Wir möchten den Mitarbeitern und Wissenschaftlern der SBI für ihre Unterstützung bei der Entwicklung und Erprobung dieser Protokolle zu bestätigen.

1. Transfektion von Zellen mit 293TN Packaging Plasmide und das Expressionskonstrukt <ol><li> Samen von 7,0 bis 8,0 x 10 6 Zellen pro 293TN 15 cm 2 Kulturplatte in 20 ml Kulturmedium, das DMEM-Medium mit 4 mM L-Glutamin, 4,5 g / l Glucose und fötales Rinderserum (10%) ohne Antibiotika ergänzt. Wachsen für 18-24 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2, so dass die Zelldichte 60-80% Konfluenz erreicht zum Zeitpunkt der Transfektion. In einigen Fällen kann es notwendig sein, mehrere Platten Saatgut von Zellen, um eine ausreichend hohe Titer für die Transduktion von Zielzellen zu erhalten. </li><li> Für jede Platte von Zellen, fügen 1,6 ml serumfreiem DMEM einer autoklavierten 2 ml Eppendorff Rohr. In 45 ul pPACKH1 oder pPACKF1 und 4,5 ug Ihre lentivector zu konstruieren, um die DMEM zugeben und durch Auf-und Abpipettieren. </li><li> In 55 ul PureFection in das gleiche Rohr. Vortex für 10 Sekunden. Inkubieren Sie die DMEM-Plasmid-PureFection Mischung bei Raumtemperatur foder 15 min. </li><li> Fügen Sie das DMEM-Plasmid-Mischung auf die PureFection Gewebekulturplatte tropfenweise und behutsam schwenken, um gleichmäßig über die Platte zu verteilen. Senden Sie das Gericht in den Inkubator und wachsen bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Es besteht keine Notwendigkeit, die Medien nach der Transfektion zu ändern. Wenn Ihr lentivector Konstrukt drückt ein Gen für ein fluoreszierendes Protein wie GFP, überprüfen Sie Ihre Zellen unter einem Mikroskop 12-24 Stunden nach der Transfektion. Sie sollten in der Lage,&gt; 90% GFP-positive Zellen zu sehen, was darauf hinweist, dass die Transfektion erfolgreich war. </li><li> Sammeln der Zellkulturüberstand nach 48 und 72 Stunden in ein 50 ml steriles Zentrifugenröhrchen. Dieser Zellkulturüberstand enthält nun infektiöse Partikel pseudoviral. (Befolgen Sie die empfohlenen Richtlinien für die Arbeit mit BSL-2 Schutzklasse.) Zentrifuge bei 1.500 xg für 15 min bei Raumtemperatur zu Pellet die Zelltrümmer. Übertragen der viralen Überstand in ein neues Röhrchen, so dass nicht zu stören, um das Pellet. </li><li> 293TN Zellen, die für virale Verpackung verwendet wurden sollten in die dafür Behälters angeordnet sein und sind nicht für weitere Runden der viralen Verpackung verwendet werden. </li></ol> 2. Die Konzentration der viralen Überstand <ol><li> Fügen Sie ein Volumen von kaltem (4 ° C) PEG-it Virus Niederschlag Lösung aller 4 Bände von lentiviralen Partikel enthaltenden Überstand. Niederschlag von lentiviralen Partikel aus großen Volumina können mit Corning 250 ml Polypropylenzentrifugenröhrchen erreicht werden. Mischen Sie die Lösung durch Umdrehen der Röhrchen mehrere Male, aber nicht vortexen die Mischung. </li><li> Kühlschrank der Lösung bei 4 ° C für mindestens 12 Stunden (bis zu 4 Tage sind möglich). Nicht schütteln oder drehen die Rohre während der Kälte-Schritt. </li><li> Zentrifugieren der Überstand / PEG-Mischung ist bei 1.500 × g für 30 Minuten bei 4 ° C Nach der Zentrifugation werden die lentivirale Partikel als beige oder weiß Pellet am Boden des Röhrchens zu sehen. Gießen Sie das supernatant. </li><li> Entfernen Sie alle Spuren von Flüssigkeit durch Absaugen, dabei nicht um die abgeschiedenen Lentivirale Partikel im Pellet zu stören. Spuren von restlichen PEG-wird das Virus verdünnen (wodurch die Titer) aber keinen Einfluss auf die Integrität der Zielzellen, da es PEG-inert ist und nicht toxisch. </li><li> Resuspendieren und kombinieren Sie die lentiviralen Partikeln in 1/100 des ursprünglichen Volumens mit kaltem (4 ° C), steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung oder DMEM mit 25 mM HEPES-Puffer. </li><li> Aliquotieren in sterile Kryoröhrchen und bei -70 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 3. Virale Titrierung und Transduktion von Zielzellen <ol><li> Wir empfehlen die Titrierung Lentivirale Partikel vor Transduktion der Zielzellen-of-Interest und die Berechnung des jeweiligen Multiplizität der Infektion (MOI) für die Zielzellen für Kohärenz zwischen den Experimenten. Für virale Titerung, empfehlen wir die Verwendung HT1080-Zellen als einfach zu infizieren positive Steuerleitung. PlErleichterung fest, dass die Titrierung Protokoll transduzierenden HT1080-Zellen mit einem kleinen Aliquot der Lentivirale Partikel verpackt haben Sie sich bringt. Wenn der Titer bekannt ist, können die Zielzellen-von-Interesse auch mit den lentiviralen hergestellt Teilchen transduziert werden. : A empfehlen Titerung Protokoll finden Sie unter <a href="http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf</a> 7. </li><li> Tafel 50.000 Zielzellen-von-Interesse-pro Well in einer 24-Well-Platte in Zellkulturmedien. Verwenden Sie die Medien, dass die Zellen werden normalerweise in. wachsen die Zellen über Nacht bei ihr angegebenen Kulturbedingungen kultiviert. Die Zellen sind zwischen 50 bis 70% konfluent sein am Tag der Transduktion. </li><li> Am Tag der Transduktion, saugen die Medien aus den Zellen. Kombinieren Sie Kulturmedium mit TransDux zu einer Endkonzentration 1 x (z. B. 2,5 ul TransDux zu 500 ul Kulturmedium). Übertragen Sie anschließend die TransDux-CEll Kulturmedium Mischung in jede Vertiefung. </li><li> Pipettieren Sie das entsprechende Volumen des Virus, das auf die optimale MOI für die Zielzellen in jede Vertiefung entspricht. Wenn der optimale MOI unbekannt ist, empfehlen wir versuchen eine Reihe von verschiedenen MOI (z. B. einer MOI von 1, 2 und 5 für einfach zu infizieren Gewebekulturzellen, und einer MOI von 1, 10 und 20 für mehr schwer -primären Zellen zu infizieren). Wenn die Konzentration der lentiviralen Partikel nicht bekannt ist (wie durch einen Virus Titrierung Protokoll bestimmt) können unterschiedliche Mengen des Virus getestet, zum Beispiel 1, 2 und 5 ul-Virus werden. Das Virus kann in Kontakt mit den Zielzellen bleiben bis zu 72 Stunden. </li><li> Weitere Experimente mit den transduzierten Zielzellen-von-Interesse kann begonnen werden 72 Stunden nach Transduktion, wenn die viralen Konstrukts in das Genom der Wirtszelle integriert ist. Ändern Sie den mittel-und Durchgang der Zielzellen-of-Interest entsprechend ihren spezifischen Bedürfnissen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; Transfektion von Zellen 293TN Der Ausgangspunkt Dichte der 293TN Zellen ist entscheidend für eine erfolgreiche virale Verpackung. 293TN Zellen müssen zwischen 60 bis 80% konfluent Tag der Transfektion (2). Wenn die 293TN Zellen weniger als 60% konfluent sind, damit sie für ein paar Stunden, bevor die Transfektionseffizienz zu wachsen. Wenn die 293TN Zellen&gt; 80% konfluent sind, sollten sie vor der Transfektion ausplattiert werden. Bei Verwendung eines lentivector GFP exprimieren, sollte mindestens 90% der Zellen fluoreszieren 293TN grün 24 Stunden nach der Transfektion, die eine erfolgreiche Transfektion (Abbildung 3). Wenn weniger als 90% der Zellen GFP-positiv sind, nicht zu dem nächsten Schritt fort, da dies anzeigt, dass die Transfektion nicht erfolgreich war, und die viralen Titer niedrig sein wird. Stattdessen neue Platte 293TN Zellen und von vorn beginnen, um sicherzustellen, dass die 293TN Zellen an der richtigen Zelldichte sind vor Transfektion. 293TN Zellen können Abziehen des Gewebekulturplatten 48-72 Stunden nach der Transfektion. Dies gilt nicht negativ auf die Produktion von lentiviralen Partikeln. Titrieren mit HT1080-Zellen Virale Titer kann unter Verwendung SBI Global ultraschnellen Titrierung Kit nach den Anweisungen des Herstellers werden. Dieses System verwendet, um virale Integration qPCR der WPRE Sequenz aus der lentiviralen Vektors in HT1080-Zellen zu messen und vergleicht diese mit einer Standardkurve, basierend auf einer genomischen Referenzsequenz genau zu messen infektiösen Einheiten pro ml (Abbildung 4). Transduktion von Zielzellen Bei Verwendung von lentiviralen Partikel Ausdruck einer konstitutiv aktive GFP-Markierung, sollte GFP-positiven Zellen anfangen, innerhalb von 12-24 Stunden nach der Transduktion erscheinen, wenn die Reaktion Transduktion funktioniert. GFP-Expression sollte auch weiterhin nach dem lentiviralen Konstrukt stabil in ter Wirtszellgenom. Wenn Transduktion mit unterschiedlichen MOIs, sollte die GFP-Fluoreszenz ungefähr der MOI, wo niedrige MOIs zeigen weniger GFP-Fluoreszenz und höhere MOIs zeigen erhöhte GFP-Fluoreszenz (Abbildung 5). <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig1.jpg" alt="1" /> 1. Überblick über die virale Produktion Protokoll. Die lentivector und PPACK Verpackung Plasmide werden gemischt und in 293TN Zellen co-transfiziert. Nach 48 -72 Stunden, wird die virale Überstand gesammelt und viralen Partikel werden mit PEG-it ausgefällt. Nach Titrierung der lentiviralen Partikel, können sie verwendet, um die Zielzellen-of-Interest transduzieren werden. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3171/3171fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Phasenkontrast-Bild von 293TN Zellen. Zelle Density sollte zwischen 60-80% konfluent Tag der Transfektion werden. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> 3. Fluoreszenzbild von GFP-positiven 293TN Zellen 24 Stunden nach Transfektion mit Purefection, pPACKH1, und lentivector GFP-codierenden Konstrukts. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. WPRE qPCR Ergebnisse und Standardkurve unter Verwendung SBI Global ultraschnellen Titrierung Kit MOI und entsprechende Titer von verpackten viralen Partikel berechnen. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Bild 5. Fluoreszenzbilder von HT1080-Zellen transduziert mit steigenden Mengen von Lentivirus. Bilder von 72 Stunden nach der Transduktion.

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	<li>Cann, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA Viruses. A Practical Approach. , (2000).</li><li>Gould, D. J., Favorov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+for+the+treatment+of+autoimmune+diseases.">Vectors for the treatment of autoimmune diseases.</a> Gene Therapy. 10, 912-927 (2003).</li><li>Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfer,+integration,+and+sustained+long-term+expression+of+the+transgene+in+adult+rat+brains+injected+with+a+lentiviral+vector.">Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).</li><li>Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li><li>Dull, T., Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li><li>Federico, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lentivirus Gene Engineering Protocols. , (2003).</li><li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors.">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol. Ther. 1, 31-38 (2000).</li><li>Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells.">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343-1348 (2010).</li><li>Kim, A., Pyykko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters:+versatile+use+of+PiggyBac+transposons+as+a+genetic+manipulation+tool.">Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool.</a> Mol. Cell Biochem. , (2011).</li></ol>

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Diese virale Verpackung und Transduktion von Zielzellen-Protokoll wurde für die Verwendung mit viralen Verpackung SBI Reagenzien optimiert. Substitution anderer Reagenzien kann Einfluss auf das Ergebnis des Protokolls. Dieses Protokoll wurde nur für lentivirale Produktion optimiert und eignet sich daher nicht für die Herstellung anderer Arten von Viren oder pseudoviruses. Erfolgreiche viralen Verpackung hängt von mehreren wichtigen Schritte. Die 293TN Zellen exprimieren das SV40 große T-Antigen, die absolut notwendig für die Sekretion der lentiviralen Partikel in dem Zellkulturüberstand ist. Die Dichte, mit der die 293TN Zellen zum Zeitpunkt der Transfektion ist besonders wichtig, um für die PureFection Reagenz ausreichend übertragen lentivector und Verpackung Plasmide in die Zellen. Hinzufügen des PureFection Mischung auf die Gewebekultur Platte in einer Art und Weise tropfenweise durch gründliches Schwenken der Platte gefolgt ist für die Verbreitung der Verpackung Plasmide wichtigund lentivector in alle Zellen zu konstruieren. Die Nichteinhaltung entsprechend zu verteilen Die Vektoren können zu einer unzureichenden Lentivirale Partikel produziert führen. Die viralen Verpackung Reaktion kann bis zur Herstellung von Virus mit hohem Titer skaliert werden, basierend auf der Oberfläche der Gewebekulturplatten. Man kann an der Platte mehrere Gewebekulturschalen von 293TN Zellen pro Konstrukt, das die verpackt werden muss, wählen. Die Konzentration der viralen Überstände ist besonders hilfreich bei der Schaffung von High-Titer-Virus. Viralem Überstand aus mehreren Platten von Zellen kombiniert und konzentriert werden zur Verwendung in in-vivo-Experimente, oder Zellen, die schwer zu transduzieren. Titrierung der produzierten lentiviralen Partikel ist für die Berechnung eine genaue MOI für die Transduktion von Zielzellen verwenden wichtig. Die Kenntnis der MOI dass wurde in einer vorgegebenen Transduktion verwendet wird, ermöglicht Problemlösungen den Fall, dass die Transduktion nicht erfolgreich ist. Zum Beispiel, unter Verwendung eines MOI dhzu niedrig, kann in sehr wenigen Zellen, die das Ziel-Konstrukt-of-Interest führen. Mit einer MOI, die zu hoch ist, kann jedoch in Zielzellen, die Anzeichen von Stress zeigen, führen. Das Ziel ist es, ein MOI, die Expression des Konstrukts-von-Interesse maximiert und gleichzeitig die Gesundheit der Zellen zu verwenden. Während wir eine qPCR-basierte Titerung Protokoll, das integrierte Kopien des lentiviralen Konstrukt in HT1080-Zellen Maßnahmen zu empfehlen sind auch andere Ansätze Titerung auch verwendet, wie zB p24 ELISA oder Abschätzung der Prozent der GFP-positiven Zellen werden. Erfolgreiche Transduktion von Zielzellen hängt auch von mehreren Schlüsselfaktoren. TransDux ist eine einzigartige Infektion Reagenz mit hoher Transduktionswirksamkeiten ermöglicht, aber das ist für Zellen nicht toxisch. TransDux kann anstelle von Polybren, die oft toxisch für die Zielzellen verwendet werden. Aufnahme TransDux bei der Transduktion von Zielzellen hilft Ladungen auf den viralen Teilchen zu neutralisieren und ermöglicht das Virus in die Zelles. Da TransDux nicht toxisch für die Zellen, kann man es den lentiviralen Partikel in Kontakt mit den Zellen für bis zu 72 Stunden (der Zeitpunkt, zu dem die viralen Konstrukte in das Genom der Wirtszelle integriert haben) bleiben, wodurch die Wahrscheinlichkeit der virale Partikel in die Zelle eintritt. Für manche schwer zu transduzieren Zellen können Transduktionen an aufeinanderfolgenden Tagen wiederholt werden, um die Transduktionseffizienz zu steigern. Zum Beispiel transduzieren die Zellen an Tag 1, um die Zellen an Tag 2 zu liegen, und dann die Zellen transduzieren wieder am Tag 3. Es ist wichtig zu 72 Stunden nach der letzten Transduktion vor Beginn Auswahl, weitere Experimente oder Charakterisierung der Zielzellen zu warten. Effiziente viralen Verpackung ist auch abhängig von der Größe des lentiviralen Konstrukt, zwischen dem 5 &#39;und 3&#39;-LTR Regionen. Dieser Abschnitt des lentiviralen Konstrukt sollte etwa 9 kb oder weniger, die der Größe des nativen HIV-Genoms entspricht. Mehr als 9 kb de MaiAnstieg der Titer der produzierten pseudoviral Partikel. Neue Technologien, wie zum Beispiel piggyBac Transposon-Vektoren, für eine zuverlässige, stabile Integration der Transgene bis zu 100 kb über ein einziges Transfektion ermöglichen. Dieser Ansatz kann für Konstrukte, die die maximale Größe für lentivirale Vektoren, in Fällen, wo es möglich ist, Zielzellen zu transfizieren überschreitet verwendet werden, und bietet den zusätzlichen Vorteil, dass keine für ein virales Verpackungsschritt 9,10. Die pseudoviral Teilchen erzeugt mit diesem Protokoll sind infektiös, da sie die meisten Säuger-Zelltypen zu infizieren. Die in diesem Protokoll verwendet, jedoch sind der dritten Generation in BIOSAFE, die sie produzieren nicht-replikativen und Selbst-inaktivierende pseudoviruses. Daher wird, sobald transduziert in Zielzellen oder Tieren, die Ziel-Zellen oder Tiere sind nicht infektiös oder ansteckend. Die Substitution von anderen lentivector Plasmide, die nicht der dritten Generation BIOSAFE ist möglich wenn auch nicht aus einer biologischen Sicherheit empfohlenPerspektive. Die virale Produktion Protokoll und nachfolgende Transduktion von Zielzellen sollten unter biologischen Sicherheitsstufe 2 durchgeführt werden, nach den NIH-Richtlinien 11 und Forscher sollten immer einen Laborkittel und Handschuhe beim Umgang mit den Viruspartikeln. Gebrauchte 293TN Produzent Zellen sind Tuben von Viruspartikeln und Einwegpipetten der in einem entsprechenden Behälter für biologischen Sondermüll entsorgt werden. Wieder verwendbare Pipetten und Gläser sind mit Bleichmittel dekontaminiert werden und Autoklavieren, um die Exposition des Personals zu verringern.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM high glucose Medium </td><td> Gibco </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> 293TN Cells </td><td> SBI </td><td> LV900A-1 </td><td></td></tr><tr><td> pPACKH1 </td><td> SBI </td><td> LV500A-1 </td><td> Für HIV-basierten lentivectors </td></tr><tr><td> pPACKF1 </td><td> SBI </td><td> LV100A-1 </td><td> Für FIV-basierten lentivectors </td></tr><tr><td> Jede lentiviralen Vektors </td><td> SBI </td><td> Verschiedene </td><td> cDNA, shRNA, miRNA, Transkriptions-Reporter </td></tr><tr><td> PureFection </td><td> SBI </td><td> LV750A-1 LV750A-5 </td><td></td></tr><tr><td> PEG-it </td><td> SBI </td><td> LV810A-1 LV825A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Globale ultraschnellen Titrierung Kit </td><td> SBI </td><td> LV961A-1 </td><td> Nicht in diesem Protokoll beschrieben, aber notwendig, um die virale Partikel zu titrieren </td></tr><tr><td> TransDux </td><td> SBI </td><td> LV850A-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

packaging hiv- or fiv-based lentivector expression constructs &amp; transduction of vsv-g pseudotyped viral particles

Wie bei Standard-Plasmid-Vektoren, ist es möglich, lentivectors in Form Plasmid in Zellen mit niedriger bis mittlerer Wirkungsgrad zu transfizieren, um die transiente Expression von Effektoren zu erhalten. Verpackung lentiviralen Expressionskonstrukte in pseudoviral Partikel ermöglicht jedoch bis zu 100% Transduktion, auch mit schwer zu transfizierende Zellen, wie primäre, Stammzellen und differenzierten Zellen. Darüber hinaus lässt der lentiviral nicht zu den spezifischen zellulären Reaktionen typischerweise mit chemischen Transfektionen, wie der Zelltod durch Toxizität des Transfektionsreagenz 1, 2 verbunden. Wenn transduziert in Zielzellen, integriert das lentivirale Konstrukt in die genomische DNA und liefert eine stabile Expression des kleinen doppelsträngige RNA (shRNA), cDNA, microRNA oder Reportergen 3, 4. Ziel-Zellen, die Effektor-Molekül isoliert unter Verwendung einen selektierbaren Marker in dem Expressionsvektor wie Puromycin oder GFP-Konstrukt enthalten sein. Nach pseudoviral Teilchen Zielzellen zu infizieren, können sie nicht in Zielzellen zu replizieren, da die viralen Strukturgenen fehlen und die langen terminalen Wiederholungen (LTR) ausgelegt sind, sich selbst-inaktivierende nach Transduktion 5, 6. Es gibt drei wesentliche Komponenten, die für effizienten lentiviralen Verpackung 1, 5, 6, 7. <ol><li> Die lentiviralen Expressionsvektor, der einige der genetische Elemente für eine Verpackung enthält, eine stabile Integration der viralen Expression in genomische DNA-Konstrukt, und die Expression des Effektor oder Reporter. </li><li> Die lentiviralen Verpackung Plasmide, die die Proteine ​​liefern wesentlich für die Transkription und Verpackung von einer RNA-Kopie des Ausdrucks in rekombinante pseudoviral Partikel zu konstruieren. Dieses Protokoll verwendet die PPACK Plasmide (SBI), die für gag codieren, pol und rev aus dem HIV-oder FIV-Genoms und vesikuläre Stomatitis Virus G-Protein (VSV-G) für das virale Hüllprotein. </li><li> 293TN produzieren<html> r Zellen (abgeleitet von HEK293-Zellen), die das SV40 große T-Antigen, das für HD-Titer lentiviralen Produktion und ein Neomycin-Resistenzgen, nützlich für erneute Auswahl der Zellen für eine Wartung erforderlich ist exprimieren. </li></ol> Ein Überblick über die virale Produktion Protokoll kann in 1 gesehen werden. Virale Produktion beginnt durch Co-Transfektion 293TN Produzentenzellen mit dem lentiviralen Expressionsvektor und der Verpackung Plasmide. Virale Partikel werden in das Medium sekretiert. Nach 48-72 Stunden die Zellkulturmedien geerntet wird. Zelltrümmer aus dem Zellkulturmedium entfernt, und die viralen Partikel werden durch Zentrifugation mit PEG-Konzentration es ausgefällt. Hergestellte lentiviralen Partikel werden dann titriert und kann verwendet werden, um Zielzellen zu transduzieren. Details der viralen Titerung sind nicht in diesem Protokoll enthalten, aber sind zu finden unter: ANK &quot;&gt; http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8. Dieses Protokoll wurde optimiert mit den spezifischen Produkten angegeben. Andere Reagenzien können substituiert sein, aber die gleichen Ergebnisse nicht gewährleistet werden kann.

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Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Lentivirale Expressionsvektoren sind die wirksamsten Fahrzeuge für verschiedene stabil exprimieren Effektormoleküle oder Reporter-Konstrukte in Teilen auch sich nicht teilende Säugerzellen und ganzen Organismen. Hier stellen ein Protokoll, wie lentivector Expressionskonstrukte in pseudoviral Teilchen zu verpacken und Zielzellen unter Verwendung der pseudoviral Teilchen zu transduzieren.

Verpackung HIV-oder FIV-basierten Lentivector Expressionskonstrukte und Transduktion von VSV-G-pseudotypisierte Viruspartikel

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

packaging-hiv-or-fiv-based-lentivector-expression-constructs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.9K Aufrufe.  System Biosciences. Lentivirale Expressionsvektoren sind die wirksamsten Fahrzeuge für verschiedene stabil exprimieren Effektormoleküle oder Reporter-Konstrukte in Teilen auch sich nicht teilende Säugerzellen und ganzen Organismen. Hier stellen ein Protokoll, wie lentivector Expressionskonstrukte in pseudoviral Teilchen zu verpacken und Zielzellen unter Verwendung der pseudoviral Teilchen zu transduzieren.

Serie: Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Verstärkung und Quantifizierung von HIV-1 RNA in HIV-infizierten Personen mit Viruslast unter der Nachweisgrenze von Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

Vaccinia-Viren Reporter zur Quantifizierung von Viral-Funktion auf allen Stufen der Genexpression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be difficult. To overcome this challenge, a methodology combining indexed flow cytometry and high-throughput multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was developed. The objective was to identify and characterize simian immunodeficiency virus (SIV)-infected cells present within rhesus macaques. Through quantitation of surface protein by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mRNA by qPCR, virus-infected cells are identified by viral gene expression, which is combined with host gene and protein measurements to create a multidimensional profile. We term the approach, targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation, or tSCEPTRE. To perform the method, viable cells are stained with fluorescent antibodies specific for surface markers used for FACS isolation of a cell subset and/or downstream phenotypic analysis. Single cells are sorted followed by immediate lysis, multiplex reverse transcription (RT), PCR pre-amplification, and high throughput qPCR of up to 96 transcripts. FACS measurements are recorded at the time of sorting and subsequently linked to the gene expression data by well position to create a combined protein and transcriptional profile. To study SIV-infected cells directly ex vivo, cells were identified by qPCR detection of multiple viral RNA species. The combination of viral transcripts and the quantity of each provide a framework for classifying cells into distinct stages of the viral life cycle (e.g., productive versus non-productive). Moreover, tSCEPTRE of SIV+ cells were compared to uninfected cells isolated from the same specimen to assess differentially expressed host genes and proteins. The analysis revealed previously unappreciated viral RNA expression heterogeneity among infected cells as well as in vivo SIV-mediated post-transcriptional gene regulation with single-cell resolution. The tSCEPTRE method is relevant for the analysis of any cell population amenable to identification by expression of surface protein marker(s), host or pathogen gene(s), or combinations thereof.

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Described is a methodology to quantitate the expression of 96 genes and 18 surface proteins by single cells ex vivo, allowing for the identification of differentially expressed genes and proteins in virus-infected cells relative to uninfected cells. We apply the approach to study SIV-infected CD4+ T cells isolated from rhesus macaques.

Einzellige Quantifizierung der mRNA und Oberfläche Protein-Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infizierten CD4+ T Zellen isoliert von Rhesus-Makaken

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

Ein High-Throughput Cre-Lox aktiviert virale Membran Fusion Assay Ermittlung Inhibitoren der HIV-1 Virus Membranfusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Produktion von Pseudotyped Partikel hoch pathogene Coronaviren in eine Einstellung "Biosafety Level 2" zu studieren

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Herstellung von hochtiterinfektiösen Influenza-Pseudotyppartikeln mit Hülllykoproteinen aus hoch pathogenen H5N1- und Avian H7N9-Viren

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Bewertung der Serumneutralisation gegen SARS-CoV-2 mit pseudotypisierten Viren

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in addition to their better-known use in gene therapy for the delivery of a gene of interest. PVs are replication defective because the viral genome is divided into different plasmids that are not incorporated into the PVs. This safe and versatile system allows the use of PVs in biosafety level 2 laboratories. Here, we present a general methodology to produce lentiviral PVs based on three plasmids as mentioned here: (1) the backbone plasmid carrying the reporter gene needed to monitor the infection; (2) the packaging plasmid carrying the genes for all the structural proteins needed to generate the PVs; (3) the envelope surface glycoprotein expression plasmid that determines virus tropism and mediates viral entry into the host cell. In this work, SARS-CoV-2 Spike is the envelope glycoprotein used for the production of non-replicative SARS-CoV-2 pseudotyped lentiviruses.
Briefly, packaging cells (HEK293T) were co-transfected with the three different plasmids using standard methods. After 48 h, the supernatant containing the PVs was harvested, filtered, and stored at -80 &#176;C. The infectivity of SARS-CoV-2 PVs was tested by studying the expression of the reporter gene (luciferase) in a target cell line 48 h after infection. The higher the value for relative luminescence units (RLUs), the higher the infection/transduction rate. Furthermore, the infectious PVs were added to the serially diluted serum samples to study the neutralization process of pseudoviruses' entry into target cells, measured as the reduction in RLU intensity: lower values corresponding to high neutralizing activity.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung von Wirt-Virus-Interaktionen mit pseudotypisierten Viren 

Pseudotyped viruses (PVs) are replication-defective virions that are used to study host-virus interactions under safer conditions than handling authentic viruses. Presented here is a detailed protocol that shows how SARS-CoV-2 PVs can be used to test the neutralizing ability of patients' serum after COVID-19 vaccination.

Pseudotypisierte Viren als molekulares Werkzeug zur Überwachung humoraler Immunantworten gegen SARS-CoV-2 mittels Neutralisationsassay

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...