Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, sekundäre bakterielle Lungenentzündung Studien zu verbessern, indem ein einfacher und nicht-invasiver Weg der bakteriellen Impfung in die unteren Atemwege gefolgt von bakteriellen Erholung und Reinigung der RNA für die Transkriptanalyse. Dies wird erreicht, indem zuerst eine Maus tief anästhesiert und eine vorgespannte stumpfgekippte gebogene Nadel in die Luftröhre einer Maus eingesetzt wird, die vertikal von den Kieferschneidezähnen aufgehängt wurde. Zweitens werden nach erfolgreicher Infektion bakterielle koloniebildende Einheiten durch Exzision und Homogenisierung der Lunge wiederhergestellt.
Das resultierende Lungenhomogenat wird seriell verdünnt und auf Nährstoffagar plattiert, um koloniebildende Einheiten aufzuzählen. Schließlich wird die RNA aus dem Lungenhomogenat gereinigt. Der Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es eine kontrollierte Abgabe direkt in die unteren Atemwege ermöglicht.
Dies ermöglicht es uns, sowohl die kombinatorischen als auch die individuellen Beiträge des Erregers zum Ausgang der Krankheit zu betrachten. Jüngste Fortschritte in diesem Bereich haben gezeigt, dass die bakterielle Genregulation eine große Rolle bei der Bestimmung des Infektionsergebnisses spielen kann. Diese Technik profitiert von der Fähigkeit, sowohl bakterielle KBE als auch RNA zurückzugewinnen.
Sobald die RNA isoliert ist, können wir die Beiträge spezifischer Virulenzgene zur Infektion bewerten. Darüber hinaus profitiert diese Technik davon, nicht chirurgisch zu sein. Dies ermöglicht eine minimale Belastung für alle Tiere, die in diesem Verfahren verwendet werden, und ermöglicht ihnen eine sofortige Genesung.
Dieses Verfahren profitiert von der Verwendung gängiger Laborgeräte ohne den Einsatz von Kanülen, Führungsdrähten oder Glasfaserkabeln jeglicher Art. Personen, die neu in dieser Technik können zunächst mit der tatsächlichen Installation durch die Luftröhre zu kämpfen. Sobald diese Technik konzeptioniert ist, wird es ein einfaches und effektives Verfahren, um sekundäre bakterielle Lungenentzündung innerhalb eines murinen Wirts zu verhören.
Vor Beginn des Verfahrens bereiten Sie den Arbeitsbereich mit folgenden Vorräten vor: eine Intubationsplattform, eine sterile Ein-ml-Spritze, sterile stumpfe Zangen, sterile 21-Spur-Stumpfnadel und zwei konische Schläuche zur Aufbewahrung der Spritze und der Zange. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie den Erreger inoculums so vorbereiten, dass die gewünschte Endkonzentration in einem Volumen von 50 Mikrolitern erreicht wird. Mit sterilen Handschuhen bereiten Sie eine ein bis 1,5 Zoll 21-Spur stumpf-spitzen Nadel vor, indem Sie sie auf einen ungefähr 35-Grad-Winkel biegen.
Nach der Befestigung der Nadel an der Spritze, ziehen Sie ein 100 Mikroliter Luftkissen, gefolgt von 50 Mikroliter des Infektionserregers. Das 100-Mikroliter-Luftkissen sorgt für die vollständige Abgabe der Pathogenlast, sobald die Spritze gedrückt ist. Legen Sie die geladene Nadel und Spritze an einer Stelle, die von der dominanten Hand leicht zugänglich ist.
Entfernen und beäschen Sie die Maus aus der Anästhesiekammer und hängen Sie die Maus auf der Intubationsplattform von den Kieferschneidezähnen aus. Mit den stumpfgekippten Zangen, sanft greifen und verlängern Sie die Zunge. Übertragen Sie die Zunge von der Zange in den Daumen und Zeigefinger der nicht dominanten Hand.
Halten Sie die Zunge in der nicht dominanten Hand und nehmen Sie die vorinstallierte Spritze auf. Zeigen Sie das gebogene Ende der Nadel vom Körper weg. Setzen Sie die Nadel in die Mundhöhle ein.
An der Basis der Zunge sanft winkeln das Handgelenk, um einen leichten Druck der Nadel weg vom Körper zu verursachen. Diese Aktion stellt sicher, dass die Nadel in die Luftröhre und nicht in die Speiseröhre eingeführt wird. Führen Sie die Nadel langsam in die Luftröhre.
Oft wird eine leichte Zecke gefühlt, wenn die Nadel durch die Stimmfalte geht. Passieren Sie die Nadel durch die Luftröhre, bis ein leichter Widerstand zu spüren ist, wenn die Nadel auf die Karina trifft. Heben Sie die Nadel leicht nach oben, um die Nadel über der Karina aufzuhängen.
Dies ermöglicht die Abgabe in die primäre Bronchi. Drücken Sie den Spritzenkolben vollständig, um die infektiöse Last zu liefern. Entfernen Sie die Nadel aus der Luftröhre und entsorgen Sie sie.
Entfernen Sie die Maus von der Intubationsplattform, indem Sie das Gummiband drücken, halten Sie die Maus jedoch in der aufrechten Position. Versperren Sie die Nasenwege, indem Sie einen Finger direkt über die Nares legen. Halten Sie diese Position für etwa eine Minute oder bis mehrere tiefe Atemzüge beobachtet werden.
Dieser letzte Schritt stellt sicher, dass das gesamte Inokulumvolumen in die unteren Atemwege abgegeben wird. Bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück und stellen Sie sicher, dass es eine schnelle Genesung von der Anästhesie gibt. Zu ausgewählten Zeitpunkten nach der Infektion kann die infizierte Lunge ausgeschnitten werden, um die bakteriellen Beiträge zu den erhöhten Morbiditäten im Zusammenhang mit einer sekundären bakteriellen Lungenentzündung zu quantifizieren und zu bewerten.
Bereiten Sie einen Arbeitsbereich mit den folgenden Gegenständen vor: ein Waagen- und steriles Wägeboot, eine Sezierplattform, ein Sezierset mit Schere und Zange sowie sterile Gaze. Für die Zwecke dieser Demonstration wird die Exzision der Lunge auf einer Bankplatte durchgeführt. Um die Sterilität während dieses Verfahrens aufrechtzuerhalten, wird jedoch empfohlen, die Lungenexzision innerhalb einer laminaren Durchflusshaube durchzuführen.
Euthanisieren Sie eine infizierte Maus mit CO2 oder einer ähnlichen IACUC-zugelassenen Methode der Euthanasie. Platzieren und sichern Sie die infizierte Maus auf der Sezierplattform. Sprühen Sie die Maus mit Ethanol, um die Sterilität auf den Arbeitsflächen zu erhalten.
Beginnend am Nabel, verwenden Sie ein Paar Zange, um die Haut zu heben und einen Schnitt in Richtung des Kehlkopfes zu machen. Greifen Sie die Haut auf beiden Seiten des anfänglichen Schnitts, ziehen Sie die Haut weg vom Körper und schneiden Sie die Gewebeverbindungen. Es kann hilfreich sein, seitliche Schnitte über die Haut zu machen, um mehr von der Brustregion zu offenbaren.
Beginnend an der Basis des xiphoiden Prozesses, machen Sie einen kleinen Schnitt mit der Absicht, das Zwerchfell zu punktieren. Dies führt zu einer Erhöhung des Drucks in der Brusthöhle, wodurch sich die Lunge zurückzieht. Wenn die Lunge zurückgezogen wird, setzen Sie den Schnitt fort, um das Zwerchfell zu befreien.
Entfernen Sie die Rippen, indem Sie einen Schnitt auf beiden Seiten machen. Dadurch werden die Brusthöhle und die Lunge freizulegen. Um die Lunge zu verbrauchen, greifen Sie die Basis des Herzens mit der Zange und heben Sie nach oben.
Legen Sie die Schere hinter die Lunge und beginnen Sie, kleine Schnitte durch die Gewebeverbindungen zu machen, während Sie das Herz weiter nach oben heben. Sobald die Lunge ausgeschnitten wurde, legen Sie sie auf eine sterile Gaze und entfernen Sie das Herz, indem Sie es von der Lunge wegheben und die restlichen Gewebeverbindungen schneiden. Übertragen Sie die Lunge auf das vorgetete Wägeboot und zeichnen Sie die Masse auf.
Nachdem die Lunge gewogen wurde, übertragen Sie die Lunge in sterile Phosphat-gepufferte Saline und lagern Sie sie vorübergehend auf Eis. Nun, da die Lunge ausgeschnitten und gewogen wurde, können die Bakterien zurückgewonnen werden, um ihre Rolle für die Pathogenese zu bestimmen. Zur Vorbereitung auf die bakterielle Rückgewinnung werden folgende Vorräte benötigt: ein Gewebeschleifer, sterile RNase-freie PBS, Puffer RLT, ergänzt mit Beta-Mercaptoethanol, und 1,5 ml RNase-freie Mikrozentrifugenröhren.
Beginnen Sie, indem Sie zuerst ein ml steriles RNase-freies PBS zum Gewebeschleifer hinzufügen. Nach dem Befüllen die Gewebemühle auf Eis aufbewahren. Als nächstes bereiten Sie eine Reihe von sterilen RNase-freien seriellen Verdünnungsröhrchen vor, um die bakterielle Belastung zu quantifizieren, die aus der infizierten Lunge gewonnen wurde.
Übertragen Sie die Lunge in den vorbereiteten Gewebeschleifer und homogenisieren Sie das Gewebe gründlich, indem Sie beim Drehen auf den Sockel drücken. Öffnen Sie den Gewebeschleifer und aliquot 100 Mikroliter der homogenisierten Probe in die erste der vorbereiteten seriellen Verdünnungsrrohre. Die Proben und die Platte auf dem Nährwertagar seriell verdünnen, um die koloniebildenden Einheiten aufzuzählen.
KBE kann als KBE pro ml oder KBE pro ml, pro Milligramm Lungengewebe aufgezeichnet werden. Nachdem der 100-Mikroliter-Aliquot entfernt wurde, ersetzen Sie den Mahlsockel und zentrieren Sie die Probe bei 4.000 U/min für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie den Überstand aus der pelletierten Probe.
Der Überstand kann bei minus 80 Grad Celsius gespeichert und gespeichert werden, um ihn zu einem späteren Zeitpunkt weiter zu analysieren. Das homogenisierte Gewebepellet in 700 Mikroliter RLT Beta-Mercaptoethanol wieder aufhängen und die Probe in ein steriles RNase-freies 1,5 ml Zentrifugenrohr übertragen. An dieser Stelle kann die Probe bei minus 80 Grad gelagert werden.
Die RNA kann aus der RLT-Lungenhomogenatschlämme gereinigt werden, indem die Probe in ein zwei ml Mikrozentrifugenrohr geladen wird, das 1 Millimeter Kieselsäureperlen enthält und 20 Sekunden lang mit sechs Metern pro Sekunde über einen Perlenschlag verarbeitet wird. Die RNA wird dann sofort mit einer Anpassung der RNeasy-Methode gereinigt, wie in Voyich, et al. berichtet. Methods in Molecular Biology"2008, beschrieben in dem Manuskript, das diesem Video beiliegt.
Nach der Reinigung kann die RNA-Ausbeute mit einem Spektralphotometer quantifiziert werden. Einmal quantifiziert, ist es vorteilhaft, die resultierende RNA in mehrere Aliquots von 50 Nanogramm pro Mikroliter zu verdünnen. Dadurch kann die RNA aus der Probe für mehrere Analysen verwendet werden, ohne mehreren Gefrier-Tau-Zyklen ausgesetzt zu sein.
Der Einsatz dieser Technik ermöglicht den Einbau einer kontrollierten Pathogenbelastung direkt in die unteren Atemwege. Die Effizienz dieses Liefersystems kann durch die Installation einer 1%Coomassie brilliant blue Lösung demonstriert werden. In der oberen Reihe wird ein Paar nicht infizierter Lungen angezeigt, die als Kontrolle dienen sollen, während in der unteren Reihe ein Lungenpaar angezeigt wird, das durch eine intratracheale Installation 50 Mikroliter des brillanten blauen Farbstoffs 1%Coomassie erhalten hat.
Die Verwendung dieses Farbstoffs zeigt, wie die intratracheale Installation eine gleichmäßige Verteilung der Pathogenbelastung in und über die linke und rechte Lunge ermöglicht. Nach der Infektion kann die Pathogenlast durch Exzision und Homogenisierung des Lungengewebes zu verschiedenen Zeitpunkten nach der intratrachealen Installation zurückgewonnen und analysiert werden. Um die Effizienz dieser Wiederherstellungstechnik zu demonstrieren, wurden zwei Gruppen mit je drei Mäusen mit einer niedrigen und hohen Dosis Staphylococcus aureus infiziert.
Der bakterielle Input wurde auf Nährstoffagar plattiert, um KBE aufzuzählen. Eine Stunde nach der intratrachealen Installation wurden die Mäuse eingeschläfert, die Lunge ausgeschnitten und in einem Gewebeschleifer homogenisiert. Das homogenisierte Gewebe wurde seriell verdünnt und auf Nährstoffagar plattiert, um KBE aufzuzählen.
Die aus dem homogenisierten Lungengewebe isolierte RNA kann mittels Reverse-Transkriptase PCR untersucht und zur Quantifizierung der relativen Transkriptsfülle von Zielgenen verwendet werden. Um eine minimale DNA-Kontamination im Hintergrund zu gewährleisten, wird empfohlen, eine PCR-Reaktion ohne Zugabe von Reverse-Transkriptase neben qRT-PCR-Reaktionen durchzuführen. Neben bakteriellen Belastungen kann diese Technik auch auf die Installation und Isolierung viraler Belastungen ausgedehnt werden.
Nach der Homogenisierung des Lungengewebes kann virale RNA isoliert und verwendet werden, um die Transkriptreichtum viraler Gene zu messen oder eine Standardkurve für die virale Quantifizierung zu konstruieren. Der Einsatz dieses Systems bietet ein hocheffizientes und reproduzierbares System zur Untersuchung der sekundären bakteriellen Lungenentzündung. Nach der Beherrschung kann dieses Verfahren in groß angelegten Experimenten eingesetzt werden.
In Chargen arbeiten, um Mäuse einzuschläfern, kann die intratracheale Installation innerhalb von 30 Sekunden pro Maus auftreten. Nachdem dies abgeschlossen ist, über die Exzision der Lunge, kann dies in etwa zwei bis drei Minuten pro Maus abgeschlossen werden. Während die hier diskutierten Methoden im Rahmen einer sekundären bakteriellen Infektion waren, können sie auf jedes Verfahren ausgedehnt werden, bei dem eine kontrollierte Abgabe und Wiederherstellung eines Inokulums erforderlich ist.
Zusätzlich zu den hier beschriebenen Methoden kann dieses Verfahren durch die Zugabe einer bronchoalveolaren Spülung vor der Exzision der Lunge ergänzt werden. Während dies oft zu einer verminderten Erholung der Krankheitserregerlast führt, profitiert es von der Beschaffung von Daten, wie Zytokin-Analyse, Laktat-Dehydrogenase-Aktivität, und die Identifizierung von verschiedenen Zellpopulationen. Um ein vollständigeres Verständnis der Krankheitspathogenese zu gewinnen, wird es wichtig, sowohl wirtliche als auch pathogene Beiträge zur Krankheit zu befragen.
Der Zweck dieses Videos war es, eine einfache und effiziente Methode zur Erforschung der sekundären bakteriellen Lungenentzündung innerhalb eines murinen Wirts bereitzustellen.
