nM) sind ähnlich, was darauf hinweist, dass sie gleichermaßen wirksam, um den Rezeptor zu aktivieren sind. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2.jpg" /> 2. Grafische Ausgabe der Software für einen Rezeptor-vermittelten Fluoreszenzantwort von einer Konzentrationsreihe. Zwölf endgültigen Konzentrationen (im Bereich von 50 &amp;mgr; M bis 0,001 nM) of die Drome-sNPF-1-Peptid wurden auf der Drome-sNPF Rezeptor getestet. Die Aktivierung erfolgt in relativen Fluoreszenzeinheitswerte (RFU) ausgedrückt. Der obere Graph zeigt die Ergebnisse der sechs höchsten Konzentrationen und die untere Kurve der sechs niedrigsten Konzentrationen. Die positive Kontrolle (+) ist, PAR-1 (1 &amp;mgr; M) und der Negativkontrolle (-) wird Waschpuffer. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3.jpg" /> 3. Vorläufige Konzentrations-Wirkungs-Kurven von Drosophila sNPF Peptiden durch einen einzigen Fluoreszenzbasis Calciummobilisierungsassay bestimmt. Die Konzentrations-Wirkungs-Kurven der Drosophila sNPF Rezeptor transient in HEK293T-Zellen für die vier Drosophila sNPF Peptide exprimiert werden blau angezeigt. Für die Negativkontrollen (in rot) wurden die Peptide auf HEK293T getestetZellen, die mit einem leeren Vektor pcDNA3.1 transfiziert. Die fluoreszierenden Reaktionen sind als relative (%) auf den höchsten Wert (100%-Aktivierung) gezeigt. Die Kurven sind das Ergebnis eines Experiments, in dem jede Konzentrationsreihe wurde dreifach gemessen. Die vertikalen Balken stellen die Standardfehler des Mittelwerts (SEM), die teilweise kleiner sind als die verwendeten Symbole (in diesem Fall nur die Symbole dargestellt). <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4.jpg" /> 4. Konzentration-Antwort-Kurven und die entsprechenden EC 50-Werte von Drosophila sNPF Peptide von drei unabhängigen Fluoreszenz basierenden Calciummobilisierungsassays bestimmt. Die Konzentrations-Wirkungs-Kurven der Drosopihla sNPF Rezeptor transient in HEK293T-Zellen für die vier Drosophila sNPF Peptide ausgedrückt sind das Ergebnis von drei unabhängigen michasurements jeweils dreifach durchgeführt (n ≥ 9). Die fluoreszierenden Reaktionen sind als relative (%) auf den höchsten Wert (100%-Aktivierung) gezeigt. Sternchen zeigen Konzentrationen für die n ≤ 9. Fehlerbalken zeigen SEM, die manchmal kleiner sind als die verwendeten Symbole (in diesem Fall nur die Symbole dargestellt). EC 50-Werte werden mit 95%-Konfidenzintervalle angegeben.

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Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Die hier beschriebene Fluoreszenz-basierten Calciummobilisierungsassay ist ein Medium-Durchsatz Rückwärts pharmakologischen Screening-System für die Identifizierung von funktionell aktivierenden Liganden (n) der Orphan-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs).

Charakterisierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren durch eine Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

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39.4K Aufrufe.  KU Leuven.  Die hier beschriebene Fluoreszenz-basierten Calciummobilisierungsassay ist ein Medium-Durchsatz Rückwärts pharmakologischen Screening-System für die Identifizierung von funktionell aktivierenden Liganden (n) der Orphan-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). 

Serie: Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

In vivo Quantifizierung der G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen mit spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Forschung

Biologie

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Imaging G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signaltransduktion, die Steuerung der Chemotaxis Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell or tissue. This process can be analyzed at the level of a single receptor, a population of receptors, or a downstream response. Here we describe how to analyze the downstream response to obtain an estimate of the agonist affinity constant for the active state of single receptors.
Receptors behave as quantal switches that alternate between active and inactive states (Figure 1). The active state interacts with specific G proteins or other signaling partners. In the absence of ligands, the inactive state predominates. The binding of agonist increases the probability that the receptor will switch into the active state because its affinity constant for the active state (Kb) is much greater than that for the inactive state (Ka). The summation of the random outputs of all of the receptors in the population yields a constant level of receptor activation in time. The reciprocal of the concentration of agonist eliciting half-maximal receptor activation is equivalent to the observed affinity constant (Kobs), and the fraction of agonist-receptor complexes in the active state is defined as efficacy (&#949;) (Figure 2).
Methods for analyzing the downstream responses of GPCRs have been developed that enable the estimation of the Kobs and relative efficacy of an agonist 1,2. In this report, we show how to modify this analysis to estimate the agonist Kb value relative to that of another agonist. For assays that exhibit constitutive activity, we show how to estimate Kb in absolute units of M-1.
Our method of analyzing agonist concentration-response curves 3,4 consists of global nonlinear regression using the operational model 5. We describe a procedure using the software application, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). The analysis yields an estimate of the product of Kobs and a parameter proportional to efficacy (&tau;). The estimate of &tau;Kobs of one agonist, divided by that of another, is a relative measure of Kb (RAi) 6. For any receptor exhibiting constitutive activity, it is possible to estimate a parameter proportional to the efficacy of the free receptor complex (&tau;sys). In this case, the Kb value of an agonist is equivalent to &tau;Kobs/&tau;sys 3.
Our method is useful for determining the selectivity of an agonist for receptor subtypes and for quantifying agonist-receptor signaling through different G proteins.

A method for estimating the affinity constant of an agonist for the active state (Kb) of a G protein-coupled receptor is described. The analysis provides absolute or relative measures of Kb depending on whether constitutive receptor activation is measurable. Our method applies to various responses downstream from receptor activation.

Die Quantifizierung der Wirkung als Agonist am G-Protein-gekoppelte Rezeptoren

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. It is likely to play a role in preventing accumulation of recombinogenic intermediates that would otherwise accumulate at transiently stalled replication forks, consistent with a hyper-recombinant phenotype of cells lacking WRN. In humans, the exonuclease domain comprises an N-terminal portion of a much larger protein that also possesses helicase activity, together with additional sites important for DNA and protein interaction. By contrast, in Drosophila, the exonuclease activity of WRN (DmWRNexo) is encoded by a distinct genetic locus from the presumptive helicase, allowing biochemical (and genetic) dissection of the role of the exonuclease activity in genome stability mechanisms. Here, we demonstrate a fluorescent method to determine WRN exonuclease activity using purified recombinant DmWRNexo and end-labeled fluorescent oligonucleotides. This system allows greater reproducibility than radioactive assays as the substrate oligonucleotides remain stable for months, and provides a safer and relatively rapid method for detailed analysis of nuclease activity, permitting determination of nuclease polarity, processivity, and substrate preferences.

Exonucleases play critical roles in ensuring genome stability. Loss of WRN exonuclease function results in premature aging. Studying substrates and other requirements of the nuclease in vitro can help elucidate its role in vivo. Here we demonstrate a rapid and reproducible fluorescence-based assay to measure its nuclease activity.

Ein Fluoreszenz-basierte Exonuklease Assay zu DmWRNexo, Ortholog der Menschen Progeroid WRN Exonuclease, und ihre Anwendung auf andere Nukleasen Charakterisieren

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Imaging G Protein-gekoppelten Rezeptor-vermittelte Chemotaxis und seine Signalereignisse in Neutrophilen-like HL60-Zellen

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group developed an intra-molecular FRET sensor to detect the interaction between G&#945; subunits and GPCRs in live cells following agonist stimulation. Here, we detail the protocol for detecting changes in FRET between the &#946;2-adrenergic receptor and the G&#945;s C-terminus peptide upon treatment with 100 &#181;M isoproterenol hydrochloride as previously characterized1. Our FRET sensor is a single polypeptide consisting serially of a full-length GPCR, a FRET acceptor fluorophore (mCitrine), an ER/K SPASM (systematic protein affinity strength modulation) linker, a FRET donor fluorophore (mCerulean), and a G&#945; C-terminal peptide. This protocol will detail cell preparation, transfection conditions, equipment setup, assay execution, and data analysis. This experimental design detects small changes in FRET indicative of protein-protein interactions, and can also be used to compare the strength of interaction across ligands and GPCR-G protein pairings. To enhance the signal-to-noise in our measurements, this protocol requires heightened precision in all steps, and is presented here to enable reproducible execution.

Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

G-Protein-selektive GPCR Konformationen gemessen mit FRET-Sensoren in einer Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

Detektion von Liganden-aktivierte G-Protein gekoppelten Rezeptor-Internalisierung durch konfokale Mikroskopie

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...