LentiviralE Vektorplattform haben einen großen Vorteil gegenüber der beliebtesten Vektorplattform, insbesondere wegen der Fähigkeit von lentiviralen Vektoren, größere genetische Einsätze aufzunehmen. So scheint es, dass der lentivirale Vektor die Plattform der Wahl in der Anwendung wäre, die die Lieferung von CRISPR/Cas-Tools beinhaltet. Diese Technik imitiert den natürlichen Regulierungsmechanismus der Alpha-Synuclein-Expression, die, wenn sie beeinträchtigt sind, mit Krankheiten verbunden sind.
Es ermöglicht eine Feinabstimmung der Expressionsebene im Vergleich zu robusten Veränderungen in der Genexpression. Ich würde dringend empfehlen, diese oder ähnliche Ansätze mit mehreren Guide RNAs für das Screening zu validieren. Es gibt eine große Variabilität in der Rna-Potenz des Führers.
Die einzige Möglichkeit, es zu bestimmen, ist ein robustes und umfassendes Screening und Validierung. Das entwickelte System kann leicht an andere Modellsysteme wie Tiermodelle wie Nagetier und nichtmenschliche Primaten angepasst werden. Diese Folgeexperimente könnten als Beweis für zukünftige klinische Studien dienen.
Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Ekaterina Ilich, einer leitenden Mitarbeiterin meines Labors, die sich auf die Durchführung des molekularen Klonverfahrens zur Herstellung von Lentiviral Vector Plasmiden im Zusammenhang mit diesem Projekt konzentriert. Sie wird auch die wichtigsten Schritte bei der Herstellung von Lentiviral Vector demonstrieren. Ebenfalls das Verfahren demonstrieren wird Dr.Lidia Tagliafierro, ein Postdoc aus meinem Labor, der sich auf die Differenzierung menschlicher iPS-Zellen in pathologisch relevante Zellen konzentriert.
Sie wird die wichtigsten Schritte zur Erstellung von Assays zur Bewertung der Methylierungsprofile von Synuclein intron1 demonstrieren. Ahila Sriskanda, eine Mitarbeiterin in meinem Labor, die sich auf die Kultur menschlicher iPS-Zell-abgeleiteter neuronaler Vorläuferzellen konzentriert. Entwickeln Sie zunächst die Katalysedomäne DNMT3A aus dem d-Cas9-DNMT3A-GFP, indem Sie den DNMT3A-Teil des Vektors verstärken.
Nach der Verdauung des DNMT3A-Fragments mit einem BamH1-Restriktionsenzym. Cloat es in die BamH1-Stelle des modifizierten PBK-301 Vektors tragen d-Cas9 und durch direkte Sanger-Sequenzierung verifiziert, um das reine Meiden-Reporter-Gen und das resultierende Plasmid mit GFP digest d-Cas9-DNMT3A-P2A reines Meiden und Plasmid mit FSC 1 zu ersetzen. Reinigen Sie das Vektorfragment mit einer Gelreinigungsmethode.
Bereiten Sie den Einsatz vor, indem Sie PBK-201 mit FSC-1 verdauen. Klonen Sie das FSC 1-Fragment in den Vektor, um d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP zu erstellen. 15 Zentimeter Platten mit 0,2% Gelatine für die Transfektion beschichten und 10 Minuten warten.
Dann die Gelatine aspirieren und 22,5 Milliliter hochglukosemedium und 2,5 Milliliter zuvor kultivierte HEK-293T Zellsuspension hinzufügen. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 bis zu 70 bis 80% Zusammenfluss. Um die Plasmidmischung vorzubereiten, die für 115 Zentimeter Platte ausreicht, verwenden Sie die vier plasmiden, die im Manuskript beschrieben sind.
Fügen Sie 312,5 Mikroliter eines Molaren-Calciumchlorids mit den Plasmiden in die gleiche 15-Milliliter-Röhre und bringen Sie das Endvolumen mit sterilem Doppeldestilliertem Wasser auf 1,25 Milliliter. fügen Sie vorsichtig 1,25 Milliliter von zwei X BBM Lösung fallen weise auf die Röhre während des Wirbelns. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Das Medium aus den Zellen absaugen und 22,5 Milliliter frisch zubereitetes DMEM mit hoher Glukose ohne Serum hinzufügen. Fügen Sie 2,5 Milliliter der Transfektionsmischung tropfen weise auf jede Platte. Wirbeln Sie die Platten und inkubieren bei 37 Grad Celsius mit 5%CO2 für zwei bis drei Stunden nach der Inkubation fügen Sie 2,5 Milliliter Serum pro Platte, um 10% Verdünnung zu erreichen und über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5%CO2 inkubieren.
Um das Virus zu ernten, sammeln Sie den Überstand aus allen transfizierten Zellen und ziehen Sie sie in 50 Milliliter konische Röhren. Zentrifuge bei 400 bis 450 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur und filtert dann den Überstand durch 0,45 Mikrometer Vakuumfiltereinheit. Als nächstes erstellen Sie einen Saccharosegradienten durch die Vorbereitung konischer Ultrazentrifugationsrohre.
Fügen Sie den gefilterten Überstand vorsichtig zum Gradienten hinzu, indem Sie den viralen Überstand gleichmäßig auf jedes Ultrazentrifugationsrohr verteilen, das mindestens drei Viertel jedes Rohres füllt. Zentrifugieren Sie die Proben bei 70000 g für zwei Stunden bei 17 Grad Celsius. Sammeln Sie 30% bis 60% Saccharose-Fraktionen vorsichtig in saubere Rohre fügen kalte 1X PBS bis zu 100 Milliliter Gesamtvolumen und Pipette mehrmals zu mischen.
Fügen Sie vorsichtig vier Milliliter 20%Saccharose in 1X PBS zu jeder Röhre hinzu, um die virale Zubereitung zu schichten, indem Sie etwa 20 bis 25 Milliliter der viralen Lösung pro Röhre pipetieren. Die Rohre vorsichtig balancieren und dann bei 70000 g zwei Stunden bei 17 Grad Celsius zentrieren. Sorgsam die restliche Flüssigkeit ansaugen, um die gesamte Flüssigkeit vollständig zu entfernen, sodass das Virus Pellets enthält, die als kleine transluzente Flecken kaum sichtbar sind.
Nach dem Entleeren des Überstandes invertieren Sie die Rohre auf Papiertüchern, damit die restliche Flüssigkeit abfließen kann. Fügen Sie 70 Mikroliter 1X PBS in das erste Rohr und gründlich Pipette, um das Pellet wieder aufzuhängen. Übertragen Sie die Suspension auf das nächste Rohr und wiederholen Sie sie mit Pipettierung und Übertragung, bis alle Pellets wieder aufgehängt sind.
Fügen Sie dem ersten Rohr weitere 50 Mikroliter 1X PBS hinzu und mischen Sie es, um es zu waschen. Dann die Suspension auf das zweite Rohr zum Waschen und weiterwaschen und wie bisher übertragen, ergibt sich ca. 120 Mikroliter der leicht milchigen Endsuspension. Zentrifuge bei 10000 g für 60 Sekunden, um eine klare Suspension zu erhalten, übertragen Sie den Überstand auf ein neues Rohr und machen Fünf Mikroliter aliquot und speichern Sie sie bei negativen 80 Grad Celsius legen Sie einen Cryovial mit MD NPC in 37 Grad Celsius Wärmeblock für zwei Minuten und übertragen Sie die aufgetauten Zellen auf ein 15 Milliliter konisches Rohr mit 10 Milliliter n warmen DMEM-F12.
Zentrifuge bei 300 g für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern vorgewärmtem vollständigen N2B2-Medium. Fügen Sie zwei Milliliter N2B27 in die Zellsuspension und Platte zwei Milliliter Zellen in jedem Brunnen der zuvor vorbereiteten BMM kodiert sechs WellPlatte.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 über Nacht. Wenn MD-NPCs bei 70 % Konfluss sind, transducieren Sie sie, indem Sie zwei Mikroliter Lentivirus-Führungs-RNA d-Cas9-DNMT3A-Vektoren hinzufügen und die Platte sanft wirbeln. Nach der Inkubation der Zellen unter den gleichen Bedingungen wie zuvor für 16 Stunden ersetzen Sie die N2B27 Medium 48 Stunden nach der Transduktion.
Fügen Sie N2B27 mit fünf Mikrogramm pro Milliliter reinen Meiden hinzu, um die stabilen MD-NPC-Linien zu erhalten, wachsen Sie die Zellen für drei Wochen in N2B27 plus reinem Meiden, um das Methylierungsprofil von SNCA intron 1 zu charakterisieren. Extrahieren Sie zunächst DNA aus jeder stabilen Transducer-Zelllinie mit einem DNA-Extraktionskit, dann verwenden Sie 800 Nanogramm DNA, um eine Bisulfidumwandlung mit einem handelsüblichen Kit durchzuführen, und dann wandelte ein Bisulfid DNA in 20 Nanogramm pro Mikroliter um. Für die Pyro-Sequenzierungsanalyse bereiten Sie den PCR-Master-Mix in einem Kernfreirohr vor, übertragen Sie die Reaktionsplatte auf einen Thermocycler und starten Sie die PCR.
Visualisieren Sie die Amplicons mit zwei MikroliterPCR-Produkt mit einer 30- und Bromidfärbung nach Agarose-Gelelektrophorese. Für pyrosequenzierende Assays wurden Mischungen von nicht methyliert und methyliert durch Sulfid umgewandelte DNAs und Pyrosequenzierungsreagenzien verwendet, wie im Manuskript beschrieben. Berechnen Sie die Methylierungswerte für jeden CPG-Standort mit pyrosequenzierenden Software physikalischen Erträgen von Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP Vektor und der Naive GFP Vektor mit diesem Protokoll generiert sind vergleichbar.
Dies deutet darauf hin, dass der Nutzen des optimierten Vektor-Backbones in Kombination mit dem optimierten Produktionsprotokoll zu hohen Erträgen führt, die der CRISPR-dCas9-Vektortransduktionsraten des Lentivirus d-Cas9-DNMT3 GFP-Vektors um das Vierfache unter denen des Naive GFP-Vektors liegen, was darauf hindeutet, dass die Verpackungseffizienz der CRISPR d-Cas9-RNA reduziert wird. Die Transduktionsraten des Naive PURO Vektors waren fünfmal höher als der d-Cas9-DNMT3A-Vektor. Diese Ergebnisse wurden durch die Verwendung des Naive GFP und d-Cas9-DNMT3A-GFP weiter bestätigt.
Das hier beschriebene EB-basierte Protokoll ermöglicht die Differenzierung von MD-NPCs. hiPSCs drückten Dengen-Potenzmarker Oct4 aus, während der MD NPC sowohl Nestin als auch FoxA2 exprimiert wird. Sieben Pyrosequenzierungs-Assays wurden für die Quantifizierung des Methylierungsstatus im SNCA-Intron 1 konzipiert und validiert.
Alle 7 Assays wurden validiert und zeigten eine lineare Korrelation, wobei es mit den validierten Assays möglich war, die Methylierungswerte an den 23 CPGs im SNCA intron 1 zu bestimmen. Die Produktion von Linsenvektoren, die in dieser Präsentation hervorgehoben werden, kann leicht zur Produktion von Integralen mit mangelhaften Viren übernommen werden, die auch leicht skaliert werden können, um größere Mengen oder konzentriertere Vektoren zu erzeugen. Diese Technik kann den Weg ebnen, um die pathogenen Auswirkungen der Deregulation von Genen auf das Alter oder die generativen Erkrankungen einschließlich der Alzheimer-Krankheit und damit zusammenhängende Demenzerkrankungen zu erforschen.
Der Vorteil von Linsenvektoren, die hier entstehen, ist, dass es nicht gefahroder oder nicht infektiöse Linsenvektoren haben nur minimale Auswirkungen auf den Zellzyklus sie sind sicher und zuverlässige Bereitstellungplattform für Gentherapie-Anwendungen.
