Diese Arbeit wurde von der Profileringsfonds azM (PF245) unterstützt.

TEIL I: Erregeridentifizierung 1. Probenvorbereitung Hinweis: Der gesamte Workflow als molekulare wird im folgenden beschriebenen Protokoll sollte nach Empfehlungen für die Qualitätssicherung in der molekularen Diagnostik 3 durchgeführt werden. <ol><li> Fügen Sie ein 0,1 ml Aliquot der Blutkultur bis 0,9 ml 0,9% NaCl in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß auf eine 1:10 verdünnte Probe zu werden. (Zu verdünnen, um qPCR-Hemmung zu verhindern). </li><li> Zentrifuge Proben bei 13.400 × g für 5 min auf die bakterielle DNA Pellet. </li><li> Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 100 ul sterilem demineralisiertem H 2 O. </li><li> -Store der DNA-Probe bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol> 2. Identification Test: Real-time PCR-16S rDNA <ol><li> Planen der Reaktionsgemische wie folgt. Der Assay besteht aus vier getrennten Reaktionen pro Probe. Jede Mischung enthält 12,50 ul MasterMix, 0,9 um Forward-Primer (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) 7, 0,6 um Reverse-Primer (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) 8 und eine Serie von Sonden. Die Menge an Sonden für jede der vier getrennten Reaktionen in unten angegeben. </li><li> Die erste Reaktion umfasst: <ul><li> 0,2 uM universelle Sonde (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 8 </li><li> 0,2 uM P. aeruginosa-Sonde (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1) </li></ul></li><li> Die zweite Reaktion beinhaltet: <ul><li> 0,2 uM E. coli-Sonde (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1) </li><li> 0,2 uM Pseudomonas spp. Sonde (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ) </li></ul></li><li> Die dritte Reaktion umfasst: <ul><li> 0,2 uM Staphylococcus spp. Sonde (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ) </li><li> 0,2 uM S. aureus Sonde (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1) </li><li> 0,2 uM Enterococcus spp. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1) </li></ul></li><li> Die vierte Reaktion umfasst: <ul><li> 0,2 uM universelle Sonde (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) </li><li> 0,3 uM Streptococcus spp. Sonde (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ) </li><li> 0,2 uM S. pneumoniae-Sonde (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1) </li></ul></li><li> In sterilem demineralisiertem H 2 O auf ein Gesamtvolumen von 20 ul zu erreichen. Je 20 ul jeder Reaktionsmischung auf die Vertiefungen einer 96-well PCR-Platte. </li><li> 5 l der Probe in jede Vertiefung. </li><li> Verwenden Sie eine Klebefolie, die 96-well PCR-Platte zu versiegeln. </li><li> Führen Sie die Platte auf dem ABI PRISM 7900 HT Real Time PCR System mit den folgenden optimalen thermischen Bedingungen Radfahren: <ul><li> Vorheizung bei 50 ° C für 10 min </li><li> Initiale Denaturierung bei 95 ° C für 15 min </li><li> 42 Zyklen von <ul type="circle"><li> Denaturierung bei 95 ° C für 15 s </li><li> Annealing bei 60 ° C für 1 min </li></ul></li></ul></li></ol> 3. Analyse der Ergebnisse <ol><li> Stellen Sie die Schwelle der CT-Analyse zu 0,1 auf der Registerkarte Analysis Settings. Grenzen Sie die Basiskonfigurationen zu Start (Zyklus): 6 und End (Zyklus): 15. </li><li> Nehmen Sie die Schwellenwert-Zyklus (Ct)-Wert für alle Proben. Die Cut-Off-Wert, um ein PCR-Ergebnis positiv betrachten kann, um ein CT-Wert von 35 eingestellt werden. Die Menge der Bakterien in Blutkulturen reichten von 10 7 bis 10 11 KBE / ml, Erzeugen Ct-Werte unterhalb von 35. </li></ol> TEIL II: Antibiotikaempfindlichkeit TESTS 4. Isolierung von Bakterien aus positiven Blutkulturen 9 <ol><li> Saugen 5 ml Brühe aus einem positiven Blutkulturflasche und übertragen sie in eine Serumtrennröhrchen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Serumtrennröhrchen bei 2000 xg für 10 min. </li><li> Verwerfen Sie den Überstand aus der Serumtrennröhrchen. </li><li> Transfer-bacrien von der Gelschicht des Rohres mit einem sterilen Wattestäbchen in 0,9% Kochsalzlösung, bis eine 0,5 McFarland-Standard Suspension erhalten wird. </li></ol> 5. Inokulation von Mikrotiterplatten <ol><li> Verdünnen Sie die 0,5-McFarland-Suspension in doppelt konzentrierter Mueller Hinton II Bouillon um eine Suspension von 5 x 10 5 KBE / ml bilden. </li><li> Dieses Suspension auf die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit einer Auswahl von Antibiotika (Tabelle 1). </li><li> Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte bei 37 ° C für 6 Stunden. </li><li> Bewahren Sie einen aliquoten Teil der Suspension bei 4 ° C (als negatives Wachstum Steuerung). </li><li> Nach 6 h Inkubation, übertragen Sie den Inhalt jeder Vertiefung in ein steriles Röhrchen, sowie die negativen Wachstumskontrolle, die Probe wurde bei 4 ° C gelagert </li><li> Zentrifugieren bei 16000 × g für 5 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Bakterienpellet. </li><li> Das Pellet in sterilem demineralisiertem H <sub&gt; 2 O. </li><li> Verdünnen Sie die Proben 10-fach in sterilem demineralisiertem H 2 O. </li></ol> 6. Real-time PCR-16S-rDNA-10 <ol><li> Bereiten Sie den PCR-Ansatz wie folgt: <ul><li> 12,50 ul iQ SYBR Green Supermix </li><li> 0,5 uM Vorwärtsprimer 16S-1-(5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 11 </li><li> 0,25 uM Rückwärtsprimer 16S-2 (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 11 </li><li> steril VE-H 2 O auf ein Gesamtvolumen von 20 ul </li></ul></li><li> In 20 ul PCR-Gemisch in die Vertiefungen einer 96-well PCR-Platte. </li><li> 5 l der Probe in jede Vertiefung. </li><li> Verwenden Sie eine Klebefolie, die 96-well PCR-Platte zu versiegeln. </li><li> Führen Sie die Platte auf dem MyiQ einfarbige Real-Time PCR Detection System, mit Hilfe der folgenden optimalen thermischen Bedingungen Radfahren: <ul><li> Initiale Denaturierung bei 95 ° C für 4 min </li><li> Anfängliche Anlassen bei 65 ° C für 30 s </li><li> 35 Zyklen von <ul><li> Denaturierung bei 95 ° C für 15 s </li><li> Annealing bei 60 ° C für 1 min </li></ul></li><li> Schmelzkurvenanalyse (60 bis 95 ° C in 20 Min. in Schritten von 0,57 ° C) </li></ul></li></ol> 7. Analyse der Ergebnisse <ol><li> Berechnen Sie die Hell-Dunkel-Ct-Wert unter Verwendung einer der folgenden Formeln (je nach Art des Antibiotikums). <ul><li> Im Allgemeinen: Cut-off-Wert = Ct Ct-Wert ein positives Wachstum Kontrolle + 0,5 x (Ct-Wert ein negatives Wachstum Kontrolle - Ct-Wert ein positives Wachstum Kontrolle) </li><li> Piperacillin, Piperacillin / Tazobactam und Ceftazidim in Gram-negative Stäbchen, Amoxicillin, Oxacillin und Trimethoprim / Sulfamethoxazol in S. aureus; Amoxicillin in Enterococcus spp. Cut-off-Wert = Ct Ct-Wert ein positives Wachstum Steuerung + 0,25 x (Ct-Wert ein negatives Wachstum Kontrolle - Ct-Wert ein positives Wachstum Kontrolle) </li></ul></li><li> Verwenden Sie die Probe mit sterilem demineralisiertem H 2 O als positive Wachstumskontrolle inkubiert.</li><li> Abhängig von dem Mikroorganismus, verwenden Sie den entsprechenden negativen Wachstumskontrolle: <ul><li> Gram-negative Stäbchen Probe mit einer Mischung aus Antibiotika inkubiert </li><li> Enterococcus spp. Probe bei 4 ° C gelagert </li><li> S. aureus Probe bei 4 ° C gelagert </li></ul></li><li> Bestimmen der Empfindlichkeit (S) oder (R) des Stammes für die getestete Antibiotika wie folgt: <ul><li> Ein CT-Wert höher als der Cut-off-Ct-Wert gibt die Anfälligkeit </li><li> Ein CT-Wert niedriger als der Cut-off-Ct-Wert gibt Widerstand </li></ul></li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Zwei Modell-Organismen, also eine Gram-negativen E. coli und eines Gram-positiven S. aureus, ausgewählt sind, um das kombinierte Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von pathogenen Bakterien und die Bestimmung ihrer antimikrobiellen Profil zu visualisieren. Der erste Teil des Protokolls umfasst die Erreger nachzuweisen. Specific Sonden zum Nachweis von acht klinisch relevanten Mikroorganismen gestalten. In Anwesenheit eines Ziels in der bakteriellen Platte enthalten sind, werden Amplifikationskurven erzeugt und Ct-Werte berechnet werden (Abb. 2). Die Cut-Off-Wert, um ein PCR-Ergebnis als positiv angesehen, um ein CT-Wert von 35 eingestellt. In 2A ist die Identifizierung Profil eines E. coli-infizierten Blutkultur gezeigt. Die 16S-Universal-Sonde wird in zwei getrennten Reaktionsmischungen enthalten und folglich generiert zwei Amplifikationskurven (Ct von 25,20 und 25,95). Das dritte Signal wird von der Sonde spezifisch für E. abgeleitet coli (Ct von 27,04). Die Identifizierung eines S. aureus-infizierten Blut Kultur wird in 2B gezeigt. Die 16S universellen Sonde hat Amplifikationssignale von 33,35 und 33,71. Die beiden verbleibenden Signale von den Sonden, die spezifisch für Staphylococcus spp. und S. aureus (Ct von 32,48 und 30,59). Abbildung 3 ist ein Beispiel einer Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung Amplifikationsplot, als Vertreter der E. coli-Stamm, der auch gezeigt wurde in 2A. Jede Zeile steht für ein Antibiotikum, dass die Probe mit Bakterien inkubiert wurde. Eine Probe mit einer niedrigen Ct-Wert ist ein Beispiel, in dem Wachstum in Gegenwart eines Antibiotikums, der angibt, Resistenz gegen Antibiotika der getesteten aufgetreten ist. Im Gegenteil, stellt eine hohe Ct-Wert eine Probe, in der kein Wachstum, da der tatsächliche Funktionsweise des Antibiotikums, der angibt, Anfälligkeit für die getesteten Antibiotika aufgetreten ist. Tabelle 1 zeigt die Bestimmung der antimikrobiellen Profil des E. coli und S. aureus-Isolaten. Alle CT-Werte gemeldet werden und, nach den Formeln in der Protokoll-Text (7,1) erwähnt, zwei Cut-off-Ct-Werte sind errechnetlated zwischen Resistenz und Empfänglichkeit zu unterscheiden. Der Stamm ist resistent gegen das Antibiotikum wenn die gemeldete Ct-Wert niedriger ist als die berechnete Hell-Dunkel-Ct-Wert (und umgekehrt). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ablaufschema Identifikation des Erregers und Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika Testverfahren mittels real-time PCR-16S rDNA. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig2.jpg" /> 2 Identifizierung Assay. Amplifikationskurven und Zyklus Schwellenwerte (Ct-Werte) Eine positive Blutkultur, durch die allgemeine 16S rDNA-Sonde detektiert, während die spezifischen Sonden zur Identifizierung des ursächlichen Erreger verwendet werden.. A. Amplifikationsplot der Blutkultur mit E. coli, B. Amplifikationsplot der Blutkultur mit S. aureus, Pseudomonas ae, Pseudomonals aeruginosa; uni, 16S universellen Sonde; Ecoli, Escherichia coli-Sonde; Pseudomonas sp, Pseudomonas spp. Sonde; S. pneu, Streptococcus pneumoniae Sonde; Strep sp, Streptococcus spp. Sonde; Entero, Enterococcus spp. Sonde; S. aureus, Staphylococcus aureus-Sonde; Staph sp, Staphylococcus spp. Sonde. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig3.jpg" /> Abbildung 3. Amplifikationsplot von Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung eines E. coli-Isolat (Probe 1). Jede Kurve stellt ein Antibiotikum, dass der Stamm mit inkubiert. Ein frühes Signal wird durch einen hohen bakteriellen Belastung, so dass der Stamm in Gegenwart der getesteten Antibiotikum enthalten und ist somit gegen das Antibiotikum bedeutet, verursacht. Spät-Signale zeigen an, dass der Stamm nicht in Gegenwart des Antibiotikum enthalten, mit anderen Worten, ist sie anfällig. <table border="1"><tbody&gt; <tr><td> Beispiel 1: E. coli </td><td></td><td></td><td> Beispiel 2: S. aureus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AST </td><td> Ct </td><td> R / S </td><td> AST </td><td> Ct </td><td> R / S </td></tr><tr><td> Amoxicillin 8 mg / L </td><td> 16,83 </td><td> R </td><td> Amoxicillin 0,25 mg / L </td><td> 21,03 </td><td> R </td></tr><tr><td> Amoxicillin-Clavulansäure 4.8 mg / L </td><td> 17,36 </td><td> R </td><td> Oxacillin 2 mg / l </td><td> 25,80 </td><td> S </td></tr><tr><td> Piperacillin 16 mg / L </td><td> 16,67 </td><td> R </td><td> Vancomycin 2 mg / l </td><td> 25,20 </td><td> S </td></tr><tr><td> Piperacillin-Tazobactam 16 /4 mg / L </td><td> 24,15 </td><td> S </td><td> Gentamicin 4 mg / L </td><td> 25,86 </td><td> S </td></tr><tr><td> Ciprofloxacin 1 mg / l </td><td> 29,72 </td><td> S </td><td> Trimethoprim-Sulfamethoxazol 2/38 mg / L </td><td> 24,62 </td><td> S </td></tr><tr><td> Ceftazidim 1 mg / l </td><td> 24,03 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ceftazidim 8 mg / L </td><td> 26,58 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin 4 mg / L </td><td> 29,83 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trimethoprim-Sulfamethoxazol 2/38 mg / L </td><td> 27,60 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Negativen Wachstumskontrolle (Mischung von Antibiotika) </td><td> 30,41 </td><td></td><td> Negativen Wachstumskontrolle (Probe bei 4 ° C gelagert) </td><td> 27,42 </td><td></td></tr><tr><td> Positive Wachstums-Steuerung </td><td> 16,90 </td><td></td><td> Positive Wachstums-Steuerung </td><td> 20,22 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cut-off-Ct-Wert 1 * </td><td> 21,76 </td><td></td><td> Cut-off-Wert Ct 1 *** </td><td> 23,82 </td><td></td></tr><tr><td> Cut-off-Ct-Wert 2 ** </td><td> 18,75 </td><td></td><td> Cut-off-Wert Ct 2 **** </td><td> 22,02 </td><td></td></tr><tr><td> * Für Amoxicillin, Amoxicillin-Clavulansäure, Ciprofloxacin, gentamicin, Trimethoprim-Sulfamethoxazol ** Für Piperacillin, Piperacillin-Tazobactam, Ceftazidim </td><td></td><td></td><td> *** Für Vancomycin und Gentamicin **** Für Amoxicillin, Oxacillin und Trimethoprim-Sulfamethoxazol </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Bestimmung der Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung der beiden Proben (E. coli und S. aureus). Ct-Werte der PCR-Assays wurden an diesem Excel-Datei kopiert, als denen kann berechnet automatisch die beiden cut-off Ct erte von der positiven und negativen Wachstumskontrolle, nach den Formeln in der Protokoll-Text angezeigt. Wenn ein Antibiotikum zeigt eine Ct-Wert niedriger als der Hell-Dunkel-Ct-Wert, der Stamm resistent gegen das Antibiotikum ist, wenn der Ct-Wert höher als der Hell-Dunkel, ist der Stamm anfällig.

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die schnelle Identifizierung von Krankheitserregern und bietet eine funktionale antimikrobielle Profil, das auf die frühzeitige Verabreichung von Antibiotika ausreichend verbessert damit die Prognose von Patienten mit Infektionen der Blutbahn führen könnte. Je nach den gewünschten Bedingungen eines Tests, dh niedrige Kosten, hohe Durchsatz, minimal-umdrehen Zeit, Prüfbedingungen eingestellt werden kann. Das gesamte Verfahren kann innerhalb eines Arbeitstages durchgeführt werden. Darüber hinaus können die beiden Teile des Protokolls gleichzeitig durchgeführt werden, die reduziert die Durchlaufzeit deutlich. Wie hier dargestellt, ist die Identifikation Panel eine Auswahl der am meisten klinisch relevanten Bakterien in unserem Krankenhaus. Da der wichtigste Grundsatz zielt auf den 16S-Gen-Region, können spezifische Sonden für andere Mikroorganismen entwickelt und hinzugefügt werden, um den Test. Der komplette Test wurde ursprünglich für die schnelle Analyse von Blutkulturen vorgesehen, kann aber auch für die Verarbeitung von o verwendet werdenther Probenmaterialien. Dies ist auch der Fall bei den Antibiotika, die für Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung verwendet wurden: mehr oder andere Antibiotika können hinzugefügt, basierend auf lokalen Widerstand Mustern und Richtlinien werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Natriumchlorid (NaCl) </td><td> Merck Chemicals </td><td> 106404 </td><td> 0,9% in Wasser </td></tr><tr><td> Vacutainer SST Serumtrennröhrchen 5 ml </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 367986 </td><td></td></tr><tr><td> Mueller-Hinton II Bouillon </td><td> BD Diagnostic Dystems </td><td> 212322 </td><td> 44 g / L in Wasser </td></tr><tr><td> Zentrifugieren ROTIXA 50 RS </td><td> Andreas Hettich GmbH &amp; Co. KG </td><td> 4910 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuge 5415 D </td><td> Eppendorf </td><td> Nicht mehr </td><td></td></tr><tr><td> Grundierungen </td> &lt;td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> na </td><td></td></tr><tr><td> Probes </td><td> Sigma-Aldrich/Applied Biosystems </td><td> na </td><td></td></tr><tr><td> TaqManEnvironmental Master-Mix 2,0 </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4396838 </td><td></td></tr><tr><td> iQ SYBRGreen Supermix </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> 170-8880 </td><td></td></tr><tr><td> MicroAmp Optical 96-Well Drehmomentplatte </td><td> Applied Biosystems </td><td> N8010560 </td><td></td></tr><tr><td> MicroAmp Optical Adhesive Film </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> iQ 96-Well PCR-Platten </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> 223-9441 </td><td></td></tr><tr><td> Microseal B Klebedichtungen </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> MSB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Real-time PCR Detection System </td><td> Applied Biosystems </td><td> ABI PRISM 7900 HT </td><td></td></tr><tr><td> Real-Time PCR Detection System </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> MyiQ einfarbige </td><td></td></tr></tbody></table>

one-day workflow scheme for bacterial pathogen detection and antimicrobial resistance testing from blood cultures

Infektionen der Blutbahn sind mit hohen Sterberaten wegen der wahrscheinlichen Manifestation der Sepsis, schwere Sepsis und septischer Schock 1 zugeordnet. Daher ist die rasche Verabreichung geeignete Antibiotika-Therapie sind von besonderer Bedeutung bei der Behandlung von Infektionen des Blutkreislaufs. Das kritische Element in diesem Prozess ist das Timing, stark abhängig von den Ergebnissen der Identifizierung von Bakterien und Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung. Beide Parameter werden routinemäßig von Kultur-basierte Tests, die zeitaufwendig ist und dauert durchschnittlich 24-48 Stunden 2, 4 erhalten. Das Ziel der Studie war es, DNA-basierter Tests zur raschen Identifizierung von Infektionen des Blutkreislaufes, sowie eine rasche antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung zu entwickeln. Der erste Test ist ein eubakteriellen 16S rDNA-basierten Echtzeit-PCR-Assay mit Art-oder Gattungs-spezifischen Sonden 5 ergänzt. Mit Hilfe dieser Sonden, Gram-negative Bakterien einschliesslich Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosaund Escherichia coli sowie gram-positive Bakterien einschließlich Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp. und Streptococcus pneumoniae unterschieden werden könnten. Mit dieser Multiprobe Assay wurde eine erste Identifizierung des verursachenden Mikroorganismus nach 2 h angegeben. Zweitens haben wir eine semi-molekularen Test zur Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung von S. aureus, Enterococcus spp. und (fakultativ) aerobe Gram-negative Stäbchen 6. Dieser Assay basiert auf einer Studie, in der PCR verwendet, um das Wachstum von Bakterien 7 zu messen beruht. Bakterien direkt aus dem Blut Kulturen geerntet werden für 6 h mit einer Auswahl von Antibiotika inkubiert und im Anschluss an eine Sybr Grün-basierte Echtzeit-PCR-Assay bestimmt Hemmung des Wachstums. Die Kombination dieser beiden Methoden konnte die direkte Wahl einer geeigneten Antibiotika-Therapie am selben Tag (Abbildung 1). Abschließend, Molekulare Analyse sowohl Identifikation und Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika bietet eine schnellere Alternative für den Erregernachweis und könnte die Diagnose von Infektionen der Blutbahn zu verbessern.

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One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Die Konstruktion eines einfachen Ein-Tages-Workflow System für den bakteriellen Erreger-Diagnostik ermöglicht die schnelle Erkennung von Infektionen der Blutbahn. Die Aufnahme von acht klinisch relevanten bakteriellen Ziele und deren Antibiotikaresistenz Profile bietet dem Kliniker einen ersten Einblick am selben Tag, was zu mehr adäquate Therapie führen kann.

Ein-Tages-Workflow-Schema für bakterielles Pathogen-Erkennung und Resistenz gegen antimikrobielle Tests aus Blutkulturen

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

one-day-workflow-scheme-for-bacterial-pathogen-detection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

25.1K Aufrufe.  Maastricht University Medical Center. Die Konstruktion eines einfachen Ein-Tages-Workflow System für den bakteriellen Erreger-Diagnostik ermöglicht die schnelle Erkennung von Infektionen der Blutbahn. Die Aufnahme von acht klinisch relevanten bakteriellen Ziele und deren Antibiotikaresistenz Profile bietet dem Kliniker einen ersten Einblick am selben Tag, was zu mehr adäquate Therapie führen kann.

Serie: One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium. Because resistance to ampicillin and vancomycin in E. faecalis is still uncommon compared to resistance in E. faecium, the development of rapid tests allowing differentiation between enterococcal species is important for appropriate therapy and resistance surveillance. The E. faecalis OE PNA FISH assay (AdvanDx, Woburn, MA) uses species-specific peptide nucleic acid (PNA) probes in a fluorescence in situ hybridization format and offers a time to results of 1.5 hours and the potential of providing important information for species-specific treatment. Multicenter studies were performed to assess the performance of the 1.5 hour E. faecalis/OE PNA FISH procedure compared to the original 2.5 hour assay procedure and to standard bacteriology methods for the identification of enterococci directly from a positive blood culture bottle.

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A rapid protocol for the direct identification of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species from a positive blood culture using a Peptide Nucleic Acid fluorescent in situ hybridization assay (PNA FISH).

Ein 1,5 Stunden-Verfahren für die Identifizierung von Enterococcus Spezies direkt aus Blutkulturen

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

Invasion von menschlichen Zellen durch einen bakteriellen Erreger

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Speichel, Speicheldrüse, und Hämolymphe Abholung Ixodes scapularis Zecken

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in solution, has shown considerable potential in biochemical sensing applications with unprecedented sensitivity and specificity1-5. The drug-target interactions generate surface stress, causing the cantilever to bend, and the signal can be analyzed optically when it is illuminated by a laser. The change in surface stress measured with nano-scale precision allows disruptions of the biomechanics of model bacterial cell wall targets to be tracked in real time. Despite offering considerable advantages, multiple cantilever sensor arrays have never been applied in quantifying drug-target binding interactions.
Here, we report on the use of silicon multiple cantilever arrays coated with alkanethiol self-assembled monolayers mimicking bacterial cell wall matrix to quantitatively study antibiotic binding interactions. To understand the impact of vancomycin on the mechanics of bacterial cell wall structures1,6,7.&#160;We developed a new model1 which proposes that cantilever bending can be described by two independent factors; i) namely a chemical factor, which is given by a classical Langmuir adsorption isotherm, from which we calculate the thermodynamic equilibrium dissociation constant (Kd) and ii) a geometrical factor, essentially a measure of how bacterial peptide receptors are distributed on the cantilever surface. The surface distribution of peptide receptors (p) is used to investigate the dependence of geometry and ligand loading. It is shown that a threshold value of p ~10% is critical to sensing applications. Below which there is no detectable bending signal while above this value, the bending signal increases almost linearly,&#160;revealing that stress is a product of a local chemical binding factor and a geometrical factor combined by the mechanical connectivity of reacted regions and provides a new paradigm for design of powerful agents to combat superbug infections.

Acquired resistance to antibiotics is a major public healthcare problem and is presently ranked by the WHO as one of the greatest threats to human life. Here we describe the use of cantilever technology to quantify antibacterial resistance, critical to the discovery of novel and powerful agents against multidrug resistant bacteria.

Nanomechanics von Drug-Target-Interaktionen und Antibakterielle Widerstand Erkennung

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

Multiplex PCR Assay f

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

Vorbereitung einer Blutkultur Pellet Rapid Identifizierung von Bakterien und Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Loop-vermittelte isothermen Amplifikation (LAMP) Assays für die artspezifischen Nachweis von<em&gt; Eimeria</em&gt;, Die Hühner infizieren

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.